Ujcm - Facisa - Manual de Prácticas de Bioquimica

Universidad José Carlos Mariátegui Valeriano-Zapana, J.A.
PRIMERA EDICION
Valeriano Zapana, J.A. Manual de–prácticas

Prof. Valeriano Zapana, J.A.
de Bioquímica
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UNIVERSIDAD JOSÉ CARLOS MARIATEGUI
DATOS PERSONALES
ESCUELA PROFESIONAL: ___________________________________________________________

NOMBRE Y APELLIDOS: _____________________________________________________________
GRUPO: ___________________________________________________________________________
Valeriano Zapana, J.A. Manual de prácticas de Bioquímica

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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUIMICA
Autores: Mgr. Blgo. José Antonio Valeriano Zapana

Universidad José Carlos Mariátegui
Facultad de Ciencias de la Salud
2019
p. 161
Complemento práctico del Curso Bioquímica

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INDICE
Pag.
PRÁCTICA 01: GENERALIDADES: NORMAS DE BIOSEGURIDAD ..................................................................9

PRÁCTICA 02: MATERIALES DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA ...............................................................20
PRACTICA 03: PH Y SOLUCIONES AMORTIGUADORAS .............................................................................35
PRÁCTICA 04: ESPECTROFOTOMETRIA ...................................................................................................62
PRÁCTICA 05: RECONOCIMIENTO DE ELEMENTOS BIOGENESICOS Y CONSTITUYENTES MINERALES .....77
PRÁCTICA 06: RECONOCIMIENTO DE BIOMOLECULAS ORGANICAS .........................................................84
PRACTICA 07: CARACTERIZACION DE AMINOACIDOS ..............................................................................93
PRÁCTICA 08: CARACTERIZACION Y CUANTIFICACION DE PROTEINAS I ................................................ 106
PRACTICA 09: CARACTERIZACION Y CUANTIFICACION DE PROTEINAS II ............................................... 109
PRÁCTICA 10: ESTUDIO DE LOS PRINCIPALES FACTORES CINETICOS DE LA FOSFATASA ACIDA DE
QUINUA ........................................................................................................................................................................... 112
PRÁCTICA 11: CICLO DE KREBS: ESTUDIO DE LA ACCION ENZIMATICA DE LA SUCCINATO
DESHIDROGENASA ....................................................................................................................................................... 117
PRÁCTICA 12. HIDRÓLISIS DE CARBOHIDRATOS ................................................................................... 120
PRÁCTICA 13: HIDROLISIS DE TRIGLICERIDOS POR LIPASA PANCREATICA ........................................... 125
PRÁCTICA 14: CARACTERIZACION Y CUANTIFICACION DE CARBOHIDRATOS ........................................ 128
PRÁCTICA 15: ANÁLISIS DE LIPIDOS ...................................................................................................... 134
PRÁCTICA 16. LAS RUTAS METABÓLICAS .............................................................................................. 138
PRACTICA 17: EXTRACCION E IDENTIFICACION DE DNA ........................................................................ 146
ANEXOS ................................................................................................................................................ 150
CASO 1: CÓLERA................................................................................................................................... 150
CASO 2: OCLUSIÓN INTESTINAL. ACIDOSIS METABÓLICA. DESHIDRATACIÓN GRAVE ............................ 151
CASO 3: HIPOGLUCEMIA SECUNDARIA A INTOXICACIÓN ALCOHÓLICA .................................................. 152
CASO 4: CETOSIS POR INANICIÓN OBESIDAD ........................................................................................ 153
CASO 5: HIPERCOLESTEROLEMIA Y ATEROSCLEROSIS ........................................................................ 154

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PRESENTACIÓN
El presente manual de prácticas del laboratorio de Bioquímica puede ser utilizado como material
complementario para el desarrollo de la teoría de Bioquímica que se imparte en todas las escuelas de la
Facultad de Ciencias de la Salud de nuestra Universidad José Carlos Mariátegui, tiene como objetivo
familiarizar al estudiante con los principios básicos de la bioquímica y su relación en la fisiología humana
mediante el desarrollo de metodologías analíticas que involucran el manejo de equipos y preparación de
sustancias químicas. Generando de esta manera en el estudiante una experiencia personal en el desarrollo
del método científico y por consiguiente seguir estimulando su interés por esta rama de la ciencia, para
lograr este objetivo es necesario que el estudiante tenga presente lo siguiente:
 Qué debe leer las practicas propuestas antes de realizarlos, poniendo énfasis a la introducción que se
propone en cada uno de las practicas.
 Qué debe recurrir a sus libros de consulta, internet (paginas como la que propone el CONCYTEC en
su biblioteca virtual), normas técnicas, instructivos de funcionamiento, etc., para aclarar dudas y
comprender el fundamento de cada práctica.
 Qué debe realizar su practicas guardo un criterio lógico e interpretativo, buscando argumentos que
permitan discutir su resultados.
 Qué debe entender que la parte básica y el principio permite modificar algunos protocolos establecidos
en este manual de prácticas.
 Qué debe anotar sus observaciones y buscar la explicación científica, validada de fuentes científicas.
Cada una de las prácticas contiene la metodología necesaria para el desarrollo y el cumplimiento de los
objetivos, así como los antecedentes teóricos presentes en la introducción, necesarios para la comprensión
de cada una de las prácticas y poder reforzar los aspectos teóricos del curso.
En el caso de algunos aspectos teóricos complejos, éstos pueden ser aclarados a través de la lectura
suplementaria de la bibliografía recomendada al final del presente manual o bien la bibliografía consultada
por cada uno de los alumnos.
El manual está integrado por prácticas representativas y secuenciales de las unidades del curso teórico.
Los criterios que se tomaron en cuenta para seleccionar el material incluido en este manual fueron:
 Que el experimento ilustrara un principio fundamental teórico para relacionar con otras ramas como la
Microbiología, Biología Molecular, Biotecnología y otras a fines al campo de las Ciencias de la Salud.
 Que conozca la importancia de la Biología y la Química en la explicación de algunos fenómenos que
se presentan en la vida cotidiana
 Que fuera lo más simple posible permitiendo al alumno llevarlo a cabo en un tiempo de 2 h académicas
Esta primera edición del Manual de Bioquímica no pretende ser definitiva, si no ser objeto de revisiones y
mejoras sistemáticas por parte de los miembros de la Academia de Bioquímica, este Manual no sustituye
a la participación y guía de los profesores en el desarrollo experimental, ni a la discusión de los resultados
obtenidos.
Agradecimientos a mis profesores, amigos y colegas al Prof. Dr. Luis Alberto Ponce Soto (UNSA-PERU),
al Prof. Dr. Ronal Navarro Oviedo (UNSA-PERU) y al Prof. Sergio Marangoni (UNICAMP-BRASIL)

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Moquegua, abril del 2019
NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

Cada laboratorio debería tener un código profesional. Habitualmente este identificara al supervisor
del laboratorio como la persona responsable de la seguridad de los individuos que se encuentra en el
laboratorio. El termino supervisor se orientara la papel que cumple el docente dentro del laboratorio Por lo
tanto tomara las decisiones en asuntos tales como si la capacitación la conducta el comportamiento de los
alumnos dentro del laboratorio o al mantenimiento de un entorno seguro dentro del mismo. Se confía en un
comportamiento responsable. Pero si este no fuera el caso el docente tendrá que imponer la disciplina.
Las medidas de Seguridad en Laboratorios son un conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger
la salud de los que allí se desempeñan frente a los riesgos propios derivados de la actividad, para evitar
accidentes y contaminaciones tanto dentro de su ámbito de trabajo, como hacia el exterior. Las reglas
básicas aquí indicadas son un conjunto de prácticas de sentido común realizadas en forma rutinaria.
Código de manejo dentro del laboratorio de Bioquímica
a) El uso del mandil (bata) es obligatorio.

b) Antes de empezar el trabajo en el laboratorio tienes que familiarizarte con los elementos de
seguridad disponibles.
c) Es necesario localizar las salidas principales y de emergencia por si se diese el caso de una
evacuación por fuego o por cualquier otro incidente, así como conocer la localización exacta de
extintores, duchas de seguridad y duchas de ojos.
d) En el laboratorio no está permitido la comida, la bebida ni el tabaco.
e) Todas las disoluciones de reactivos deben estar claramente etiquetados con nombre y la
concentración del reactivo y el nombre de la persona responsable.
f) La transferencia de pipeta se den realizar utilizando peras de gomas o pipetas automáticas, nunca
aspirando con la boca.
g) Se deben limpiar todos los derrames, así como secar los pavimentos húmedos inmediatamente
h) Sólo los residuos solubles en agua y baja toxicidad se pueden verter por la fregadera (arrastrándola
con cantidades copiosas de agua) para su desecho el resto de los desperdicios químicos se deben
guardar en botellas para residuos.
i) Los disolventes clorados no se deben nunca mezclar con otros disolventes ser añadido a los mismos
j) Lávese las manos antes de abandonar el laboratorio.
k) Si un producto químico te salpica los ojos, utiliza inmediatamente una ducha de ojos y lava
completamente el ojo afectado durante 15 minutos sin interrupción. Actúa siempre con urgencia, en
menos de 10 segundos. No dirijas una corriente de alta presión de agua de un grifo directamente al
ojo porque podrías lesionarlo. Informa al encargado del laboratorio de lo que ha sucedido y si es
necesario pide asistencia médica.
l) El uso de bata (preferentemente de algodón) es obligatorio, ya que por mucho cuidado que se tenga
al trabajar, las salpicaduras de productos químicos son inevitables.
m) Así mismo se recomienda llevar zapatos cerrados y no sandalias.
n) Los recipientes del laboratorio nunca deben utilizarse para el consumo y conservación de alimentos
y bebidas; tampoco las neveras u otras instalaciones destinadas al empleo en los laboratorios.
o) Lavarse siempre las manos después de hacer cualquier análisis y antes de salir del laboratorio.
p) Procure quitarse la bata hasta que salga del laboratorio.
q) Cerrar herméticamente los frascos de productos químicos después de utilizarlos.
r) Cuando caliente tubos de ensaye hágalo siempre en la parte superior del líquido y con agitación
suave, nunca por el fondo del tubo, y debe estar inclinado y no apuntar hacia ninguna persona.

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s) No deben transportarse innecesariamente los reactivos de un sitio para otro del laboratorio. Si
tuviese que hacerlo, tenga cuidado con las botellas, las cuales deben ser siempre transportadas
cogiéndolas por el fondo, nunca por la boca de la botella.
t) El área de trabajo tiene que mantenerse siempre limpia y ordenada, sin libros, abrigos, bolsas,
productos químicos vertidos.
u) La conducta en el laboratorio debe ser seria, sin bromas, sin correr, jugar, empujar, gritar, etc.
v) No se puede hacer ningún experimento no autorizado.
w) No utilices nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento.
x) No utilices material de cristal en mal estado ya que aumenta el riesgo de accidentes.
y) El material y los aparatos utilizados tienen que dejarse siempre limpios y en perfecto estado de uso.
z) Todos los productos químicos tienen que ser manejados con mucho cuidado de acuerdo con las
Hojas de Seguridad de cada una de las sustancias.
1. MEDIDAS GENERALES EN CASO DE ACCIDENTE
2.1 PLAN GENERAL DE EMERGENCIA:

• Dar la alarma.
• Ponerse a salvo.
• Ayudar a las personas.
• Luchar contra el fuego.
• Avisar al responsable del departamento.
• Evacuación del edificio en caso necesario.
• Avisar a ambulancias, bomberos.
2.2 QUEMADURAS:
• Las pequeñas quemaduras producidas por material caliente, baños, placas, etc., se tratarán
lavando la zona afectada con agua fría durante 10-15 minutos.
• Las quemaduras más graves requieren atención médica inmediata.
• No utilices cremas y pomadas grasas en las quemaduras graves.
2.3 FUEGO EN EL LABORATORIO:
• Evacuar el laboratorio, por pequeño que sea el fuego, por la salida principal o por la salida de
emergencia, si la principal está bloqueada.
• Avisar a todos los compañeros de trabajo sin que se extienda el pánico y conservando siempre la
calma.
• Si el fuego es pequeño y localizado, apagarlo utilizando un extintor adecuado, arena o cubriendo
el fuego con un recipiente de tamaño adecuado que lo ahogue.
• Retirar los productos químicos inflamables que estén cerca del fuego. No utilices nunca agua para
extinguir un fuego provocado por la inflamación de un disolvente.
• Para fuegos grandes aislar el fuego, utilizar los extintores adecuados, si el fuego no se puede
controlar rápidamente accionar la alarma de fuego, avisar al servicio de extinción de incendios y
evacuar el edificio.

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2.4 CORTES:
• Los cortes producidos por la rotura de material de cristal son un riesgo común en el laboratorio.
• Las cortadas se tienen que lavar bien, con abundante agua corriente, durante 10 minutos como
mínimo.
• Si la cortada es pequeña y deja de sangrar en poco tiempo, lávala con agua y jabón y tápala con
una venda.
• Si la cortada es grande y no deja de sangrar, requiere de asistencia médica inmediata.
2.5 DERRAME DE PRODUCTOS QUÍMICOS SOBRE LA PIEL:
• Los productos químicos que se hayan vertido sobre la piel han de ser lavados inmediatamente con
agua corriente abundantemente, como mínimo durante 15 minutos.
• Las duchas de seguridad instaladas en los laboratorios serán utilizadas en aquellos casos en que
la zona afectada del cuerpo sea grande y no sea suficiente el lavado en una pila.
• Es necesario sacar toda la ropa contaminada de la persona afectada lo antes posible mientras
esté bajo la ducha.
• Recuerda que la rapidez en el lavado es muy importante para reducir la gravedad y la extensión
de la herida.
• Proporcionar asistencia médica a la persona afectada.
2.6 CORROSIONES EN LA PIEL POR ÁCIDOS Y ÁLCALIS:
• Cuando ocurre una corrosión por ácidos, corta lo más rápidamente posible la ropa, lave con agua
abundantemente la zona afectada, neutralice la acidez con bicarbonato de sodio durante 15-20
minutos, sacar el exceso de pasta formada, seca y cubra la parte afectada con linimento óleo-
calcáreo o parecido.
• Cuando se produce una corrosión por álcalis, lave la zona afectada abundantemente con agua
corriente y aclárala con una disolución de ácido acético al 1%, seca y cubre la zona afectada con
una pomada de ácido tánico.
2.7 CORROSIONES EN LOS OJOS:
• En este caso el tiempo es esencial (menos de 10 segundos), cuanto antes se lave el ojo, menos
grave será el daño producido.
• Lava los dos ojos con agua corriente abundantemente durante 15 minutos como mínimo en una
ducha de ojos, y, si no hay, con un frasco de lavar los ojos.
• Es necesario mantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el lavado debajo
de los párpados.
• Es necesario recibir asistencia médica, por pequeña que parezca la lesión.
2.8 INGESTIÓN DE PRODUCTOS QUÍMICOS:
• Antes de cualquier actuación pide asistencia médica.

• Sí el paciente está inconsciente, ponerlo en posición lateral de seguridad, con la cabeza de lado,
y estirarle la lengua hacia fuera.

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PRÁCTICA 01: GENERALIDADES: NORMAS DE

BIOSEGURIDAD
1. INTRODUCCIÓN
La bioseguridad comprende un conjunto de medidas preventivas, destinadas a mantener el

control de factores de riesgo en el trabajo diario en el laboratorio con énfasis en el manejo
adecuado de agentes biológicos, físicos o químicos, logrando la prevención de impactos
nocivos, asegurando que el desarrollo o producto final de dichos procedimientos no atenten
contra la salud y seguridad de los estudiantes y todo el personal que realice prácticas en el
laboratorio.
Toda muestra, reactivo o material que este en contacto directo con el personal deben ser
considerados como potencialmente infectantes y nocivos y se deben tomar las precauciones
necesarias para prevenir que ocurra algún tipo de accidente.
Según la OMS “Accidente” es todo suceso inesperado que, en forma veloz y repentina,
ocasiona interrupción o interferencia en la tarea, pudiendo ocasionar o no una lesión al
trabajador, pérdidas de material, deterioro del ambiente, pérdida de tiempo, etc. Al estudiar un
accidente se deben valorar todas las etapas:
CAUSA CONSECUENCIAS
ACCIDENTE
2. RIESGO
2.1 RIESGO DE INCENDIO

El laboratorio es un lugar de riesgo potencial alto de incendio debido a la existencia de:
 instalaciones y aparatos eléctricos.
 almacenamiento de líquidos inflamables.
 gases inflamables comprimidos.
 material de plástico (fácilmente combustible, productor de grandes cantidades de
humo y gases tóxicos)
Un programa de lucha contra el fuego debe comprender aspectos de prevención de
manera de evitar que el incendio se produzca; protección, para que una vez iniciado el
fuego se minimicen las consecuencias; y control.

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CLASES DE FUEGO:
CLASE SIMBOLO CARACTERISTICAS FORMAS DE EXTINCION
Triángulo verde letra blanca
Por enfriamiento. Matafuego
Fuegos que se desarrollan sobre
aconsejado: agua muy eficiente,
A combustibles sólidos: madera,
polvo o anhídrido carbónico
papel, tela, goma, plástico, etc.
A relativamente eficiente.
Cuadrado rojo Letra blanca

Por sofocación. Matafuego
Fuego sobre líquidos y gases:
aconsejado: polvo o anhídrido
B B gasolina, solventes, grasas,
carbónico muy eficiente, agua no
pinturas, aceites, ceras, etc.
eficiente.
Círculo azul Letra blanca Con sustancias no conductoras.
Matafuego aconsejado: polvo o
C materiales, equipos o instalaciones
C anhídrido carbónico. AGUA NO
sometidas a corriente eléctrica.
DEBE USARSE.
Estrella amarilla Letra
blanca
La extinción no se realiza con los
agentes convencionales sino con
D metales combustibles: sodio,
polvos especiales para cada uno de
D potasio, magnesio, etc.
ellos.
Pautas básicas para prevenir el riesgo de incendio:

 Los líquidos inflamables deben almacenarse en pequeñas cantidades, en recipientes
seguros y en armarios especiales.
 Cuando se trabaja con líquidos inflamables debe ser en zonas ventiladas y lejos de
cualquier llama o fuente de calor.
 Los recipientes que han contenido material inflamable deben ser lavados
convenientemente antes de eliminarlos.
 No se deben arrojar solventes orgánicos ni líquidos inflamables por el desagüe.
 Nunca se fumará en el laboratorio.
 Se deben revisar periódicamente las instalaciones de gases comprimidos, para detectar
posibles fugas.
 Todo el personal debe conocer las salidas de emergencia y debe ser capaz de alcanzarlas
aún a oscuras.
Reglas elementales de ataque y modo de utilizar el matafuego:

 Ataque el fuego en la dirección del viento.
 Al combatir fuegos en superficies líquidas, comience por la base y parte delantera del
fuego.
 Al combatir en derrames, empiece a extinguir desde arriba hacia abajo.
 Es preferible usar siempre varios extinguidores al mismo tiempo, en vez de emplearlos
uno tras otro.

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 Esté atento a una posible reiniciación del fuego, no abandone el lugar hasta éste quede
completamente apagado.
2.2 RIESGO ELECTRICO
La existencia de este riesgo se debe a la existencia de aparatos eléctricos que pueden ser
causa de accidentes, tanto por acción directa de la electricidad sobre las personas, como
de la posibilidad de originar fuegos y explosiones. Es necesario recordar algunas
definiciones para entender el vocabulario:
a) Electricidad: agente físico que se manifiesta como una diferencia de potencial

eléctrico entre dos puntos de una sustancia, Si estos dos puntos se unen se produce
una circulación de corriente eléctrica.
b) Corriente eléctrica: puede ser de dos tipos:
Continua: tiene intensidad, diferencia de potencial y sentido de circulación
constantes. Alterna: su intensidad, diferencia de potencial y sentido de circulación, varían
en forma periódica regular. Intensidad de corriente: es el número de cargas que circula
por unidad de tiempo, su unidad es el Ampere. Diferencia de potencial: es la diferencia
de nivel eléctrico entre dos puntos de un sistema, es la fuerza impulsora del movimiento
de cargas. La unidad es el voltio. Resistencia: es la dificultad que opone el circuito a la
circulación de corriente, su unidad es el Ohm. De acuerdo a la forma en que afectan el
cuerpo humano, las intensidades de corriente se clasifican en:
-corrientes peligrosas: hasta 25 mA
-corrientes muy peligrosas: desde 25 mA
La resistencia del cuerpo humano depende de los siguientes factores:
Piel: es la superficie de contacto (a menor superficie mayor resistencia), importan también
su humedad (a mayor humedad menor resistencia), su grosor (mayor grosor mayor
resistencia) su temperatura y lesiones (disminuye la resistencia).
Estado general del individuo: el hambre, ser, fatiga, sueño, preocupaciones, etc.
disminuyen la resistencia que presenta el cuerpo.
Entonces, de acuerdo a lo dicho, la severidad del daño dependerá de la cantidad de
corriente recibida, del estado previo del individuo y del tiempo de exposición. Las lesiones
pueden variar, desde una contracción muscular refleja (“quedarse pegado”) con corrientes
menores a 25 mA, quemaduras, paro respiratorio con corrientes entre 25 y 70 mA, paro
cardíaco, fibrilación cardíaca con corrientes del orden de 100 mA, daños al sistema
nervioso y muerte.
Los medios de protección lo constituyen las conexiones a tierra, los transformadores de
seguridad, etc. siendo el medio más idóneo los disyuntores diferenciales.
2.3 RIESGO QUIMICO

Es la posibilidad de sufrir daños a través de un accidente o “reactivo”. Un reactivo es toda
sustancia química que se utiliza para investigar o reconocer otra sustancia, según la
“reacción” que se produzca. Se pueden clasificar en orgánicos o inorgánicos o en
generales y especiales. Existe el riesgo químico en la forma de almacenamiento,
transporte, manipulación y descarte de reactivos.

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Almacenamiento: en términos generales, las drogas deben guardarse en lugares secos,

frescos, protegidos del polvo y la luz. Estos lugares deben preservarse del acceso de
personas ajenas al trabajo específico para evitar accidentes por imprudencia o
desconocimiento.
Transporte: el personal debe estar capacitado acerca de los peligros que poseen los
reactivos que manipula y de cuál es la forma de proceder en casos de derrames o fugas.
Manipulación: existen una serie de normas básicas:
En el lugar de trabajo se deben disponer solo de las disoluciones a utilizar, o bien los
reactivos puros fraccionados en recipientes adecuados.
 No se deben regresar fracciones excedentes de reactivos a los frascos originales.
 Los tapones nunca deben dejarse sobre la mesada.
 Se debe disponer de material absorbente en el lugar de trabajo, para casos de
derrames.
 Cuando se realizan reacciones que produzcan vapores o gases tóxicos, se debe
trabajar bajo campana.
 Nunca se deben oler directamente de la boca del frasco, sino con la mano dirigir los
vapores hacia la nariz.
 Nunca se deben gustar los productos con los que trabaja.
 Los líquidos inflamables no se calientan a la llama directamente, y no se descartan
en las piletas.
 No se deben arrojarse a la pileta ni a papeleros, los restos de sodio o potasio, se
descartan con etanol.
 Nunca se arrojará agua sobre metales alcalinos o fundidos, porque puede producirse
una explosión.
 Cuando se calienten sustancias en tubos de ensayo, dirigir la boca del tubo hacia un
lugar despejado flameando el tubo sobre la llama.
 Los restos de cianuro nunca se arrojarán a la pileta, ya que si hay restos de ácidos
se produciría ácido cianhídrico, gas toxico mortal.
 Al trasvasar reactivos conviene hacerlo con embudos.
 Descarte: cuando se eliminan los reactivos, primero deben inactivarse de manera tal
que no sea peligroso para la comunidad o para el medio ambiente.
Efectos de las sustancias químicas sobre el organismo.

De acuerdo a su peligrosidad los reactivos químicos se clasifican según el siguiente
cuadro:

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Pictograma Clasificación y Precaución
Evitar choque, percusión, fricción, formación de chispas, fuego y acción del calor.
Peróxidos orgánicos, sustancias y mezclas que en contacto con materiales

combustibles pueden llevar a estos a la combustión de explosión.
Evitar cualquier contacto con sustancias inflamables. Peligro de Inflamación.
Evitar cualquier contacto con el cuerpo humano, ya que pueden provocar graves daños
para la salud posiblemente irreversibles y con consecuencias mortales.
Se hace referencia especial a la acción cancerígena, teratógena o riesgos de
alteraciones genéticas.
Evitar contacto con el cuerpo humano, también inhalación de vapores. Posibles daños
para la salud en caso de empleo inadecuado. No se descarta acción cancerígena,
teratógena o riesgos de alteraciones genéticas.
Líquidos con punto de inflamación inferior a 0ºC y punto de ebullición máximo de 35ºC.
Mantener lejos de llamas abiertas, chispas y fuentes de calor
Líquidos con punto de inflamación inferior a 21ºC. Gases licuados con punto de
inflamación a presión normal. Sustancias y mezclas que en contacto con agua y aire
húmedo liberan gases fácilmente inflamables.
Mantener lejos de llamas abiertas, chispas y fuentes de calor.
Destrucción de la piel en su total grosor, en piel sana e intacta.

Evitar contacto con los ojos, la piel y la ropa mediante medidas protectoras especiales.
No inhalar vapores.
Claros daños en los ojos e irritación de la piel, que se mantienen como mínimo 24 hs
posteriores a la acción, o irritación de las vías respiratorias.
Evitar contacto con los ojos, la piel y la ropa mediante medidas protectoras especiales.
No inhalar vapores.
Cabe destacar que los pictogramas se encuentran en todos los rótulos de los reactivos químicos, de allí la
importancia de conocer su significado y las precauciones a tomar en cada caso.
2.4 RIESGO BIOLOGICO
Puede estar dado por agentes biológicos, el cual es definido, como, “cualquier microorganismo
(virus, bacterias, hongos o parásitos), con inclusión de los organismos genéticamente modificados,

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los cultivos celulares o endoparásitos humanos, susceptibles de originar cualquier tipo de

infección, alergia o toxicidad” en trabajadores expuestos.
El riesgo de la actividad está relacionado con el tipo de manipulaciones realizadas con el
microorganismo. Las personas que trabajan en esta área manejan diferentes tipos de muestras
(fluidos biológicos, orina, sangre, suero, tejidos) que pueden estar contaminados con agentes
biológicos, cultivos de células, líquidos bacterianos o cultivos agar y virus. El nivel de riesgo al que
estas personas están expuestas, depende de la naturaleza de la muestra. La sangre, el suero o
las muestras de tejidos, probablemente, contienen una concentración baja de agente infeccioso y
por consiguiente, representan un riesgo pequeño. Los cultivos de bacterias purificados, o los
concentrados de células con virus en soluciones líquidas, tienen un riesgo mucho más alto. Dentro
del laboratorio puede darse la contaminación debido a la formación de aerosoles, la ingestión, la
exposición de las membranas mucosas o la inoculación accidental. Los aerosoles son
considerados el modo de transmisión más peligroso de un agente infeccioso. Los aerosoles
pueden generarse por la manipulación de líquidos, la fragmentación de tejidos, la preparación de
placas con bacterias o el empleo inapropiado de los equipos de laboratorio, que incluye a las
centrifugadoras, o rotura de tubos con cultivos celulares (Collins, 1983).
El control del riesgo se lleva a cabo mediante la adopción de medidas de prevención adecuadas,
tales como:
 Medidas de confinamiento adecuadas.
 Equipos adecuados.
 Reglas de conducta en el laboratorio adecuadas.
 Medidas de protección general y personal adecuadas.
En el siguiente cuadro se resumen las posibles vías de ingreso al organismo, los accidentes más
frecuentes y las precauciones a tomar.
Accidentes más frecuentes Vías de ingreso Precauciones

Evitar producción de aerosoles.
Inhalación de aerosoles RESPIRATORIA Utilizar material de protección
adecuado (barbijos)
Evitar pipetear con la boca.
Ingestión accidental de material biológico. DIGESTIVA Utilizar pro-pipetas o
dispensadores.
Inoculación parenteral de material Evitar contacto directo con el
biológico. material biológico (usar guantes
Herida cortante y contacto directo con el descartables).
CUTÁNEA
material biológico. Correcto manipuleo de animales.
Mordeduras accidentales de animales
infectados o potencialmente peligrosos.
2.5 Normas básicas de higiene y seguridad-Laboratorio de Biología
Las medidas de Seguridad en Laboratorios son un conjunto de medidas preventivas destinadas a

proteger la salud de los que allí se desempeñan frente a los riesgos propios derivados de la actividad, para
evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro de su ámbito de trabajo, como hacia el exterior. Las reglas
básicas aquí indicadas son un conjunto de prácticas de sentido común realizadas en forma rutinaria.
 Durante su estancia en el laboratorio, el alumno deberá utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de
laboratorio y cabello recogido (guardapolvo preferentemente de algodón y de mangas largas, zapatos cerrados,
evitando el uso de accesorios colgantes).

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 No se permitirá comer, beber, fumar o maquillarse. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada
persona es responsable directa de la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes. Al finalizar el
laboratorio los alumnos dejarán todo el material ordenado y limpio.
 Las manos deben lavarse cuidadosamente después de cualquier manipulación de laboratorio y antes de retirarse
del mismo.
 Se deberán utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias químicas o material biológico. Toda
persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberá tocar objetos, ni superficies tales como: celulares,
lapiceros, manijas de cajones o puertas, cuadernos, etc.
 No pipetear con la boca.
 No se permitirá correr en los laboratorios.
 Dado que muchas prácticas requieren el uso de corriente eléctrica, se deberá tener especial cuidado de evitar la
manipulación de elementos húmedos o reactivos inflamables en sus proximidades.
 Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos se utilizarán anteojos de
seguridad, viseras o pantallas faciales y otros dispositivos de protección. Cuando se manipulen productos
químicos que emitan vapores o puedan provocar proyecciones, se evitará el uso de lentes de contacto.
 Se requerirá el uso de mascarillas descartables cuando exista riesgo de producción de aerosoles (mezcla de
partículas en medio líquido) o polvos, durante operaciones de pesada de sustancias tóxicas o biopatógenas,
apertura de recipientes con cultivos después de agitación, etc.
 Se deberá verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender una fuente de ignición. Para
calentamiento, sólo se utilizarán resistencias eléctricas o planchas calefactoras blindadas. Se prestará especial
atención al punto de inflamación y de autoignición del producto.
 El material de vidrio roto no se depositará con los residuos comunes. Será conveniente ubicarlo en cajas
resistentes, envuelto en papel y dentro de bolsas plásticas. El que sea necesario reparar se entregará limpio al
taller.
 Será necesario que todo recipiente que hubiera contenido material inflamable, y deba ser descartado sea vaciado
totalmente, escurrido, enjuagado con un solvente apropiado y luego con agua varias veces.
 Está prohibido descartar líquidos inflamables o tóxicos o corrosivos o material biológico por los desagües de las
piletas, sanitarios o recipientes comunes para residuos.
 Los laboratorios contarán con un botiquín de primeros auxilios con los elementos indispensables para atender
casos de emergencia.
 En el laboratorio sólo podrán estar los alumnos del grupo correspondiente. No se admitirán visitas.
3. Bibliografía
 Manual de bioseguridad en laboratorios de ensayo, biomédicos y clínicos. 2005. Elaborado por Instituto
Nacional de Salud. 3a. ed.-- Lima: Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud.
 Manual de seguridad para investigadores en laboratorios en Biotecnología, recuperado
http://www.juntadeandalucia.es/empleo/anexos/23_1_1.pdf
 Safety in health-care laboratories. Geneva, World Health Organization, 1997, recuperado
http://whqlibdoc.who.int/hq/1997/WHO_LAB_97.1.pdf).
4. Desarrollo de la Actividad
4.1 Objetivos
 Establecer pautas y recomendaciones necesarias en el estudiante sobre las normas de bioseguridad en el

momento de realizar las prácticas de laboratorio de Biología.
 Analizar las normas de Bioseguridad aprobadas por el gobierno peruano e identidades nacionales y
particulares.
 Elaborar e implementar afiches de bioseguridad en el laboratorio de Biología.
4.2 Materiales

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 Afiches
 Cartulina
 Plumones
 Normas de Bioseguridad
 Cinta de embalaje
4.3 Procedimiento
a) Para iniciar las actividades de esta primera práctica se dividirán en 4 grupos conformados por 6 alumnos,
los cuales se repartirán los siguientes temas:
 Bioseguridad
 Niveles de bioseguridad
 Normas establecidas por el gobierno e instituciones privadas.
 Riesgo químico
 Riesgo biológico
 Riesgo eléctrico
b) Cada grupo tendrá que traer información de cada tema, tendrán un tiempo para analizar cada tema y
después de un tiempo determinado cada grupo expondrá el tema respectivo.
c) Al finalizar la práctica cada grupo presentaran un afiche (símbolos y señales de bioseguridad) sobre el tema
tratado.
4.4 Resultados
7.1 Definir los siguientes significados
 Agente biológico:
 Antisépticos:
 Área contaminada:
 Área de tránsito limitado:
 Área de tránsito restringido:
 Bioseguridad:
 Campana de gases:
 Cabina de flujo laminar:
 Cabina de seguridad biológica:
 Daño:
 Esterilización:
 Filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air):
 Peligro biológico:

16
 Sistema HVAC (Heating, Ventilation, and Air Conditioning):
 Sustancia infecciosa:
4.5 Identificar e enumerar los riesgos biológicos
4.6 Identificar e enumerar los riesgos químicos
4.7 Identificar e enumerar los riesgos eléctricos
4.8 Cuestionario:
 ¿Cuáles son los niveles de Bioseguridad? (ANEXAR)
 ¿Por qué es importante seguir los procedimientos de Bioseguridad en el laboratorio?

17
 ¿Qué clase de materiales y reactivos presentan riesgo de alteración en la salud?
 ¿Cuál es el procedimiento a seguir cuando se presenta un accidente en los diferentes riesgos

analizados?
7.7 Discusión
7.8 Conclusiones:
7.9 Bibliografía:

18
EXÁMEN PARCIAL PRÁCTICA N° 1

19
PRÁCTICA 02: MATERIALES DE LABORATORIO DE

BIOQUIMICA
1. INTRODUCCION
Es muy importante que los materiales y equipos de uso común en el laboratorio se identifiquen
por su nombre correcto y uso específico que tiene cada uno, específicamente en nuestras
prácticas de biología, pero más importante es saber manejarlo correctamente en el momento
oportuno, teniendo en cuenta los cuidados y normas especiales para el uso de aquellos que
así lo requieran. Los instrumentos y útiles de laboratorio están constituidos de materiales
diversos y se clasifican de la siguiente manera:
2. CLASIFICACION
De acuerdo a su constitución
 Material de vidrio
 Material de goma
 Material de metal
 Material de madera
De acuerdo a su capacidad para medir volúmenes
 Volumétricos
 No volumétricos
3. Material de vidrio
Este rubro constituye la mayor parte de los elementos de un laboratorio, debiendo reunir ciertas
propiedades de resistencia. El vidrio es una mezcla de silicatos y existen variedades con mayor
o menor termorresistencia, con diferentes proporciones de óxidos en su composición
(termorresistencia se refiere a la capacidad que poseen para soportar elevadas temperaturas).
Este tipo de vidrio se denomina termorresistente; existe otra variedad llamada "vidrio blanco" o
termofusible, el cual es maleable a temperaturas más bajas.
Sus composiciones aproximadas en porcentajes de óxidos son las siguientes
Oxido Formula Termofusible Termorresistente
Óxido de silicio SiO2 75 80
Óxido de Sodio Na2O 15 0.4
Óxido de Boro B2O3 - 12
Óxido de Aluminio Al2O3 2 3
Óxido de Calcio CaO 8 0.4
Óxido de Potasio K2O - 0.6
Como se puede apreciar, los vidrios termorresistentes son mezclas poliméricas de boratos (BO-3)
y silicatos (SiO-4), los cuales se encuentran eslabonados (unidos) tridimensionalmente en forma
desordenada (ya que se considera un líquido enfriado hasta solidificar, sin cristalizar). Estos vidrios
resistentes a altas temperaturas (500°C) tienen muy bajo contenido en álcalis, son neutros, de
muy baja solubilidad y bajo coeficiente de dilatación (resistentes a roturas por cambios térmicos
bruscos) y son incoloros.

20
Solo son atacados por los ácidos fluorhídrico y fosfórico concentrados y en caliente, y también por
algunos álcalis en las mismas condiciones, como el hidróxido de sodio (NaOH). En general se
utiliza el vidrio PIREX, y otros como el Duran-Jena y Schott-Jena. Se reconocen por inmersión en
una solución con el mismo índice de refracción que ellos poseen (por ejemplo, en soluciones de
tetracloruro de carbono al 51% y benceno al 49%), en las cuales no es posible visualizar sus
bordes. Los vidrios coloreados se obtienen por el agregado de óxidos de distintos metales.
3.1 Limpieza
El material de vidrio debe estar siempre perfectamente limpio, ya que su contaminación puede
conducir a resultados erróneos. En general deben lavarse con detergente y enjuagarse con agua
destilada. En caso de efectuarse pruebas en las que interfiera la presencia de iones (Ca2+, Fe2+,
H2PO4) el lavado debe efectuarse con detergentes no iónicos y enjuagarse una vez con ácido
clorhídrico (HCI) y repetidamente con agua bidestilada o desionizada. Para quitar restos de
material no removible con el procedimiento anterior y la ayuda de cepillos, se pueden utilizar
mezclas químicas más agresivas. Ellas pueden ser soluciones de:
 Dicromato de sodio o potasio (50 g) y ácido sulfúrico (100 ml) en agua (llevando el volumen
final a 1000 ml). Esta mezcla se denomina sulfocrómica.
 Ácido sulfúrico concentrado y ácido nítrico, llamada mezcla sulfonítrica
 Jabón y agua en caliente
 Soluciones de hidróxido de sodio o de potasio
 El material se sumerge en estas soluciones y se deja actuar durante un tiempo variable y
se lava nuevamente.
3.2 Material volumétrico y no volumétrico
Esta clasificación, como su nombre lo indica, se basa en la posibilidad que brindan los diferentes
elementos de vidrio para medir distintos volúmenes de líquidos. El material no volumétrico es de
medidas estándares, pero no calibrado para cuantificar volúmenes exactos.
Materiales volumétricos:
* Probeta * Micropipeta
* Matraz aforado * Pipetas
* Bureta
Material no volumétrico
*Pipeta Pasteur *Tubo de ensayo *Vaso de precipitación

*Embudo *Erlenmeyer *Ampolla de decantación
*Balón *Kitasato *Vidrio de reloj
*Caja de Petri *Frasco gotero *Frasco de reactivos
*Capsula de porcelana *Mortero
Los elementos que se usan en volumetría tienen ciertas características que se describen a
continuación
Graduación
Divisiones representadas por líneas, que abarcan parte o todo del contorno del elemento
volumétrico, y responden a las fracciones del volumen total a medir. Así, una pipeta o una probeta
se pueden encontrar divididas en diez grandes fracciones; entre cada una de estas fracciones se
pueden presentar a su vez diez subdivisiones. Si una probeta contiene un volumen total de 100

21
ml, cada división será equivalente a 10 ml y cada subdivisión a 1 ml. Si se tratara de una pipeta
de 10 ml, cada división sería 1 ml y cada subdivisión 0,1 ml.
Para averiguar los volúmenes correspondientes a las divisiones de materiales graduados se
puede plantear una regla de tres simples:
10 divisiones 10 ml (o 100 ml)
1 división x = 1 ml (o 10 ml)
Esto vale para las divisiones y las subdivisiones
Aforo
Es la marca (línea) que poseen ciertos materiales volumétricos, la cual indica el volumen total que
pueden contener a una temperatura determinada (generalmente a 20° C). Estos datos deben estar
registrados en el recipiente, y se refieren a la "capacidad" del mismo.
Menisco
Este término no indica un elemento del material, sino que corresponde a la forma que adopta la
superficie del líquido contenido en el recipiente, al "mojar" el vidrio, y depende de la mayor o menor
tensión superficial y de si se trata de líquidos polares (como el agua) o no polares (como los
hidrocarburos). Los líquidos polares poseen mayor tensión superficial, lo que limita su capacidad
para "mojar" sólidos o mezclarse con otros líquidos no similares (como el agua y el aceite). El
mercurio (Hg) tiene la tensión superficial más alta de todos los líquidos a temperaturas normales;
por ello, al estar contenidos en un recipiente su superficie está más elevada en la parte central (no
"moja" las paredes).
Enrase
Es el procedimiento por el cual se hace coincidir el menisco con el aforo o línea de graduación
al medir un líquido. Estos elementos deben estar a la altura del ojo del observador teniendo la

22
precaución de apoyar el recipiente sobre una superficie plana horizontal (para las probetas) o de
mantenerlo perpendicular a dicha superficie (para las pipetas).
3.3 Descripción de los materiales de vidrio volumétricos
Probeta
Recipiente cilíndrico graduado, con borde superior terminado en pico de jarra. Posee una base
que puede ser de vidrio, madera o plástico. Para utilizarlas se apoyan sobre las mesadas, se carga
el líquido hasta un volumen ligeramente inferior al requerido, y luego se completa lentamente hasta
enrasar.
Matraz aforado
Recipiente esférico con base plana y cuello generalmente largo, donde se halla el aforo,
aunque puede no estar (puede ser también no volumétrico). De capacidad variable, sirven para
preparar y guardar soluciones. Se cargan generalmente con embudo y en forma similar a las
probetas.
Bureta
Tubo terminado en punta afinada y graduado. Por medio de un robinete o llave (debe estar
lubricado) permite la salida del liquido contenido en forma gradual, generalmente por goteo. De
capacidad variable, son usadas para medir volúmenes exactos, por ejemplo al efectuar
titulaciones. Se cargan por arriba (con embudo) o por abajo por succión superior. Se sostienen en
soportes adecuados, El robinete tiene dos posiciones extremas (cerrado y abierto) e intermedias.
Se usa en operaciones en que se necesita medir volúmenes con gran exactitud.
Pipetas bola o de traslado:
En su parte media poseen una dilatación o bulbo; puede tener uno o dos aforos y están
calibradas para un volumen fijo de líquido. No son graduadas.
Micropipetas:
Llevan este nombre pipetas de capacidad inferior al mililitro Se clasifican en manuales y
automáticas. Las primeras son de vidrio, aforadas, se conectan a una manguera de goma con
boquilla para cargar por succión y descargar soplando. Se debe secar la parte de la punta que fue
sumergida, ya que se trabaja con pequeños volúmenes y una gota que pudiera quedar equivale a
30-50 ul. Por la misma razón, el líquido debe ser depositado en el fondo del tubo o en contacto
directo con el resto del contenido. De lo contrario, solo mojaría las paredes. Su uso está siendo
desplazado por la pipeta automática.
Las micropipetas automáticas son graduadas en fábrica; pueden ser de volumen fijo o
variables. Tienen dos posiciones, una para la carga y otra para la descarga. Se usan con "tips"
(picos de plástico) descartables, uno para cada muestra. Tienen amplia difusión por la practicidad
y la rapidez, sobre todo para trabajos en serie.
3.4 Descripción del material NO volumétrico
a) Material de vidrio
• Pipeta Pasteur

23
Tubo de vidrio no graduado ni calibrado a un volumen determinado que consta de dos

partes de diferentes diámetros (el inferior se denomina capilar, por su delgadez). El
extremo superior se conecta a una pera de goma que se aprieta o deja expandir para
expulsar el líquido. Se fabrican con facilidad a partir de tubos de vidrio blandos.
• Tubo de ensayo
Recipiente cilíndrico con un extremo cerrado (convexo) y el otro con borde redondeado o
liso. Tienen aproximadamente 18 mm. de diámetro por 15 cm de largo y hasta 20 ml de
capacidad. Deben tener relativa resistencia a los golpes y al calor. Esto se puede
comprobar dejándolo caer en forma vertical y con el extremo cerrado hacia abajo a unos
5 cm de la superficie dura, debiendo resistir el impacto. Para calentarlo, se lo coloca en
angulo de 45° (sosteniéndolo con una pinza) y se expone a la llama su pared inferior (no
el fondo) moviéndolo constantemente para evitar que se rompa y para un calentamiento
homogéneo. Si se debe llegar a la ebullición, no puede cargarse más de dos tercios de su
capacidad.
• Embudo
De medidas variables, puede ser liso o estriado. Este últimos se usan para filtración con conos
de papel de filtro; las estrías permiten la entrada de aire, lo que facilita el filtrado.
• Ampolla de decantación
Es un recipiente esférico con un orificio superior para su llenado (con un tapón). Por debajo
se continúa con un tubo al que se interpone un robinete o llave; este mecanismo permite
separar mezclas de dos o más fases.

24
• Balones
Recipiente esférico sin base, con cuello cilíndrico largo o corto (que en algunos casos presenta
una salida lateral para trabajos de destilación). Se presenta con distintas capacidades;
necesita estar sujeto a un soporte y pueden ser utilizado para calentar sustancias o para
destilaciones.
• Erlenmeyer
Son recipientes de forma cónica, con vértice superior terminado en un cuello corto y una base
plana. Pueden poseer aforo (en este caso son volumétricos) y capacidad variable. Se los utiliza
para preparar y guardar soluciones
• Kitasato
Son similares a los anteriores, pero poseen una tubuladura lateral corta en la base del cuello.
Tienen paredes gruesas y muy resistentes y capacidad variable. Se pueden emplear para
filtrar al vacío.

25
• Vidrio reloj
Vidrios en forma cónica. Pueden servir para depositar sustancias en pequeñas cantidades,
mezclarlas o pesarlas y evaporar.
• Cajas de Petri
Recipientes esféricos de altura muy inferior a su diámetro. Constan de dos partes: la caja
propiamente dicha y la tapa que cubre a la caja (de igual forma pero mayor diámetro. Tiene variada
utilidad, pero es especialmente empleada para cultivos en microbiología.
• Vaso de precipitación
Recipiente con el borde superior terminado en jarra. Tienen capacidad variable y pueden ser
lisos o graduados.

26
• Frascos goteros
Son frascos de vidrio grueso (generalmente oscuros), casi siempre de capacidad inferior a los
100 ml. Tienen tapones de vidrio acanalados y terminados en pico que permiten el goteo.
• Frascos de reactivos
Similares a los anteriores, pero pueden ser de mayor capacidad. Hay oscuros (para reactivos
sensibles a la luz) y claros, generalmente son de boca ancha y tienen tapones de vidrio en
forma de hongo (esmerilados).
• Cápsula de porcelana
Recipiente similar al vidrio de reloj, pero de mayor capacidad (y no es de vidrio). También se
usa para evaporar sustancias.
• Mortero
Consta de dos partes:
 el recipiente con relativa profundidad y grosor de sus paredes (resistentes), según los
diferentes tamaños.
 el pilón o mazo, que se utiliza para triturar sustancias sólidas por medio de presión o
pequeños golpes, pueden ser de vidrio o porcelana
• Desecadores
Los desecadores de vidrio tienen paredes gruesas y forma cilíndrica, presentan una tapa
esmerilada que se ajusta herméticamente para evitar que penetre la humedad del medio

27
ambiente. En su parte interior tienen una placa o plato con orificios que varía en número y
tamaño. Estos platos pueden ser de diferentes materiales como: porcelana, o nucerite
(combinación de cerámica y metal).
b) Materiales de goma
• Tapones
Existen de varios colores y tamaños, clasificados por números cuyos diámetros coinciden con
los de tubos, balones, erlenmeyers, etc.
• Tubuladuras
También existen de variadas clases (de plástico, goma negra o roja opacas, látex
transparente, más o menos resistentes al calor, etc.), Se emplean como medio de conexión al
armar ciertos aparatos (como el de destilación y filtrado al vacío), o también como tubuladura
de gas o agua. Su longitud y diámetro varían según la necesidad; el diámetro se toma midiendo
la luz y se expresa en cm. o subunidad de pulgada.
• Propipetas y pipeteadores
Dispositivo que consta de una pera de goma con 2 orificios de salida. El de la parte superior
se utiliza para hacer ingresar o salir aire de la pera. El inferior se contacta con una pipeta.
Posee una válvula que regula la entrada de líquido a la pipeta y otra para descargarlo. Es un
sistema muy ingenioso y simple que evita los accidentes del operador por aspiración del
contenido de las pipetas y permite enrasar y descargar fácilmente.
Los pipeteadores son dispositivos o instrumentos para el trasvase o medición de fluidos.
c) Materiales metálicos de madera
• Trípode y mantilla con amianto

28
El trípode consta de un sostén circular de hierro con tres patas, utilizado para apoyar
recipientes que serán calentados con un mechero. La mantilla es una rejilla metálica cuadrada
con un centra impregnado con amianto (silicato de calcio y magnesio) que se interpone entre
el recipiente a calentar y el mechero (sobre el trípode), así el calor se distribuye en forma
pareja.
• Cepillos de cerda
Están constituidos por dos trozos de alambre enroscados uno sobre el otro entre los cuales
se sostienen trocitos de cerda (en la porción inferior) que se disponen en forma espiral y
perpendicular al alambre. Existen de diversos tamaños para poder ser introducidos en los
diferentes elementos de vidrio y efectuar una cómoda y adecuada limpieza.
• Mechero de Bunsen
Tubo metálico por el cual circula gas que entra por una conexión lateral. El gas se mezcla con
aire que entra por dos orificios de la base, cuyo tamaño puede ser regulado. El uso más
frecuente que se dará al mechero es el calentamiento de tubos de ensayo; para ella se usará
una llama no mayor de 10 cm, en lo posible de color azulado para evitar el depósito de carbón
en las paredes del tubo.
• Soportes universales
Estos elementos de hierro constan de una base rectangular plana y, perpendicularmente
inserto en ella, el soporte propiamente dicho. Este es un vástago de metal al que se adosan
pinzas que sujetan diversos materiales (buretas, balones, tubos refrigerantes, etc.).
• Pinzas de Bunsen
También llamadas de "doble nuez". Sus dos extremos actúan como pinzas. De un lado se
sujetan al soporte y por el otro se adecuan al recipiente a sostener. El ajuste se efectúa con
tornillos mariposa o similares.
• Pinzas de Mohr
Son llaves hechas de una varilla de metal doblada a la mitad de manera que sus brazos se
superponen y queda formado un ojal. Este se puede abrir presionando los extremos de los
brazos de la varilla para enhebrar un tubo de goma. La pinza sirve para cerrar o abrir a voluntad
la luz del tubo de goma.
• Pinzas de madera
Son broches parecidos a los usados para sostener ropa, ¡pero con un brazo de mayor longitud
para comodidad de! operador. También los hay de metal y para diferentes diámetros de tubos.
Se usan para sostenerlos durante el calentamiento.
• Gradillas portatubos
Son de metal, madera, acrílico o alambre forrado en plástico. Consisten en soportes con
múltiples perforaciones de diferentes diámetros donde van insertos los tubos.
Manteniéndolos en forma vertical. Algunas son para tubos de ensayo y otras para tubos
de hemólisis o Kahn.
4. Objetivos
 Familiarizar al estudiante con los implementos usados en el Laboratorio de Biología.

29
 Capacitar al estudiante para adquirir habilidad en el manejo de pipetas, buretas, balones, vasos de
precipitado y tubos de ensayo.
5. Materiales
· Vaso de Precipitado
· Erlenmeyer
· Balón de Fondo Redondo
· Balón de Fondo Plano
· Balón Volumétrico
· Probeta
· Bureta
· Pipeta Graduada.
· Pipetas Aforadas
· Tubos de Ensayo
· Embudo
· Condensador
· Embudo de Separación
· Cápsula de Porcelana
· Termómetro
· Gradilla
· Triángulo
· Pinza para Tubos de Ensayo
· Espátula
· Soportes
· Vidrio de Reloj
· Balón de Destilación
· Balanza Analítica.
6. Procedimiento
 El estudiante hará un reconocimiento a conciencia de todos los implementos que se usan, así como las
precauciones que se deben tomar durante su manejo, lo anterior debe quedar consignado en el informe que
entregara al profesor.
 El profesor hará una demostración experimental de la forma como se llenan las pipetas las Buretas.
 Medir 10 ml. de agua con una pipeta graduada y colocarlos en un tubo de ensayo.
 Medir 10 ml. de agua con una pipeta aforada de 5 ml. y colocarlos en un tubo de ensayo.
 Colocar 50 ml de agua medidos desde una bureta en un cilindro graduado de 100 ml y comparar el volumen
con las divisiones del cilindro.
 Colocar en un vaso precipitado de 250 ml, 200 ml de agua medidos con un cilindro, comparando los
volúmenes.
7. Cuestionario
 ¿Qué Ud. entiende por cristalería de laboratorio?
.
 Explique cómo se fabrica el vidrio

.
 Nombre los componentes del vidrio "Pyrex"

.

30
 ¿Qué es el teflón y para qué se utiliza?

.
 ¿Cómo se clasifica la cristalería general?

.
 ¿Cuáles son las características de la cristalería de almacenaje?
 ¿Nombre los diferentes tipos de cristalería de medición volumétrica?
 ¿Cuáles son las características de la cristalería de medición volumétrica?
 Mencione las cristalerías de medición volumétricas.
 ¿Cuáles son las diferencias entre en erlenmeyer y un frasco de kitasato?
 ¿Cómo es una bureta?
 ¿Cómo funcionan los frascos goteros con tapa esmerilada?
 Describa el vaso de Koplin
 Describa las características de los tubos de ensayo.
 ¿Cómo son las placas de "Petry"?

31
 ¿Cuánto miden las láminas portaobjetos y los cubreobjetos?
 Explique en orden cronológico los pasos que deben efectuarse durante la realización del pipeteo.
 Explique las diferentes causas de error en que puede incurrirse durante el pipeteo.
 ¿Para qué se utilizan regularmente los vasos de precipitado o Beaker?
 ¿Qué otros recipientes además de los de vidrios se fabrican de porcelana?
 Precise semejanzas y diferencias entre una cápsula y un mortero.
 Explique cuáles son los procederes establecidos para la limpieza y desinfección de la cristalería.
 Describa cómo Ud. prepara la cristalería para que se mantenga estéril después de la esterilización.
8. Discusión

32
9. Conclusión
10. Bibliografía

33
EXAMEN PARCIAL PRACTICA N° 2

34
PRACTICA 03: PH Y SOLUCIONES AMORTIGUADORAS
INTRODUCCION
Los procesos celulares son sensibles a los cambios de pH y se realizan en un medio cuyo pH está
controlado. Por ello, el estudio de los mismos y su reproducción "ïn vitro" requiere el uso de medios que
regulen el pH.
Debido a que el agua constituye más del 50% de la mayoría de los tejidos tanto de plantas como de
animales, las reacciones bioquímicas se verifican en medio acuoso, y la mayor parte en un medio que se
mantiene cercano a la neutralidad. Por lo tanto, es fundamental conocer a fondo las propiedades de los
ácidos y las bases de un sistema amortiguador.
Puesto que el agua no solo es el componente celular más abundante, sino que tiene además carácter de
compuesto indispensable para la vida, es conveniente hacer notar que esta sustancia presenta muchas
propiedades excepcionales que la facultan para desarrollar su tarea de solvente de la vida. De estas
propiedades, las que permiten explicar el rol biológico del agua, son las siguientes: punto de ebullición,
calor de vaporización y punto de fusión más alto que los correspondientes a otras sustancias relacionadas
(H2S, etanol, metanol, HF, etc.) y además, capacidad calórica y calor de fusión elevados.
1. LEY DE ACCION DE MASAS Y EQUILIBRIO QUIMICO

En 1864 GULDBERG y WAAGE establecieron una relación entre la velocidad de una reacción
química y las concentraciones moleculares de las sustancias reaccionantes, llamada ley de acción de
masas, que dice: "La velocidad de una reacción química en un tiempo dado, es proporcional a la
concentración molecular (moléculas / unidad de volumen) de las sustancias reaccionantes presentes en
ese tiempo".
Considerando la reacción química reversible siguiente:
𝐴+𝐵 ↔𝐶+𝐷
donde para la reacción de ida, los reaccionantes son A y B y los productos que se originan son C y D. La
velocidad para esta reacción será proporcional a las concentraciones moleculares de A y B
𝑉 𝛼 [𝐴][𝐵]
Introduciendo una constante de proporcionalidad (k1) que mida la afinidad química propia de la
reacción, la ecuación anterior puede escribirse:
𝑉1 = c[𝐴][𝐵]

35
Para la reacción de vuelta, en forma análoga, se tendrá:
𝑉2 = k2 [𝐶][𝐷]
donde k2 es la constante de proporcionalidad que mide la afinidad química de la reacción de derecha a
izquierda.
Cuando la reacción alcanza el equilibrio, las concentraciones de las cuatro sustancias ya no se
modifican, lo que quiere decir que la velocidad de la reacción de ida, se hace igual a la velocidad de la
reacción de vuelta.
Por tanto,
𝑉1 = 𝑉2
k1[𝐴][𝐵] = k2 [𝐶][𝐷]
lo que también puede escribirse así:
𝐾 = k1 / k2 = [C][D]/[A][B]
donde K es otra constante, que expresa la relación k 1 /k2 y que se conoce como constante de equilibrio,
que expresa matemáticamente la relación entre las concentraciones de las sustancias reaccionantes en
el estado de equilibrio. Cuando la constante de equilibrio se aplica a reacciones de ionización recibe el
nombre de constante de ionización.
Aplicación de la ecuación de equilibrio.- El valor numérico de K es específico y característico para

reacción, sea cuales fueren las concentraciones relativas, siempre que la temperatura se mantenga
constante. Cuando K es alta, las concentraciones de C y D son altas en el equilibrio en relación a las
concentraciones de A y B, indicando que la afinidad entre A y B es grande y que la reacción hacia la
derecha predominará. Por otro lado, un valor pequeño de K, indica un predomino de la reacción hacia la
izquierda y una afinidad grande entre C y D.
2. ACIDOS Y BASES
2.1. DEFINICIONES.- Por costumbre se define a un ácido como aquella sustancia que en solución aporta
hidrogeniones (H+) al medio y base aquella que al disolverse da iones oxidrilos (OH -).
El concepto moderno de ácidos y bases de BRÖNSTED, LOWRY y otros, define un ácido como
un donador de protones y una base como un aceptor de protones. Por lo tanto, cada ácido tiene una base
conjugada.
Acido Base + H+
El concepto de BRÖNSTED es idéntico al concepto clásico en lo que se refiere a los ácidos, puesto
que un protón es lo mismo que un hidrogenión H+ (es decir un átomo de hidrógeno sin su electrón orbitario)

36
pero es muy diferente en lo que se refiere a las bases.

De acuerdo con esta teoría, un ácido se disocia en un protón y una base. Esta última puede
regenerar al ácido al reaccionar con un protón. Un ácido y su base se llaman conjugados.
ALCALI.- El término álcali se reserva para aquellos compuestos que al disociarse generan iones hidroxilo:
KOH K+ + OH-
Se comprende fácilmente que las bases clásicas, como el KOH, NaOH, etc. no pueden ser
consideradas como tales según la teoría de BRÖNSTED puesto que no aceptan protones; sin embargo
funcionan como bases porque al disociarse en K+ y OH-, el grupo oxidrilo OH-, que es la verdadera base,
acepta un protón H+ para formar H2O. Es decir, el ion OH- es base pero la molécula de KOH no lo es.
ANFOLITOS.- Son especies iónicas que pueden actuar como ácidos y como bases; por ejemplo el agua
y los aminoácidos (Tabla N° 1). Se dice también que son anfóteros.
Aun cuando es cómodo escribir el equilibrio ácido-base en la forma indicada arriba, el protón no
existe como tal sino que está solvatado. Por ejm., en medio acuoso el hidrogenión existe como hidronio
(H3O+).
H+ + H2O H3O+
TABLA N° 1. EJEMPLOS DE ACIDOS Y BASES BRÖNSTED
ACIDO BASE CONJUGADA
HCl H+ + Cl-
CH3COOH H+ + CH3COO-
NH4+ H+ + NH3+
H2CO3 H+ + HCO3-
HCO3 H+ + CO3—
H 2O H+ + OH-
H3O+ H + + H 2O
2.2. FUERZA DE ACIDOS Y BASES.- Se deben distinguir dos términos: concentración que es la cantidad
de ácido o base disuelto en un determinado volumen de agua (mol / litro) y fuerza de un ácido o una base
es la medida de la efectividad con que un compuesto se comporta como ácido o como base.
2.2.1. Fuerza de un ácido.- La fuerza de un ácido esta dada por su capacidad para ceder protones. Por
ejemplo, los ácidos clorhídrico y nítrico se disocian casi completamente en solución acuosa y por l o tanto
serán ácidos fuertes. Por el contrario, los ácidos acético y fórmico, que están solo ligeramente disociados
en solución, serán ácidos débiles. De otro lado, se considera que un ácido es fuerte cuando tiene una

37
constante de equilibrio superior a 10-2 (Ka mayor que 10-2). O en otras palabras, puesto que pKa = - log
Ka, es evidente que cuanto menor es el valor de pKa de un ácido, más fuerte es el mismo (Ka = constante
de disociación de un ácido).
Ácidos fuertes:
Ácido nítrico HNO3 H+ + NO3-
Acido clorhídrico HCl H+ + Cl-
Ácidos débiles:
Ácido acético CH3COOH H+ + CH3COO-
Acido fórmico HCOOH H+ + HCOO-
2.2.2. Fuerza de una base.- La fuerza de una base está dada por la magnitud en que se disocia en
solución acuosa para dar lugar a iones hidroxilo o por la capacidad para aceptar protones. Por ejemplo, el
NaOH y el KOH que están completamente ionizados en solución acuosa (de manera que la concentración
de OH- es la misma que la de la base), son bases fuertes y tienen alta afinidad por los protones. Por el
contrario, la anilina que esta sólo ligeramente disociada en solución, será una base débil; tiene escasa
afinidad por los protones (Ejm. el Cl- del HCl):
C6H5NH2 + H+ C6H5NH3+
Base débil (anilina)
Se considera bases fuertes aquellas que tienen una constante de equilibrio superior a 10 -12 (Kb
mayor de 10-12).
La capacidad del solvente de combinarse con el hidrogenión afecta la capacidad de disociación de
un ácido o una base y así, un mismo compuesto puede actuar como un ácido débil en un solvente y como
ácido fuerte en otro.
Es importante, también, señalar que la fuerza de un ácido depende de qué tan fuerte es su base
conjugada, así como de la constante dieléctrica del medio. En un ácido fuerte, como el HCl, su base
conjugada (base débil, Cl-) tiene escasa afinidad por los protones, prefiriendo estos combinarse con el
solvente y determinar un alto grado de disociación del ácido.
En el caso de los ácidos débiles sus bases conjugadas (base fuerte) tienen gran afinidad por los
protones, prefiriendo estos seguir combinándose con el solvente y determinan un escaso grado de
disociación del ácido.
3. CONCENTRACION DE IONES HIDROGENO Y pH

38
3.1. DEFINICION DE pH.- La concentración de iones hidrógeno da el grado de acidez de una solución, de
allí que la forma más racional de expresar la acidez de una solución sea en función de la concentración
de hidrogeniones expresada en normalidad, es decir, en equivalentes gramo de hidrogeniones/litro. Por
ejm., una solución con 1 g. de hidrogeniones/litro, tendrá una acidez 1 N. Sin embargo, en los líquidos
biológicos las concentraciones de hidrogeniones son muy bajas y su manejo es fastidioso y expuesto a
errores y difíciles de memorizar; así la concentración de hidrogeniones en el plasma es de 0.0000000389
N. Si omitimos un solo cero, la concentración de hidrogeniones se alterará 10 veces.
Por estas consideraciones, Sörensen en 1909 introdujo el término pH (potencial de hidrogeniones)
como una forma adecuada de expresar la concentración de hidrogeniones, utilizando solo el exponente
con signo positivo. Así, una solución con una concentración 0.0000001 de hidrogeniones, en vez de
escribir esa cifra, Sörensen propuso escribirla como 10-7 y utilizar solo el exponente con signo positivo, es
decir 7 como la medida de iones hidrógeno.
El pH se define entonces, como el logaritmo negativo de la actividad de hidrogeniones, pero
en la práctica se le denomina concentración de hidrogeniones, ya que la concentración y la actividad
son prácticamente las mismas, excepto en soluciones fuertemente ácidas.
pH = -log10[H+]
Ejm. La concentración de hidrogeniones del plasma es 0.0000000398 N. Esta cantidad puede escribirse,
también, de esta otra forma 398 x 10-10. Por lo tanto el pH del plasma será:
pH = -log10 [398 x 10-10]
pH = -log [398+10]
pH = -2.59988 +10
pH = 7.40012
3.2. DISOCIACION DEL AGUA

3.2.1. Derivación de Kw.- El agua purísima prácticamente no es conductora, pero en realidad tiene una
pequeñísima conductividad, reveladas por las medidas de conductividad. Esta débil conductividad indica
que el agua debe estar ligeramente disociada en iones H + y OH-.
H2O H+ + OH-
Sin embargo, puesto que el H+ (el protón) está hidratado, podemos escribir más correctamente
como:
2H2O H3O+ + OH-

(el H3O+ se conoce como ion "hidronio"). el propio H3O+ se halla hidratado mediante el establecimiento de
más enlaces de hidrógeno formando el ion H3O4+.
La pequeña disociación del agua se debe a que el átomo de hidrógeno tiene una masa pequeña, y
a que su único electrón se halla fuertemente retenido por el átomo de oxígeno. Por esto el átomo de
hidrógeno difícilmente puede disociarse del átomo de oxígeno al que se halla unido coovalentemente en
una molécula de agua y "saltar" al oxígeno de la molécula de agua adyacente a la cual se halla unido por
enlace de hidrógeno. En esta reacción se producen dos iones el ion hidronio (H 3O+) y el ion hidroxilo (OH-
).
En un litro de agua pura, a 25 °C, existen solo 1 x 10-7 mol de iones de H3O+ y una cantidad igual
de iones OH-, según muestran las medidas de conductividad eléctrica. El agua destilada común contiene

39
impurezas que la hacen mucho más conductora. Una buena agua destilada, recientemente obtenida por
destilación con contacto del aire, puede tener una conductividad específica de 0.7 x 10-6 l/ohm cm (esto
es 20 veces mayor que el valor mínimo hallado 0.038 x 10-6 l/ohm cm).
La constante de equilibrio para la disociación del agua está dada por:
[𝐻+][𝑂𝐻-]
𝐾=
[𝐻2𝑂]
Como un litro de agua pura contiene 55.5. moles de agua (1000/18 = 55.5) esto es, número de
gramos de agua en un litro dividido por el peso molecular gramo) y solo 0.0000001 mol (= 1 x 10 -7 a 25
°C) se halla disociado, es natural que podrían variar enormemente los valore de [H +] y [OH-] sin que la
[H2O] se altere perceptiblemente. Por ejm., si la concentración de estos iones aumentara en 1'000,000 de
veces, los moles de agua no disociados por litro descendería de 55.5 55.4. De manera que sin incurrir en
error apreciable, se admite que la concentración de las moléculas (H2O) es constante y su actividad es 1.
Según esto, la constante de equilibrio para el agua puede escribirse:
[𝐻+][𝑂𝐻-]
𝐾=
[55.5]
[55.5][𝐾] = [𝐻+][𝑂𝐻-]
y el término [55.5][K] puede sustituirse por una constante "global" Kw llamada producto iónico del agua,
entonces:
𝐾𝑤 = [𝐻+][𝑂𝐻-]
En el agua pura [𝐻+] = [𝑂𝐻-] puesto que al disociarse el agua produce iguales cantidades de
ambos iones (neutra) como [H+] = 10-7 será también [OH-] = 10-7, de donde se deduce que para el
agua pura a 25 °C el producto iónico es 10-14.
𝐾𝑤 = [H+][OH-] = 10-7 x 10-7 = 10-14
10-14 = [H+][OH-]
Puesto que 10-14 = 10-7 x 10-7, se comprende que al aumentar la [H+] la [OH-] debe disminuir y
viceversa. Por ejm., si al agua pura añadimos HCl hasta aumentar la [H+] a 10-3, la [OH-] disminuirá a 10-
11, así:

40
10-14 = 10-3 x 10-11
Para evitar dificultades en el uso de números decimales, aplicando los logaritmos negativos
correspondientes, tenemos:
-log 10-14 = (-log [H+]) + (-log[OH-])
donde se observa que el producto de la igualdad se convierte en una suma y así, al tomar el logaritmo
negativo:
14 = 7 + 7
y para el ejemplo:
14 = 3 + 11
En conclusión, la suma de los logaritmos negativos de las concentraciones de iones H + y OH- en

una solución acuosa es una constante de valor 14 a 25 °C. Así el pH del agua pura a 25 °C es 7 (neutra).
3.2.2. Temperatura y Kw.- El pH neutro no es 7 a cualquier temperatura, puesto que Kw cambia con la
temperatura y otros factores. Por ejm., el cambio de temperatura de 37 °C a 40 °C, causa un incremento
de 8% en iones H+ y en iones OH-. Esto indica que cualquier elevación o descenso de la temperatura
puede producir un cambio biológico profundo en los organismos vivos sensibles a la [H +] (Tabla N° 2).
TABLA N° 2. PRODUCTO IONICO DEL AGUA Y pH DE NEUTRALIDAD A DIFERENTES

TEMPERATURAS.
°C Kw pH de neutralidad
0 0.12 x 10-14 = 10-14.94 7.97

25 1.03 x 10-14 = 10-14.00 7.00
37 2.51 x 10-14 = 10-13.60 6.80
40 2.95 x 10-14 = 10-13.53 6.77
75 16.90 x 10-14 = 10-12.77 6.39
100 48.00 x 10-14 = 10-12.32 6.16
4. MEDICION DEL pH
El pH puede determinarse por mediciones catalíticas, espectrofotométricas, de la tensión superficial

41
y de la conductividad. Pero estos procedimientos no se usan. En cambio describiremos los métodos

colorimétricos y electrométricos.
La determinación del pH es uno de los procedimientos analíticos más importantes y utilizados en

bioquímica, ya que el pH determina muchas características de la estructura y la actividad de las
macromoléculas biológicas y, por tanto, de la conducta de las células y de los organismos.
4.1. METODOS COLORIMETRICOS.- Si se desea tener una medida aproximada del pH de una solución
se puede usar los llamados indicadores.
4.1.1. Teoría de los Indicadores.- Los indicadores son base o ácidos débiles cuyo color depende del pH
de la solución. Este otro.
Si se considera el indicador como un ácido, como sucede con los compuestos nitrados,
fenolftaleína, etc., al disociarse en una solución acuosa, desprenderá iones H+:
HI H + + I-
Acido Débil Base Conjugada
Color A Color B
y según la ley de acción de masas:
[𝐻+][𝐼-]
𝐾=
[𝐻𝐼]
Si usamos la ecuación de Henderson-Hasselbalch, como para cualquier ácido débil:

𝑙𝑜𝑔10[𝐼-]
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾in +
[𝐻𝐼]
Cada indicador tiene su constante de disociación Kin y su (-logKin)pKin. Cuando el pH de la solución

es igual al pKin del indicador, la relación [I-]/[HI] es igual a 1, por lo tanto existen en igual medida los dos
colores.
Las dos formas del indicador tienen colores diferentes y como parecerá claro al observar la última
ecuación, el color de la solución dependerá del pKin y del pH. El mayor cambio de color se obtiene alrededor
del pKin y este es el intervalo de pH donde el indicador es más útil. Por ejm., si un solución tiene un pH
aproximado de 6, entonces el púrpura de bromocresol, que tiene un pKin de 6, es el mejor indicador para
el caso. Pero debido a que el cambio de color ocurre en un rango amplio de pH, los indicadores tan solo
dan una medida aproximada del pH. Otra desventaja de los indicadores se debe a que son afectados por
agentes oxidantes, agentes reductores, concentraciones de sal y de proteína. Además, al usarlos, se debe

42
agregar solo pequeñas cantidades a la solución que se examina, o de lo contrario, el equilibrio ácido-base
de la muestra puede desplazarse y el pH cambiar.
El uso más importante de los indicadores es la determinación del punto final de una titulación.
En las titulaciones, se selecciona un indicador que cambie de color en el punto de equivalencia, el
cual, depende de la titulación que se efectúa. Por ejm., cuando se titula ácido acético con NaOH el ácido
es transformado totalmente en sal alrededor de pH 9; por l tanto debe usarse fenolftaleína como indicador.
En la misma forma, el rojo de metilo se usa cuando se titula amoniaco con HCl, puesto que el punto final
de titulación es pH 5.
En la Tabla N° 3 se consignan los indicadores más usados, sus valores de pKin y los límites de pH
entre los que se produce el cambio de color. Los límites de viraje de un indicador determinan la llamada
zona útil o zona de viraje, que corresponde a dos colores diferentes que evidencian el predominio de la
forma ácida o alcalina del colorante para un determinado pH. Como ya se menciona, la zona de viraje
varía según los colorares, puesto que la constante de disociación pKin varía según su naturaleza.
Comparando el color obtenido con la solución desconocida con el color "estándar" correspondiente, se
tiene el pH de la solución desconocida.
En la práctica, se cuenta con series de colorantes para la determinación del pH, como la propuesta
por Clark y Lubs que permite el estudio de sustancias cuyo pH estén comprendidos entre 1 y 10; los
colorantes de la serie de Clark y Lubs son derivados de la Sunfonftaleína y son amarillos del lado ácido, y
rojos o azules del lado alcalino. Los colorantes de la serie de Michaelis son monocromáticos, es decir, va
del incoloro al coloreado, o viceversa, y comprenden colorantes nitrados o fenolftaleína.
El pH aproximado de una solución cuya concentración de iones H + es totalmente desconocida, se
puede determinar con el llamado indicador universal o de Bogen, que es una mezcla de varios
colorantes, los cuales, a medida que el pH aumenta en la solución de estudio, van apareciendo los colores
como del espectro. Así; pH 2, rojo; pH 4, anaranjado; pH 6, amarillo; pH 8, verde; pH 10, azul; pH 12,
violeta. Una vez establecido el pH aproximado de la solución, se recurre al colorante de la serie de Clark
o de Michaelis cuyo viraje se produce en esa zona y de esta manera se puede precisar más exactamente
el pH de la solución.
La determinación del pH utilizando soluciones buffer, consiste en comparar el color que toma
el indicador en la solución cuyo pH se quiere conocer, y e color que toma este mismo indicador agregado
a soluciones buffer, como por ejm., del tipo de McIlvaine, de pH conocido. El pH de las soluciones buffer
se determina exactamente mediante el método electrométrico.
Papeles impregnados con determinados indicadores toman las coloraciones correspondientes
cuando se mojan en la solución cuyo pH se quiere conocer. El tono adquirido por el papel depende del pH
de la solución y se puede comparar con los colores estándar que llevan los tubos portapapeles. Los
papeles a utilizar deben variar dentro del pH de la solución. Así, por ejm., el papel impregnado con rojo de
fenol cuya zona de viraje está entre 6.8 y 8.4 permite determinar el pH de una solución comprendido dentro
de estos valores.
4.1.2. Errores del Método Colorimétrico.- La adición de un colorante a una solución puede modificar el
pH de esta, dada la naturaleza ácida o básica del indicador y por la presencia de sales o proteínas que
modifican su viraje.
En las soluciones coloreadas o turbias, la coloración que da el indicador no es la misma que en una
solución clara e incolora; por ello, en tales casos se usan comparadores; es decir, cajas especiales donde
se disponen los tubos que contiene la solución de pH desconocido, una solución coloreada estándar y el
agua. La turbiedad o el color del medio que se ensaya se superponen en los tres campos de visión, y por

43
sustitución de los tubos de colores estándar se llega a un tono que coincide con el tubo central y que
establece su pH.
El método colorimétrico no es rigurosamente exacto, y su precisión es de 0.1 pH, que puede llegar
a 0.03 pH si se procede con técnicas cuidadosas.
TABLA N° 3. INDICADORES DE pH
INDICADOR PKin LIMITES DE pH CAMBIO DE COLOR

Acida Alcalina
Violeta de metilo 0.8 0.1 - 1.5 Amarillo Azul

Rojo cresol ácido 1.0 0.2 - 1.8 Rojo Amarillo
Púrpura de metacresol 1.5 0.5 - 2.5 Rojo Amarillo
Azul de timol 2.0 1.2 - 2.8 Rojo Amarillo
Tropeolina 2.2 1.3 - 3.0 Rojo Amarillo
Violeta de metilo 2.4 1.5 - 3.2 Azul Violado
Amarillo de metilo 3.5 2.9 - 4.0 Rojo Amarillo
Azul de bromofenol 3.8 3.0 - 4.6 Amarillo Azul
Anaranjado de metilo 3.4 3.1 - 4.4 Rojo Amarillo
Rojo congo 4.1 3.0 - 5.2 Azul Rojo
Verde de bromocresol 4.7 3.8 - 5.4 Amarillo Azul
Azul de bromocresol 5.0 4.2 - 5.8 Amarillo Azul
Rojo de metilo 5.2 4.2 - 6.2 Rojo Amarillo
Tornasol 6.4 4.5 - 8.3 Rojo Azul
Rojo de clorofenol 5.9 5.1 - 6.7 Amarillo Rojo
Púrpura de bromocresol 6.0 5.2 - 6.8 Amarillo Azul
Azul de bromotimol 6.8 6.1 - 7.7 Amarillo Azul
Rojo de fenol 7.6 6.8 - 8.4 Amarillo Rojo
Rojo de cresol 8.0 7.2 - 8.8 Amarillo Rojo
Púrpura de metacresol 8.2 7.4 - 9.0 Amarillo Violeta
Azul de timol 8.8 8.0 - 9.6 Amarillo Azul
Fenolftaleína 9.1 8.2 - 10.0 Incoloro Rojo
Amarillo de alizarina 11.3 10.4- 12.2 Amarillo Rojo
Sulfo naranja 11.8 11.0 - 12.6 Amarillo Naranja
Carmín de índigo 12.8 11.6 - 14.0 Azul Amarillo

44
TABLA N° 4. COMPOSICION DE LOS INDICADORES UNIVERSALES I Y II
INDICADOR CANTIDAD (g)

I II
Azul de timol 1.0 -

Azul de bromotimol 0.8 0.4
Dimetilaminoazobenceno 0.6 -
Rojo de metilo 0.4 0.2
Fenolftaleína 0.2 0.8
Alcohol etílico 1000.0 1000.0
TABLA N° 5. COLORACION DE LOS INDICADORES UNIVERSALES I Y II
INDICADOR I INDICADOR II
pH COLOR pH COLOR
1 rojo 4 rojo
4 naranja 5 naranja
6 amarillo 6 amarillo
8 verde 7 verde
10 azul 8.5 azul
10.0 violeta
4.2. METODO POTENCIOMETRICO.- Es el método más conveniente y confiable para medir el pH.
Requiere de un instrumento llamado potenciometro o pHmetro, que permite determinar la concentración
de iones hidrógeno midiendo la fuerza electromotriz (f.e.m.) de una celda formada por un electrodo de
referencia, la solución problema, y un electrodo de vidrio sensible a hidrogeniones.
Un pHmetro de lectura directa, consta de dos electrodos:
a) El electrodo de referencia externa, el más usado es el electrodo de calomel; en este, la solución
acuosa que está en contacto con mercurio metálico y cloruro de mercurio sólido se halla saturada con
cloruro de potasio.
b) El electrodo de referencia interna, es el de vidrio, específicamente de membrana de vidrio. Consta de
un bulbo de vidrio especial de paredes muy finas sensibles a la actividad del ion hidrógeno, que se halla
soldado a un tubo de vidrio ordinario. En el interior del bulbo se halla un alambre de plata recubierto de
cloruro de plata, sumergido en una solución de HCl 0.1 M. El tubo de vidrio se halla lleno de una resina
que sirve para el contacto eléctrico con el circuito externo.
La membrana de vidrio consta de dos capas de vidrio concéntricas hidratadas: externa e interna

45
que encierran una capa de vidrio seca.

4.2.1. Electrodo de Vidrio.- Este electrodo en combinación con el de calomel, al ser introducido en la
solución problema proporciona una celda galvánica útil para las mediciones prácticas de pH; el esquema
de una celda es el siguiente:
Medidor de pH
(instrumento para medir
la f.e.m.)
Ag.AgCl HCl(0.1 mol/l) Membran Solución KCl Hg2Cl2.Hg

a de problem (sat.)
vidrio a
Electrodo de vidrio Electrodo de referencia de

Calomel
Cada línea vertical indica un límite de fases a través del cual se desarrolla una fuerza electromotriz
total constituida por 5 partes a la que se suma un potencial de asimetría. Los diferentes potenciales son
los siguientes:
1. El potencial del electrodo Ag - AgCl
2. El potencial entre la solución de HCl en el interior del electrodo de vidrio y la pared interna de la
membrana.
3. El potencial entre la pared externa de la membrana de vidrio y la solución de pH desconocido.
4. El potencial de contacto líquido entre la solución de pH desconocido y el electrodo de calomel saturado.
5. El potencial del electrodo de calomel saturado y el potencial de asimetría.
Los potenciales 1, 2 y 5 son invariable, debido a que la composición de la solución en el interior del
electrodo de vidrio se mantiene constante y la f.e.m. del electrodo de calomel tiene un valor fijo.
El desplazamiento de la f.e.m. total observado en la celda galvánica, cuando se introduce una
solución de pH desconocido se debe a las variaciones de los potenciales 3,4 y asimétrico.
El potencial del electrodo de vidrio (Ev) en relación con el electrodo de referencia externa (Eref), se
relaciona con el pH en la siguiente ecuación:
𝐸𝑣-𝐸𝑟𝑒𝑓
𝑝𝐻 = 𝑎 25℃
0.0591
La respuesta del electrodo de vidrio debe calibrarse frente a soluciones amortiguadoras de pH
conocido, como las de la Tabla N° 6.

46
TABLA N° 6. SOLUCIONES DE pH CONOCIDO PARA LA CALIBRACION DE UN MEDIDOR DE pH
SAL pH A 25 °C pH A 37 °C
1. Tartrato monobásico de potasio saturado 3.56 -
2. Ftalato monobásico de potasio 0.05 M 4.01 4.02
3. Fosfato de potasio monobásico 0.025 M
Fosfato de sodio dibásico 0.025 M 6.86 6.84
4. KH2PO4 0.0087 M
Na2HPO4 0.304 M 7.41 -
5. Tetraborato sódico (bórax) 0.01 M 9.18 9.06
4.2.2. Cuidados del Electrodo de Vidrio.- Debe ser lavado bien después de cada determinación de pH,
especialmente después de trabajar con soluciones de proteínas, pues estas, al adsorberse en la superficie
de la membrana de vidrio causan serios errores. Otro motivo de errores puede presentarse por
deshidratación parcial de las soluciones no acuosas sobre la membrana de vidrio, lo que determina
cambios en la diferencia de potencial. Las soluciones amortiguadoras se deben agitar vigorosamente
durante las mediciones, a fin de evitar que se forme una delgada capa de solución en la interfase entre el
vidrio y la solución.
5. pH DE ACIDOS, BASES Y SOLUCIONES SALINAS
5.1. pH DE ACIDOS FUERTES Y DE BASES FUERTES.- Los ácidos fuertes, como el HCl, en disolución
acuosa se ionizan completamente, por tanto, la concentración de hidrogenión es igual a la concentración
del ácido. En consecuencia sus valores de la constante de disociación (Ka) se aproxima al infinito y todos
tiene una fuerza aproximadamente igual. El pH de una disolución acuosa de un ácido fuerte, es el logaritmo
negativo de su concentración.
𝑝𝐻 = −𝑙𝑜𝑔10[𝐴𝑐𝑖𝑑𝑜]
El pH de una solución 1N de ácido monobásico fuerte es cero y la solución aumenta en una unidad
de pH por cada décuplo de dilución del ácido.
Similarmente, las bases fuertes tales como NaOH, se ionizan completamente en solución y por
tanto la concentración del ion OH- es igual a la concentración de la base. El pH de una solución 1 N de
una base monobásica es 14, y el pH decrece e una unidad por cada décuplo de dilución. El pH se calcula
según la siguiente ecuación:
𝑝𝑂𝐻 = −𝑙𝑜𝑔10[𝑂𝐻-]
𝑝𝐻 = 14 − 𝑝𝑂𝐻
5.2. pH DE ACIDOS Y BASES DEBILES.- Los ácidos débiles se disocian solo en pequeñas proporciones
en las soluciones muy diluidas. El grado de ionización y la [H+] y la [OH-] están determinados por su
constante de ionización. El pH de los ácidos débiles está dado por:
𝑝𝐾𝑎 = −𝑙𝑜𝑔10𝐾𝑎

47
𝑝𝐾𝑎 − 𝑙𝑜𝑔 10 [𝐴𝑐𝑖𝑑𝑜]
𝑝𝐻 =
2
o puede calcularse el pH a partir de:
[𝐻+] = √𝐾𝑎 𝑥 𝐶
donde:
C = Concentración total del ácido
Y el pH de las bases débiles se calcula a partir de:
𝑝𝐾𝑏 + 𝑙𝑜𝑔10 [𝐵𝑎𝑠𝑒]

𝑝𝐻 = 14 −
2
el pH de una solución 1 N de base débil = 14 - pKb/2, decreciendo e una unidad de pH por cada céntuplo
(cien veces) de dilución de la base. De igual modo el pH = pKa/2 para una solución 1 n de un ácido débil
monobásico y el pH aumenta en una unidad por cada cien veces de dilución del ácido.
5.3. pH DE SOLUCIONES SALINAS.- Los iones de iones de ácidos y bases débiles reaccionan con el
agua para formar el ácido o la base no disociados. Esto altera la concentración de iones H+ del agua y a
menudo las soluciones salinas no poseen pH 7.
5.3.1. pH de Sales de Acido Fuerte y de Base Fuerte.- Estas soluciones salinas, como la de NaCl, dan
reacción neutra con el tornasol. Ninguno de los iones presentes reacciona con el agua y por tanto la
concentración del ion hidrógeno del agua permanece inalterada (pH 7).
5.3.2. pH de Sales de Acido Fuerte y Base Débil.- Estas soluciones salinas, como la solución de NH4CL,
dan reacción ácida con el tornasol. El catión reacciona con el agua y forma l base débil no disociada; esto
causa un exceso de iones H+ en la solución.
Si consideramos una solución de una sal formada a partir de un ácido fuerte y una base débil. Por
ejm., la solución de NH4Cl:
NH4Cl NH4+ + Cl- (la sal está completamente ionizada)

NH4+ + H2O NH4OH + H+ (hidrólisis de la sal: [NH4OH] =
[H+])
[𝑁𝐻4𝑂𝐻][𝐻+]
𝐾H =
[𝑁𝐻4+]

48
(KH = constante de hidrólisis. El agua es constante por eso se le omite).
𝐾𝑤 [𝑁𝐻4+][𝑂𝐻-]
𝐾H = 𝐾𝑤 = [𝐻+][𝑂𝐻-] ; 𝐾𝑏 =
𝐾𝑏 [𝑁𝐻4𝑂𝐻]
𝐾𝑤 [𝐻+]2
= [𝑁𝐻4+] = [𝑆𝑎𝑙]
𝐾𝑏 [𝑆𝑎𝑙]
𝐾𝑤 [𝑆𝑎𝑙]
[𝐻+]2 =
𝐾𝑏
𝑝𝐾𝑤 − 𝑝𝐾𝑏 − 𝑙𝑜𝑔10[𝑆𝑎𝑙]

𝑝𝐻 =
2
ésta ecuación da el pH de una solución de sal formada a partir de un ácido débil y una base débil.
El pH de este tipo de soluciones salinas se incrementan en una unidad de pH por cada céntuplo de
dilución de la sal
5.3.3. pH de Sales de Base Fuerte y Acido Débil.- Estas soluciones salinas, como el acetato de sodio,
dan reacción alcalina con el tornasol. El anión experimenta hidrólisis para formar el ácido débil no
disociado; esto causa un exceso de iones OH - en la solución.
El pH de una solución de una sal formada a partir de un ácido débil y de una base fuerte está dado
por:
𝑝𝐾𝑎 + 𝑙𝑜𝑔10[𝑆𝑎𝑙]
𝑝𝐻 = 7 +
2
EL pH de este tipo de soluciones salinas decrece e una unidad de pH por cada céntuplo de dilución
de la sal.
5.3.4. pH de Sales de Acido Débil y de una Base Débil.- Estas soluciones salinas, como el NH4CN,
pueden dar reacción neutra, ácida o alcalina con el tornasol. Tanto el anión como el catión experimentan
hidrólisis, el grado de la cual depende de la fuerza relativa del ácido y de la base a partir de los cuales se
deriva la sal. Si Ka = Kb, la solución dará reacción neutra; si Ka > Kb, la solución salina tendrá pH menor
de 7; a la inversa se Ka < Kb, la solución salina tendrá un pH mayor de 7.
El pH de una solución de una sal formada a partir de un ácido débil y de una base débil está dado
por:
𝑝𝐾𝑤 + 𝑝𝐾𝑎 + 𝑝𝐾𝑏
𝑝𝐻 =
2
El pH de este tipo de soluciones salinas es independiente de la concentración.

49
6. CURVAS DE VALORACION
Si se va añadiendo poco a poco una base, a una solución de ácido, el pH de la solución se
incrementará con cada adición de base. Si se representa gráficamente el pH en función de la cantidad de
base añadida, se produce una subida brusca en el punto de equivalencia; en el que el ácido está
neutralizado exactamente.
La región de subida brusca se llama punto final y el conjunto del proceso de adición de la base y
determinación del punto final se llama valoración. El diagrama que representa la variación del pH durante
la valoración se llama curva de valoración. En la figura 1 se ha dibujado diversas curvas de valoración
de 20 ml de algunos ácidos 0.1 N, con NaOH 0.1 N. Obsérvese que aunque el punto final se produce
exactamente al añadir 20 ml de NaOH, las curvas difieren en su forma y también en el pH del punto final.
La curva tiene s subida más brusca en la valoración de un ácido fuerte (HCl) con una base fuerte (NaOH)
y menos brusca en la valoración de un ácido débil (CH 3COH) con base fuerte (NaOH)
14
Punto medio de titulación = pKa
12
Punto de equivalencia
10
del ácido acético
+
pH = 9
HCN H + CN
8
pKa = 9.1
Punto de equivalencia
pH
- + del HCl pH = 7
6 H2PO 4
H + HPO4
pKa = 7.2
4
+ -
CH3COOH H + CH3COO
pKa = 4.7
2
Punto final de titulación
HCl
0
0 5 10 15 20
NaOH 0.1N (ml)
Fig. 1. Curvas de titulacion para 20 ml de soluciones de algunos acidos 0.1 N.
6.1. NEUTRALIZACION DE UN ACIDO FUERTE CON UNA BASE FUERTE.- La naturaleza del proceso
de neutralización, se entiende mejor por la forma en que cambia el pH cuando se titula una disolución
acuosa de ácido fuerte (HCl) con una base fuerte NaOH). El NaOH actúa con una concentración
equivalente de iones OH-. Por lo tanto, la interacción del HCl con el NaOH puede representarse por:
HCl + OH- H 2O + Cl -
(Acido) (Base) (Acido conjugado) (Base conjugada)
Los productos de la neutralización son el ácido excesivamente débil H 2O y la base infinitamente

50
débil Cl-. Por tanto, la neutralización será completa, ya que la reacción inversa ocurrirá en una magnitud
no significativa y la ecuación de neutralización será:
HCl + OH- H2O + Cl-
Esto indica que:
1. Cuando se haya añadido menos de una cantidad equivalente de NaOH la concentración de iones H+
será igual a la concentración de HCl que queda sin neutralizar, ya que el HCl está completamente
disociado en agua.
2. En el punto de equivalencia, el pH de la mezcla será 7, ya que contiene además de agua, solo iones
Na+ y Cl- que son insignificantemente ácidos o básicos (el pH 7 es, por tanto, el pH de una disolución
acuosa de cloruro de sodio).
3. Cuando se añade más de un equivalente de NaOH, la concentración de iones H+ residual es
inversamente proporcional a la concentración de NaOH presente en exceso.
La forma de la curva indica que al ir añadiendo base se producen tan solo pequeños cambios en el
valor de pH hasta cuando se obtiene la neutralización completa; pero en este punto un exceso de base
causa un cambio brusco en el pH. En efecto, el ácido fuerte está impidiendo el cambio en el pH, en otras
palabras, está actuando como una solución amortiguadora. La zona donde adiciones grandes de álcali
producen cambios pequeños de pH, se denomina zona de tampón ácida.
6.2. NEUTRALIZACION DE UN ACIDO DEBIL CON UNA BASE FUERTE.- Si titulamos ácido acético con
NaOH, el proceso de neutralización se escribe:
CH3COOH + OH- H2O + CH3COO-

(Acido) (Base conjugada)
El otro producto de la neutralización, a parte del agua, es el ion acetato (CH3COO-), es la base
conjugada del ácido débil CH3COOH, o sea:
CH3COO- + H+ CH3COOH
Es decir el pH de una disolución de ácido acético, a la que se le añadió menos de un equivalente

de NaOH, dependerá o solo de la cantidad de ácido acético que queda sin disociar, sino también de la
magnitud en la que se disocia, la cual está dada por la concentración del ion CH 3COO- en la solución. Por
tanto, el curso del cambio del pH durante la titulación reflejará:
1. la eliminación, por neutralización del ácido acético, con la consiguiente producción de CH 3COO-,
2. el progresivo incremento de la represión de la disociación del ácido acético residual debido a la
progresiva subida de la concentración del ion CH3COO- producida por (1).

51
El efecto cuantitativo, de estos acontecimientos sobre el pH durante la neutralización se puede

calcular a partir de la ecuación que define la constante de disociación de un ácido débil:
HA H + + A-
De acuerdo con la ley de acción de masas, la constante de disociación Ka se define como:

[𝐻+][𝐴-]
𝐾𝑎 =
[𝐻𝐴]
[𝐻𝐴]
[𝐻+] = 𝐾𝑎
[𝐴-]
Sacando los logaritmos negativos,
[𝐻𝐴]
−𝑙𝑜𝑔[𝐻+] = −𝑙𝑜𝑔𝐾𝑎 + (−𝑙𝑜𝑔 )
[𝐴-]
ó
[𝐴-]
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + 𝑙𝑜𝑔
[𝐻𝐴]
En términos generales:
[𝐵𝑎𝑠𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑗𝑢𝑔𝑎𝑑𝑎]
[𝐴𝑐𝑖𝑑𝑜]
Esta es la llamada ecuación de Henderson-Hasselbalch. En la práctica significa que la curva de
titulación de ácido débil-base fuerte tendrá la forma mostrada en la figura anterior para la titulación de
ácido acético con NaOH.
En esta curva se observa que el pH del punto de equivalencia es mayor de 7. En segundo lugar, la
zona de cambio rápido del pH alrededor del punto de equivalencia tiene una extensión menor que en la
titulación de un ácido fuerte con NaOH. Pero el hecho más notable es que esta curva de titulación tiene
forma sigmoidal en el lado ácido de la equivalencia con una inflexión en el punto medio de este brazo. En
este punto, la mitad del ácido inicial se ha convertido en su base conjugada y la mitad queda sin neutralizar.
Por tanto, en este punto [base conjugada] = [ácido], y el pH es igual a (pKa + log 1) = pKa (ya que el Log
de 1 = 0). Por tanto, midiendo el pH en el punto de media equivalencia, cuando se titula un ácido débil con
álcali, se obtiene un valor experimental (aparente) para el pKa del ácido.
El pH en esta curva cambia sólo lentamente por la adición de álcali (o de ácido fuerte) aunque cerca
del principio y cuando se aproxima a la equivalencia el pH cambia más rápido. Es decir, las mezclas en
medio del margen de pre-equivalencia tiene una mayor capacidad tamponante que las situada en los
extremos. La forma sigmoidal de la curva de titulación obedece a la ecuación de Henderson-Hasselbalch.
El cambio de pH por adición de álcali depende solo del cambio ejercido por esta adición en el valor de la
relación [base conjugada]/[ácido], puesto que pKa es constante en cualquier titulación. En el punto de
media equivalencia [base conjugada]/[ácido] es 1, y la adición de una décima parte de un equivalente d

52
álcali a esta mezcla, solo producirá un pequeño cambio en la proporción, y por tanto, un ligero incremento
en el pH (la proporción sería 1.5 log de 1.5 = 0.176). Por otra parte, la adición de esta cantidad de álcali
a mezclas en las que [base conjugada]/[ácido], es inicialmente de 10 o de 1/10 producirá un cambio mucho
más grande en la proporción y por tanto en el pH. Entonces, la alteración del pH producida por una
pequeña cantidad de álcali (o de ácido fuerte) es mínima en el punto de mínima equivalencia y aumenta
cuando más difiere de la proporción [base conjugada]/[ácido]; de aquí la forma sigmoidal de la curva de
titulación. de igual modo se puede concluir que:
a) una mezcla en la que la proporción [base conjugada]/[ácido] es 1, y el pH e igual al pKa del ácido
componente, es la mezcla tampón más eficiente.
b) la capacidad tamponante de una mezcla disminuye cuanto más difiere su pH del pK del ácido débil
componente.
En la práctica, se considera que una mezcla de un ácido débil y su base conjugada forman un
tampón satisfactorio en el margen de pH que va desde 𝑝𝐻 = (𝑝𝐾𝑎 − 1) a 𝑝𝐻 = (𝑝𝐾𝑎 + 1). De la
curva de titulación, se puede hacer predicciones bastante exactas respecto a la capacidad relativa
tamponante de mezclas que tienen iguales concentraciones del mismo ácido débil y su base conjugada.
Estas son:
1. La mezcla cuyo pH es igual al pKa del ácido débil, en la que la proporción [base conjugada]/[ácido] es
1, es la mezcla tampón óptima en el sentido que hace mínimo el cambio de pH por la adición de una
pequeña cantidad de álcali o ácido fuerte.
2. Una mezcla cuyo pH se igual a (pKa - 1), en la que la proporción [base conjugada]/[ácido] es 0.1, es un
tampón efectivo "contra" un álcali, pero poco efectivo "contra" un ácido fuerte.
3. La mezcla cuyo pH es igual a (pKa + 1) y cuya proporción [base conjugada]/[ácido] es 10, es un tampón
efectivo "contra" ácidos fuertes, pero poco efectivo "contra" álcalis.
No obstante, la capacidad real tamponante de una disolución sólo está determinada por la
proporción inicial [base conjugada]/[ácido], sino también por la magnitud real de estas concentraciones.
Se nota también que la misma curva de titulación de "pre-equivalencia" se obtendrá si se titula una
disolución de acetato sódico con un ácido fuerte, aunque ahora el pH descenderá.
Para el calculo de pH, en la práctica, no es deseable generalmente aplicar la ecuación de
Henderson-Hasselbalch a disoluciones acuosas de pH menor de 4 o mayor de 10, pues esta ecuación
solo da valores aproximados.
7. SOLUCIONES AMORTIGUADORAS Y SU CAPACIDAD DE AMORTIGUACION
Solución amortiguadora es aquella que se opone a los cambios de pH cuando se agrega álcali o
ácido. Los mejores tampones en el margen de pH de 4 a 10 son los que contiene un ácido débil con su
base conjugada; o una base débil con su ácido conjugado. Son importantes las siguientes propiedades de
los tampones:
(a) aquella mezcla que tenga una proporción [base]/[ácido] = 1, tiene el máximo de tamponamiento contra
ácidos fuertes y bases fuertes y su pH es igual al pKa del ácido componente;
(b) las mezclas con una proporción [base]/[ácido] entre 0.1 y 10, tiene un tamponamiento significativo y su
pH cae entre 1 unidad por arriba y por debajo del pKa del ácido componente;
(c) el pH de cualquier mezcla de este tipo se calcula aplicando al fórmula de Henderson-Hasselbalch, pH
= pKa + log [base]/[ácido], donde pKa es el valor de pKa del ácido componente.

53
En la elección de un tampón para estabilizar el pH de una mezcla de reacción, se debe cuidar que
sus componentes no interfieran con la reacción de ninguna forma. De varias mezclas tampón no
perjudiciales, se escogerá aquella cuyo componente ácido posea, a la temperatura de trabajo, un valor de
pka muy cercano al pH requerido.
Para preparar una mezcla tampón, en vez de neutralizar parcialmente un ácido débil con álcali, es
más conveniente mezclar una determinada cantidad de ácido débil en solución, con una cantidad de su
sal cuyo anión es su base conjugada y cuyo catión sea neutro La composición real de un tampón requerido
se calcula a partir de la ecuación de Henderson-Hasselbalch y la concentración de sus componentes
elegidos para dar una mezcla con capacidad tampón lo suficientemente grande como para mantener un
pH constante durante el tiempo que dura el experimento.
7.1. ACCION BUFFER.- Si consideramos la acción buffer de un ácido débil (HX) y su sal (NaX):
HX H+ + X- (Reacción 1: ionización del ácido)
NaX Na+ + X- (Reacción 2: ionización de la sal)
El ácido se ioniza solo en una cantidad muy limitada y la sal se considera completamente ionizada.
Por tanto, si consideramos un tampón formado por ácido acético y acetato de sodio, la concentración de
ácido es casi la misma que se agregó a la mezcla, y de igual modo la concentración del ion acetato puede
ser considerado igual a las concentraciones de la sal añadida.
En este caso, los iones H+ son absorbidos por la sal y los iones OH- son absorbidos por el ácido.
La adición de iones H+ (como HCl, que se disocia completamente), produce la reacción 1 "en la
dirección inversa"; los iones H+ se combinan con los aniones CH3COO- (X-) procedentes de la sal para
formar el ácido no disociado (HX) o CH3COOH y, por esto, la concentración del ion H + permanece más o
menos constante.
Cl- + H+ HCl
CH3COO- + H+ CH3COOH
Inversamente, la adición de OH- (como NaOH) hace que la reacción 1 vaya hacia la derecha; los
iones OH- se combinan conos iones H+ para formar agua y por tanto, la concentración del ion H +
permanece más o menos constante. (En buffer de una base débil y su sal, es la base la que tampona
frente a los iones H+ y la sal frente a los iones OH-).
CH3COOH CH3COO- + H+ (poco disociado, equilibrio a la izquierda)
+ +
NaOH Na+ + OH- (muy disociado, equilibrio a la derecha)
CH3COONa H 2O

54
Como el NaOH se disocia en forma completa, por ser bases fuertes, su OH - forma H2O con el H+
del ácido acético. La mayor parte del ácido acético no está disociado porque es débil, pero como sus H +
son captados inmediatamente por el OH- para formar agua, esto permite que la disociación del ácido
acético continúe y continúe hasta que finalmente todo el ácido acético es convertido e acetato de sodio.
El constituyente del buffer que absorbe iones H+ es frecuentemente referido como "reserva alcalina"
y el constituyente que absorbe los iones OH- es la "reserva ácida".
Los buffer tienen una capacidad tamponante limitada. Cuando se añade una cantidad equivalente
de ácido a la "reserva alcalina", la acción tamponante es pobre en la región ácida. A la inversa, cuando
se añade una cantidad equivalente de base a la "reserva ácida" la acción amortiguadora es baja en la
región alcalina.
7.2. CAPACIDAD TAMPON.- Las soluciones amortiguadoras difieren en su capacidad para resistir los
cambios de pH, por lo que Van Slyke introdujo el término capacidad tampón, que se define como los
equivalente gramo por litro de ácido fuerte o base fuerte que se requieren para alterar 1 unidad de pH a 1
litro de amortiguador 1 N. Está dad por la reacción:
𝑑𝐵
𝐶. 𝑇. =
𝑑𝑝𝐻
siendo dB el incremento (en equivalente gramo por litro) de base o ácido fuerte añadido a la solución
tampón; y el dpH el incremento resultante de pH. Una solución tiene una capacidad tampón de 1 cuando
un litro de la misma necesita 1 equivalente gramo de un ácido o de una base fuerte para experimentar un
cambio de pH en una unidad.
7.3. FUERZA IONICA Y AMORTIGUADORES.- La constante Ka (constante de ionización del ácido)
depende en gran parte de la concentración total de iones en la solución. Los iones tienden a atraer iones
de carga opuesta. Alrededor de un ion dado existe una "atmósfera iónica" formada por iones de carga
opuesta. Por tanto, el pKa varía según la fuerza iónica (I).
La fuerza iónica se define como:
𝐼 = ½ Σ𝐶𝑖𝑍𝑖2
donde Ci es la concentración de la variación iónica i y Zi es la carga de este ion. Por tanto, para sales
monovalentes, la fuerza iónica es igual a la concentración molar de la sal.
Ejm. Prepare amortiguador acetato de sodio, de pH 5 con un fuerza iónica de 0.1.
Método 1: Disuelva 0.1 mol de NaOH o de acetato de sodio en 800 ml de agua aproximadamente. Añada
ácido acético hasta pH 5. Afore a 1 litro.
Método 2:
[Sal]
𝑝𝐻 − 𝑝𝐾𝑎 = 𝑙𝑜𝑔
[Sal]
5 − 4.7 = 𝑙𝑜𝑔

55
[Sal]
0.3 = 𝑙𝑜𝑔
[Sal]
𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑜𝑔 0.3 =
[Sal]
2=
En vista de que sal = 0.1 M, ácido = 0.05 M. Añada 0.1 mol de acetato de sodio, 0.05 mol de ácido
acético, y afore a un litro.
Ejm. Prepare un amortiguador fosfato de pH 7.4 con una fuerza iónica de 0.05.
𝐼 = ½ Σ𝐶𝑖𝑍𝑖2
½ [Na+] + ½[H2PO4-] + 4/2[HPO4=] = 0.05
Como el pKa del fosfato es 6.8, para una fuerza iónica de 0.05,
[HPO4=]
𝑝𝐻 − 𝑝𝐾𝑎 = 0.6 = 𝑙𝑜𝑔
[H2PO4-]
tomando antilogaritmos:
[HPO4=]
=4
[H2PO4-]
Para que se respete la neutralidad eléctrica:
[𝑁𝑎+] = [H2PO4-] + 2[HPO4=]
Introduciendo estas dos últimas ecuaciones en la primera:
½[H2PO4-] + 4[H2PO4-] + 8[H2PO4-] = 0.05
13[H2PO4-] = 0.05
por tanto, [H2PO4-] = 0.00385. Empleando la tercera ecuación se despeja [HPO4=].

56
Para obtener un amortiguador que tenga la fuerza iónica buscada, diluya hasta 1 litro 0.00385 mol
de NaH2PO4 y 0.0154 mol de Na2HPO4.
8. CUESTIONES PRACTICAS SOBRE CURVAS DE TITULACION
8.1. LIMITES PRACTICOS DE LAS CURVAS DE TITULACION.- Si en la titulación se usan ácido fuertes
o bases fuertes 0.1 M, las curvas se aproximan asintóticamente al pH 1 o a pH 13, después de producirse
la neutralización completa. En forma similar, los límites para las soluciones 0.01 M serán pH 2 o pH 12 y
por tanto, valores de pKa por debajo de 2 o por encima de 12 no pueden ser determinados usando
soluciones 0.01 M.
8.2. CORRECCION POR SOLVENTE.- Se deben corregir las curvas experimentales de titulación para
tomar en cuenta la cantidad de ácido o base usados en la titulación del solvente, que generalmente es
agua destilada. esto se hace de la siguiente manera:
a. Dibuje las curvas de titulación para los mismos volúmenes de muestra.
b. Seleccione un valor cualquiera de pH en la curva para la muestra y anote el volumen de ácido o base
usado; denomine esto Xml. En la misma forma, anote la cantidad de ácido o base consumida para
llevar el agua al mismo valor de pH; denomine esto Yml.
c. La cantidad neta de ácido o base consumida en la titulación de la muestra está dada por (X - Y) ml.
Repita esto para varios valores de pH y haga la curva correcta de titulación.
8.3. DETERMINACION DE pKa.- Es esencial el conocimiento del pKa de un ácido, para su debido uso
como tampón. Los valores de pKa pueden obtenerse por varios métodos, a partir de la curva de titulación:
a. El pH en el punto de inflexión en una curva de pH frente a equivalentes de base o ácido añadidos, es
igual al pKa y se puede leer directamente. Una forma más conveniente consiste en hacer el gráfico de
dB / dpH, que es el valor amortiguador en función del pH y cuando se obtiene un máximo este
corresponde al pKa.
b. El pKa es igual al pH al cual se ha titulado la mitad de ácido, es decir [HA] / [A -] = 1 . Este punto de
titulación medio se obtiene fácilmente de la curva de titulación si puede determinarse o calcularse el
punto final (conociendo los equivalentes de ácido añadido, o superponiendo 2 unidades de pH por
encima del punto aproximado de inflexión).
c. El pKa se puede calcular de cualquier punto de la curva de titulación sustituyendo los valores
experimentales de pH, [HA] y [A-] en la ecuación:
[𝐻𝐴]
𝑝𝐾𝑎 = 𝑝𝐻 + 𝑙𝑜𝑔
[𝐴-]
ó
[𝑆𝑎𝑙]
𝑝𝐾𝑎 = 𝑝𝐻 + 𝑙𝑜𝑔
Estos cálculos pueden hacerse para diferentes puntos de la curva de titulación, y tomarse para pKa la
medida de estos valores. A valores extremos de pH (por encima de 10 y por debajo de 3) el ácido o
base requerido para titular el disolvente solo a cada pH debe respetarse la cantidad añadida a la
solución.
d. El cociente sal / ácido puede calcularse experimentalmente y se puede hacer un gráfico de log 10 sal /
ácido en función de pH. La intersección en el eje es el valor de pKa.

57
PARTE EXPERIMENTAL
OBJETIVOS
1. Determinar el pH de soluciones utilizando los métodos colorimétricos (indicadores de pH) y
poteciométricos.
2. Reconocer la capacidad amortiguadora de aminoácidos y proteínas.
3. Relacionar los conocimientos adquiridos del funcionamiento de los tampones de importancia biológica.
REACTIVOS
 Soluciones tampón de pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10
 Indicador universal
 Hidróxido de sodio o,1 M
 Acido clorhídrico 0,1M
METODO DE TRABAJO
a) ESCALA PATRÓN
Preparar una batería de 8 tubos de ensayo y colocar en cada tubo 1 ml de solución tampón de pH 3
hasta 10, Adicionar 5 gotas de indicador universal y 9 ml de agua destilada.
b) EXPERIMENTO I
Preparar una batería de 4 tubos de ensayo:
TUBO 1: 5 gotas de indicador universal + 10 ml de agua
TUBO 2: 5 gotas de indicador universal + 10 ml de tampón de pH 7,0
TUBO 3: 5 gotas de indicador universal + 10 ml de agua
TUBO 4: 5 gotas de indicador universal + 10 ml de tampón de pH 7,0
Determinar el pH de cada solución y anotar el resultado en la tabla.
c) EXPERIMENTO II
TUBO 1: adicionar 1 gota de NaOH 0,1 M
TUBO 2: adicionar 1 gota de NaOH 0,1 M
Observar, determinar el pH y anotar el resultado en la tabla.
Soplar el aire expirado, por 15 segundos en el tubo 1 y por 1 minuto en el tubo 2.
Observar, el cambio de color, y determinar el pH y anotar el resultado en la tabla
TUBO 3: adicionar 1 gotas de HCl 0,1 M
TUBO 4: adicionar 1 gotas de HCl 0,1 M
Observar el cambio de color, determinar el pH y anotar el resultado en la tabla.
Continuar la adición de HCl al tubo 4, gota a gota, hasta obtener el color del tubo 3.

58
Determinar cuantas gotas de HCl deben ser adicionadas para obtener la misma coloración que el tubo
3.
pH
Tubos Muestra NaOH

Inicial Aire HCl 0,1M Nº gotas
0,1M
Tubo 1 Agua destilada + 1 gota de NaOH 0,1 M

+ aire expirado por 15 segundos
Tubo 2 Tampón de pH 7,0 + 1 gota de NaOH

0,1M + aire expirado por 1 minuto
Tubo 3 Agua destilada + 2 gotas de HCl 0,1 M
Tubo 4 Tampón de pH 7,0 + 2 gotas de HCl 0,1

M
Nº de gotas de HCl para obtener el pH
del tubo 3
d) MEDICION DEL pH DE MUESTRAS BIOLOGICAS
 Introducir un extremo de la tira de papel indicador de pH en la sustancia a investigar.

 Compare con la escala de colores, del papel indicador de pH especial.
 Anote sus valores en el siguiente cuadro:
SUSTANCIA VALOR pH REACCIÓN COLOR

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INFORMACION ADICIONAL: Listado de soluciones indicadoras
INDICADOR COLOR ACIDO INTERVALO pH COLOR BASICO

Acido pícrico Incoloro 0.1 – 0.8 Amarillo
Rojo para-metileno Rojo 1.0 – 3.0 Amarillo
Azul de timol Rojo 1.8 – 2.8 Amarillo
Amarillo de metilo Rojo 2.9 – 4.0 Amarillo
2,6-nitrofenol Incoloro 2.0 – 4.0 Amarillo
Anaranjado de metilo Rojo 3.1 – 4.4 Amarillo-naranja
Azul de bromofenol Amarillo 3.0 – 4.0 Azul purpura
Rojo de congo Azul 3.0 – 5.0 Rojo
Anaranjado de etilo Rojo 3.4 – 4.5 Amarillo
Rojo de alizarina-5 Amarillo 3.7 – 5.0 Purpura
Verde de bromocresol Amarillo 3.8 – 5.4 Azul
Rojo de metilo Rojo 4.2 – 6.2 Amarillo
Rojo de cloro fenol Amarillo 4.8 – 6.4 Rojo
Para-nitrofenol Incoloro 5.0 – 7.0 Amarillo
Azul de bromotimol Amarillo 6.0 – 7.6 Azul
Rojo de fenol Amarillo 6.4 – 8.0 Rojo
Azul de timol Amarillo 8.0 – 9.6 Azul
Fenolftaleína Incoloro 8.0 – 9.8 Rojo-violeta

60
CUESTIONARIO
1) Colocar en orden decreciente la acidez de las siguientes soluciones: ácido acético 1 M, agua pura,
hidróxido de sodio 1 M y ácido clorhídrico 1 M.
2) Colocar en orden decreciente de acidez las siguientes soluciones: ácido acético 100 mmol, hidróxido
de amonio 10 mmol, ácido clorhídrico 10 M y agua.
3) Calcular cuantos iones H+ y iones OH- están presentas en una solución de HCl 0,001 M.
4) Calcular la concentración de protones, en moles por litro en una solución 1 M de ácido acético,
sabiendo que la Ka del ácido acético a 25ºC es de 1,86 x 10-5.
5) Calcular el punto isoeléctrico de la glicina sabiendo que pKa1 = 2,4 y pKa2 = 9,7.
6) Calcular el valor del pH de una solución de a) 0,001 M de ácido sulfúrico y b) 0,001 M de hidróxido de
sodio, asumiendo que ambos solutos están completamente ionizados. ¿Cual será el valor de pH de la
solución resultante de la mezcla de 25 ml de la solución de ácido sulfúrico con 20 ml de la solución de
hidróxido de sodio?.

61
PRÁCTICA 04: ESPECTROFOTOMETRIA
INTRODUCCIÓN
Muchos experimentos en bioquímica dependen de la absorción de la luz monocromática, de una
solución, en la región visible y ultravioleta del espectro electromagnético. Muchas moléculas de interés
biológico absorben la luz en la longitud de onda comprendida entre 200 - 800 nm ó 2000 - 8000 Å. Por
ejm., purinas, pirimidinas y ácidos aromáticos, así mismo los ácidos nucleicos y las proteínas. Otros ejm.,
son las hemoproteínas (citocromos, hemoglobina y mioglobina) carotenoides y esteroides.
Muchos compuestos, sean o no coloreados, tienen la capacidad de absorber luz de una
determinada longitud de onda; pero en otras casos es necesario transformar la sustancia a un derivado
coloreado, usando un reactivo adecuado.
Tanto el color (colorimetría) como la transmitancia (fotometría) de la luz de una solución pueden
usarse como medida de su concentración.
La colorimetría es un procedimiento por el cual una solución coloreada de un material de
concentración desconocida se compara, mediante el color, con un estándar que contiene una
concentración conocida del mismo material. Hoy se usa poco ésta técnica. La mayor parte de
procedimientos analíticos usan el principio fotométrico, es decir, la medida de potencial transmisor de luz
de una solución coloreada, a una longitud de onda espectral específica. Muchos aparatos llamados
"colorímetros" son realmente fotómetros según la estricta definición. Si la longitud de onda puede
seleccionarse a lo largo de un intervalo continuo, interponiendo un prisma o una red de dispersión, entre
la fuente de luz y la muestra, el instrumento se denomina "espectrofotómetro".
En fotometría o en espectrofotometría se compara la transmitancia de la luz a través de una
solución que contiene materiales absorbentes con la transmisión de la misma luz a través de otra solución
que solo contiene disolvente. Esta última se denomina solución de referencia o reactivo blanco o
simplemente blanco; debe ser idéntica a la primera excepto en que carece de los materiales absorbentes
de la luz que han de estudiarse. Ambas soluciones deben medirse bajo idénticas condiciones de longitud
de onda, intensidad de luz incidente y anchura de cubeta (longitud de paso de luz).
1. ENERGIA RADIANTE
Las radiaciones electromagnéticas, conocidas corrientemente como luz, están compuestas por
paquetes de energía llamados fotones o cuantos. De acuerdo a la longitud de onda, se conocen tres
zonas: a) Ultravioleta (UV), comprende radiaciones de 100 a 300 nm de longitud; b) Luz Visible (color),
está constituida por radiaciones electromagnéticas de 390 a 770 nm de longitud de onda y c) El Infrarrojo,
entre 2000 a 30000 nm.
Una onda de luz posee campos eléctricos y magnéticos oscilantes que están en fase, pero son
perpendiculares a la dirección de propagación. La longitud de onda, de la luz, se da en cm y se relaciona
con la velocidad de luz en el vacío, en cm/seg, y con la frecuencia, en ciclos/seg:
𝑐
𝜆=
𝑣
Longitud de onda (), es la distancia entre los nudos de dos ondas de radiación adyacente. Se
mide en cm, nm, mm, mm, Å.

62
La velocidad (c), de propagación en el vacío es de 3 x 1010 cm/seg y algo menor al atravesar

sustancias transparentes.
La frecuencia (v), es el número de oscilaciones por segundo. Se expresa en ciclos/seg.
La luz interacciona con la materia principalmente a través del campo eléctrico oscilante. Para fines
de absorción debe tenerse en cuenta que la luz es un paquete de energía o fotón hv, donde h es la
constante de Planck, 6.627 x 10-27 ergios segundo, y v es la frecuencia. De aquí se desprende que la
energía de la luz es directamente proporcional a la frecuencia:
𝐸 = ℎ𝑣
y según la ecuación anterior inversamente proporcional a la longitud de onda.

Hay absorción de luz cuando la energía del fotón, hv, corresponde a la diferencia entre los niveles
de energía de la molécula.
2. LEYES DE ABSORCION
En Química Biológica se emplea la fotometría principalmente para regular o controlar la concentración
de diversas especies en mezclas de reacción. La absorción de luz a una longitud de onda dada, está
relacionada con la concentración de especies absorbentes por medio de dos leyes.
2.1. LEY DE LAMBERT.- Lambert estudió la cantidad de luz monocromática absorbida por un cuerpo y
enunció la ley que dice: "la fracción de luz absorbida es proporcional al espesor del absorbente x, e
independiente e la intensidad de luz", o en otros términos, "la proporción de luz incidente, absorbida por el
medio, es independiente de su intensidad y cada sucesiva capa unidad de medio, absorbe una fracción
igual de la luz que pasa a través de él". Por ejm., si la luz incidente es 100% y cada capa unidad de espesor
x, absorbe el 20% de la luz incidente, la luz transmitida es el 80%. Para otras capas unidad de espesor x,
la luz transmitida disminuirá como sigue: 64%, 51.2%, etc. que es la secuencia (0.8) 0, (0.8)1, (0.8)2, (0.8)3,
etc. Lo que conduce a la expresión matemática:
𝐼 = 𝐼0 𝑥 𝑒-αx
Donde:
I0 = Intensidad e la luz incidente
I = Intensidad de la luz transmitida
x = grosor de la capa en cm
α = coeficiente de absorción del medio
En forma logarítmica tenemos:
𝐼0
𝑙𝑛 = = 𝛼𝑥
𝐼

63
Al pasar al sistema logarítmico de base 10, el coeficiente de absorción c, se convierte en

coeficiente de extinción molar k
𝛼 = 2.303 𝑘
o sea
𝐼0
𝑙𝑜𝑔10 = 2.303 𝑘𝑥 = 𝐾𝑥
𝐼
por tanto
𝐼0
𝑙𝑜𝑔10 = 𝐾𝑥
𝐼
log I0/I es la densidad óptica (D.O.) o absorbancia (A). A es directamente proporcional a x.
2.2. LEY DE BEER.- Beer estudió la influencia de la concentración de la solución de una sustancia
coloreada sobre la transmisión de la luz monocromática y halló la misma relación entre la transmisión y el
espesor de la capa atravesada. Teniendo en cuenta que la luz se absorbe solamente cuando un fotón
choca con una molécula, la ley de Beer puede anunciarse como sigue: "cuando un rayo de luz
monocromática pasa a través de un medio absorbente, la cantidad de luz absorbida o la probabilidad de
absorción es proporcional al número de moléculas c, contenidas en el haz de luz".
𝐼 = 𝐼0 𝑒-Kc
donde: c = concentración en mol/l.
Cuando en la ley anterior, la transmitancia disminuye exponencialmente con el número de

moléculas absorbentes. Por ejm., en el caso anterior se hizo variar el espesor de la capa, ahora si hacemos
que el espesor de la capa sea constante, es decir que sea 1 cm y variamos la concentración de la solución
de la sustancia coloreada tenemos que: si consideramos la Io como 100% y la absorbancia de cada una
de las concentraciones c, es 50% de la luz incidente, la luz transmitida es 50%. Para otras concentraciones
c, la luz transmitida disminuirá como sigue: 25%, 12.5%, 6.25%, 3.13%, etc.
La ley de Beer es exacta sólo para luz monocromática y en muchos casos no se cumple sobre todo
a concentraciones altas.
2.3. LEY DE BEER - LAMBERT.- Es evidente que pueden combinarse las leyes de Beer y Lambert, ya
que tanto c como K incluyen un factor de concentración, de donde:
𝐸𝑐=𝐾
E = coeficiente de extinción molar
c = concentración en moles/litro

64
De aquí se deduce:
𝐼 = 𝐼0 𝑒-Ecx
𝐼0
𝑙𝑜𝑔10 = 𝐸𝑐𝑥
𝐼
𝐼0
𝑙𝑜𝑔10 =𝐴
𝐼
por consiguiente:
𝐴 = 𝐸𝑐𝑥
La ley combinada de Beer - Lambert nos dice que: "la fracción de luz incidente absorbida por una
disolución, a una determinada longitud de onda, está relacionada con el espesor de la capa absorbente x,
y con la concentración c, de la especie que absorbe". La Ley de Beer-Lambert supone que la luz incidente
es paralela y monocromática, y que las moléculas del disolvente y del soluto están orientadas al azar.
2.4. COEFICIENTE DE EXTINCION MOLAR.- Por definición, el coeficiente de extinción molar E, es la
densidad óptica (log10 I0 / I) de una solución 1 M de la sustancia con un recorrido luminoso de 1 cm y
generalmente se escribe E 1cm 1mol/l. La densidad óptica carece de dimensión, por lo que E se expresa en
términos de litros (concentración x longitud). E se expresa en unidades de litros moles -1cm-1; es decir, en
cm2 / milimol y es numéricamente equivalente a la densidad óptica de una solución milimolar de la
sustancia con un recorrido luminoso de 1 cm. Con frecuencia se utiliza el término E 1cm 1%, que es la
extinción de una solución al 1% (1 g/100 ml) cuando el camino recorrido por la luz es igual a 1 cm.
2.5. COEFICIENTE DE EXTINCION ESPECIFICA.- En muchas ocasiones no se conoce el peso molecular
de algunos compuestos tales como proteínas y ácidos nucleicos presentes en una mezcla y entonces se
acostumbra expresar la concentración en g/l. En estos casos, se emplea el coeficiente de extinción
específico. Se le define como la densidad óptica de una solución al 10% (10g/l) del compuesto cuando el
recorrido de la luz es 1 cm, E 1cm 10g/l.
2.6. TRANSMITANCIA (T).- Es la capacidad de una solución para transmitir la luz. Se define como la
relación entre la intensidad de la luz que sale de la solución y la intensidad de luz entra a ella.
𝐼
𝑇=
𝐼0
Si la solución es absolutamente transparente I = 1, y su transmitancia será 1; este valor es tanto
menor de 1 cuanto mayor sea la luz absorbida por la solución. Se acostumbra, también, expresar la
transmitancia como porcentaje, es decir, porcentaje de luz transmitida:
𝐼 𝑥 100
𝑇% =
𝐼0
Por tanto, los valores de T % van de 0 a 100%. Como la transmitancia va de 0 a 100%, la expresión

65
de Beer - Lambert será:

𝐼0 100
𝐴 = 𝑙𝑜𝑔 = 𝑙𝑜𝑔 = 𝐸𝑐𝑥
𝐼 𝑇%
2.7. ABSORBANCIA (A) o DENSIDAD OPTICA (D.O) o EXTINCION (E).- Es la cantidad de luz absorbida
por una solución, equivalente al logaritmo negativo de la transmitancia y se mide en unidades de 0 a 2 en
la escala de absorción; 2 es el logaritmo de 100% de transmitancia. Este es 𝐴 = −𝑙𝑜𝑔𝑇 ó 𝐴 = −𝑙𝑜𝑔𝐼/𝐼0
puede también calcularse restando a 2 el logaritmo del porcentaje de transmitancia;
𝐼0 𝐼
𝐴 = 𝑙𝑜𝑔 = 𝑙𝑜𝑔 = 𝐸𝑐𝑥
𝐼 𝑇
Si se construye una gráfica de A en función de c, se obtiene una recta, pues la absorbancia es
directamente proporcional a la concentración. La pendiente de la recta es Ex, y el valor de la ordenada
para c = 0 se considera cero.
Ejm. En un espectrofotómetro se ha ajustado al 100% la transmitancia de luz con agua (blanco); la lectura
de una solución de K2Cr2O7 en el mismo espectrofotómetro indica que T% = 50 y la absorbancia es 0.301.
Solución: Hemos dicho que -log T ó -log I/I0 se denomina absorbancia. En este ejemplo:
𝐼 = 50
𝐼0 = 100
Como:
𝐼 𝐼0
𝐴 = −𝑙𝑜𝑔 = 𝑙𝑜𝑔
𝐼0 𝐼
Tenemos:
𝐴 = 𝑙𝑜𝑔𝐼0 − 𝑙𝑜𝑔𝐼
Reemplazando tenemos:
𝐴 = 𝑙𝑜𝑔100 − 𝑙𝑜𝑔50
𝐴 = 2 − 1.69897
𝐴 = 0.301
Ya que en la práctica, siempre se ajusta la transmitancia a 100% (cuyo log = 2), la absorbancia se
puede calcular a partir de:
𝐴 = 2 − 𝑙𝑜𝑔𝑇%

66
2.8. LIMITACIONES DE LA LEY DE BEER - LAMBERT.- Aunque la ley de Lambert se cumple en todos
casos hasta hoy estudiados, la de Beer tiene algunas alteraciones. Algunas veces la relación lineal entre
la absorbancia y la concentración predicha por la ley de Beer, no se cumple. Los tres tipos de desviaciones
son: a) instrumentales, que pueden ser ópticos, mecánicas o ambas, b) las relacionadas con las muestras
y; c) experiencia del investigador.
2.8.1. Desviaciones Instrumentales.- La ley de Beer solo se cumple para luz monocromática. En la
práctica nunca se obtiene luz totalmente monocromática. La monocromaticidad puede variar cambiando
el ancho de la rendija.
Para la región visible del espectro se usan los fotocolorímetros. Difieren de los espectrofotómetros
en que usan filtros para obtener luz monocromática en lugar de un prisma o red y una rejilla. Los filtros
dejan pasar una ancha banda de luz; por ejm., un filtro de 540 nm deja pasar una luz que oscila entre 525
y 555 nm. Por el contrario las rendijas de los espectrofotómetros ayudan a seleccionar mejor la longitud
de onda a usarse, por lo cual se puede suponer que con estos aparatos la ley de Beer tiene una menor
desviación.
También, la ley de Beer se desvía con la luz no paralela.
2.8.2. Desviaciones Debidas a la Naturaleza de la Muestra.- Se deben al cambio en la concentración
efectiva de la especie absorbente o la interferencia debida a los productos de alguna reacción secundaria.
Muchas especies absorbentes contienen grupos ácidos o básicos. Puesto que los conjugados del
par ácido-base tienen una absorción diferente, si no se controla el pH habrá desviaciones. De igual modo,
si el equilibrio de la especie depende de la temperatura, habría desviaciones si la temperatura sufre
cambios. Si las moléculas del absorbente se absorben a las paredes de la celda durante el curso de la
observación, disminuyen la concentración efectiva en la disolución y producen desviaciones aparentes de
la ley de Beer, Los disolventes también pueden cambiar las características de absorción. Las soluciones
muy concentradas, que originan un color muy intenso, también originaran desviaciones ya que la ley se
cumple solo hasta cierto límite máximo de concentración, característico para cada sustancia.
2.8.3. Desviaciones Debidas al Investigador.- Principalmente se deben a una mala elección de longitud
de onda. La longitud de onda de la luz empleada debe coincidir con el máximo de absorción de la solución.
Esto permite también conseguir la sensibilidad óptima.
3. RANGOS ADECUADOS DE CONCENTRACION
Es muy difícil medir la concentración de las soluciones con exactitud por espectrofotometría, ya que
en algunos casos la intensidad de radiación transmitida I, es muy pequeña, mientras en otras es muy alta.
En la práctica, I debe de estar entre el 10% y el 90% de Io (es decir, la absorbancia debe de estar entre
1.0 y 0.05), pero las medidas más seguras se realizan cuando I » 50% de Io (es decir, absorbancia = 0.3).
estas condiciones pueden conseguirse modificando la concentración del compuesto, el espesor de la
célula o cambiando la longitud de onda de la radiación (es decir, variando E). El primer procedimiento es
el que se realiza con más frecuencia.
4. CALCULO DE LA CONCENTRACION DE UNA MUESTRA PROBLEMA
Existen tres formas de cálculo.
4.1. MEDIANTE EL FACTOR DE CALIBRACION (Fc).- Resulta de dividir la concentración del estándar
entre la absorbancia del estándar:

67
𝐶𝑠𝑡
𝐹𝑐 =
𝐴𝑠𝑡
el factor obtenido se multiplica por la lectura o absorbancia del o de los tubos que contienen la solución
problema, obteniéndose así la concentración de la muestra o muestras. Para expresar la concentración
en porcentaje, se toma en cuenta el volumen utilizado 100/V.
Según la Ley de Beer - Lambert tenemos que:
𝐴𝑠𝑡 = 𝐾𝑠𝑡 . 𝑋𝑠𝑡 . 𝐶𝑠𝑡

𝐴𝑚 = 𝐾𝑚 . 𝑋𝑚 . 𝐶𝑚
donde:
Ast = absorbancia del estándar o patrón
Am = absorbancia de la muestra problema
Cst = concentración del estándar o patrón
teniendo en cuenta que el espesor X es constante y que la tratarse de soluciones de la misma sustancia
el coeficiente de extinción K, será el mismo. Relacionando las dos expresiones tenemos:
𝐴𝑠𝑡 𝐶𝑠𝑡
=
𝐴𝑚 𝐶𝑚
despejando:
𝐶𝑠𝑡
𝐶𝑚 = 𝐴𝑚 .
𝐴𝑠𝑡
Ya que tanto la lectura del problema como del patrón son equivalentes a la absorbancia, se tiene:
𝐶𝑠𝑡
𝐶𝑚 = 𝑙𝑒𝑐𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑑𝑒 𝑚 .
𝑙𝑒𝑐𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑠𝑡
Nótese que Cst / Ast es un constante y puede usarse como un factor sobre todo cuando se va a
determinar la concentración de una serie de muestras. Por tanto, la ecuación anterior se puede reducir a :
𝐶𝑚 = 𝐴𝑚 . 𝐹𝑐
donde: Fc = factor de calibración (Fc = Cst/Ast); esta expresión referida a porcentaje se escribe:
𝐶𝑠𝑡 100
𝐶𝑚 = . . 𝐴𝑚
𝐴𝑠𝑡 𝑣
v = volumen de la muestra utilizada para la determinación.

68
4.2. MEDIANTE LA CURVA DE CALIBRACION.- En este caso se utilizan varios patrones de

concentraciones progresivas y un blanco (el blanco contiene todos los componentes de la muestra menos
la sustancia a determinar). Luego se realiza la lectura (de absorbancia) usando el filtro o la longitud de
onda para la cual la sustancia tiene la máxima absorción. Se registra los valor de absorbancia en una
tabla.
Luego se construye una gráfica en un sistema de coordenadas, colocando las ;lecturas
correspondientes a los patrones en el eje de las "y" (eje de ordenadas) y las concentraciones de los mismos
en el eje de las "x" (eje de abscisas), con lo cual se obtiene una recta, que pasa por cero si la sustancia
obedece la ley de Beer - Lambert.
La muestra problema dará una lectura o absorbancia determinada que se busca en el eje de las
ordenadas de la gráfica anterior, luego por este punto se traza una perpendicular a dicho eje hasta
encontrar la curva (trazada con la lectura y concentración de los patrones). En seguida, por este punto de
intersección se traza una paralela al eje de ordenadas hasta tocar el eje de abscisas (eje de
concentración). Por lo tanto, la concentración de la muestra problema está dada directamente por este
punto del eje de abscisas.
En la curva de calibración puede observarse que hay una parte de la curva dentro de la que se
cumple perfectamente la ley de Beer - Lambert, es la parte recta que corresponde a una función lineal. Sin
embargo, puede también aplicarse a valores superiores por extrapolación siempre que las desviaciones
con respecto a la recta no sean muy grandes. Además el uso de la gráfica elimina los errores que podrían
aparecer como consecuencia del uso del cálculo de proporcionalidad en una región donde no se cumple
la ley de Beer - Lambert. Esto último corrobora la norma general que preconiza el uso de soluciones patrón
para las comparaciones colorimétricas cuyas densidades ópticas sean lo más cercanas posible al valor
del problema.
4.3. MEDIANTE LA ECUACION A = Ecx.- Ecuación obtenida de la combinación de las leyes de Beer -
Lambert (en la que x es un valor constante por ser los tubos uniformes, o por usarse un solo tubo para
hacer la lectura). Para esto se calcula una E relativa mediante 𝐸 = 𝐴/𝑐, para los patrones, (los valores
hallados deben ser iguales si la sustancia cumple la ley de Beer).
El coeficiente de extinción debe mantenerse constante para un intervalo de concentraciones de
patrones y problemas. Una vez obtenido un valor E, la concentración de la muestra se determina mediante
la ecuación que sigue:
𝐴
𝑐=
𝐸
5. FOTOCOLORIMETROS
Son instrumentos para medir la absorción de luz. Tienen un filtro coloreado para producir luz
monocromática. Estos filtros producen una ampplia banda de luz.
En estos aparatos la luz blanca de una lámpara de tungsteno para a través de una rendija, luego a
través de un lente condensador, hasta obtener un rayo paralelo que incide sobre la solución que se
investiga, la cual se ha colocado en una celda de absorción o cubeta. La cubeta es generalmente de vdrio
y las paredes por las que pasa el haz de luz son paralelas.

69
Después de la cubeta se halla el filtro. El algunos fotocolorímetros se hallan antes de la cubeta, por
ejm., en el Klett-Summerson. El filtro produce bandas angostas de transmisión y, por tanto, da luz
aproximadamente monocromática.
A continuación la luz llega a una fotocélula que genera una corriente eléctrica en proporción directa
a la intensidad de la luz incidente. Esta señal eléctrica pequeña se incrementa mediante un amplificador
y la señal amplificada pasa a un galvanómetro calibrado en una escala logarítmica que da directamente
medidas de absorbancias. Las fotocélulas usadas en fotocolorímetros no muy fino tienen una precisión de
aproximadamente 0.5%. La solución blanco se coloca primero en el fotocolorímetro y se ajusta el
galvanómetro a una absorbancia de cero. Luego se coloca la muestra y se lee directamente la absorbancia.
5.1. ELECCION DE LOS FILTROS.- Los filtros se seleccionan de modo que cumplan la ley de Beer. Para
esto se suelen emplear soluciones de la sustancia problema de diferentes concentraciones
determinándose con qué filtro se obtiene un máximo de absorbancia para un mínimo de diferencia en la
concentración entre 2 soluciones. Este filtro es el de máxima sensibilidad y el seleccionado para trabajar.
Por lo común, el máximo de absorción de las soluciones coloreadas ocurre en la región del color
opuesto (Tabla 1).
TABLA N° 1. RELACION ENTRE EL COLOR DE LA SOLUCION ESTUDIADA Y EL FILTRO ESCOGIDO

PARA EL ANALISIS COLORIMETRICO
COLOR DE LA SOLUCION FILTRO
Rojo - naranja Azul-Azul verdoso

Azul Rojo
Verde Rojo
Púrpura Verde
Amarillo Violeta
El fotocolorímetro de Klett - Summerson, usa comúnmente 3 filtros:

- Filtro azul (N° 42) que transmite luz entre 400 y 465 nm.
- Filtro verde (N° 54) que transmite luz entre 500 y 570 nm.
- Filtro rojo (N° 66) que transmite luz entre 640 y 700 nm.
El fotocolorímetro de Klett y Summerson da la lectura en unidades Klett que son proporcionales a

la absorbancia. Si se desea trabajar con absorbancia, se puede transformar a partir de las unidades Klett,
ya que:
1000 𝑥 𝐴
𝑈𝐾 =
2

70
2 𝑥 𝑈𝐾
𝐴=
1000
6. ESPECTROFOTOMETROS
Estos aparatos miden la absorción o la transmisión de la luz. Un espectrofotómetro usa una rejilla
o un prisma par obtener la luz monocromática.
En general consta de: a) una fuente de radiación (UV, luz visible, infrarrojo); b) un monocromador,
que mediante un prisma o red de difracción dispersa la luz en un espectro, y luego selecciona una longitud
de onda o un cierto intervalo de ese espectro y lo dirige hacia la sustancia problema y ; c) un sistema de
detección que transforma la energía luminosa que recibe, en energía eléctrica. En resumen, la luz
monocromática pasa por un tubo que contiene la solución problema y la luz transmitida es medida
empleando una célula fotoeléctrica. La corriente eléctrica producida por la luz transmitida es proporcional
a su intensidad, y se lee la corriente en un galvanómetro. Con estos aparatos es posible obtener un
espectro de absorción, determinando la absorbancia a diferentes longitudes de onda.
6.1. ESPECTROS DE ABSORCION.- Se llama espectro de absorción a la gráfica que representa la
absorbancia en función de la longitud de onda. Muchos compuestos contienen espectros característicos
de absorción en la región visible y ultravioleta, lo cual hace posible la identificación de dichos materiales
en una mezcla.
6.2. VALORACIONES ESPECTROFOTOMETRICAS.- El curso de una reacción química o la posición de
un equilibrio puede determinarse en forma rápida con un espectrofotómetro si puede medirse la absorción
de uno de los componentes. Como ejemplo tenemos las curvas de valoración de los indicadores:
𝐼𝑛- + 𝐻+ ⇌ 𝐼𝑛𝐻
donde las formas protonizadas o no protonizadas (o ambas) son coloreadas. Los máximos de absorción
para las dos formas suelen estar separados, por lo que se puede medir la concentración de cualquiera de
las formas. Si se disuelven cantidades iguales del indicador en tampones de diverso pH y se mide la
absorbancia en uno de los máximos de absorción, se puede calcular el pK. La determinación
espectrofotométrica del pK es el mejor método. El pK se debe determinar a diversas concentraciones para
comprobar las desviaciones de la ley de Beer.
6.3. ESPECTROFOTOMETRIA Y ENZIMAS.- Por las grandes ventajas de comodidad, sensibilidad,
amplio espectro espectral y una selección fina de longitud de onda, el espectrofotómetro se utiliza en
enzimología, principalmente, en tres tipos diferentes de determinaciones: a) se puede determinar la
concentración de un compuesto midiendo la densidad óptica a una longitud de onda bajo condiciones en
que no ocurran cambios y suponiendo que el coeficiente de extinción del compuesto es conocido; b) se
puede seguir el curso de una reacción en un sistema completo de ensayo, midiendo la velocidad de
formación o desaparición de un compuesto absorbente de luz. Para este tipo de medidas se dispone de
espectrofotómetros que representan gráficamente la densidad óptica frente a tiempo; c) un tercer tipo de
medida interesante para la identificación de compuestos requiere la determinación de la densidad óptica
en función de la longitud de onda. También este caso se dispone de instrumentos que trazan la curva
automáticamente

71
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO N° I. ESPECTROS DE ABSORCIÓN Y LONGITUD DE MÁXIMA ABSORBANCIA DE

DOS COLORANTES.
OBJETIVO:
Hallar la curva espectral de dos colorantes indicadores.
FUNDAMENTO
Si se mantiene constante el espesor (x) y la concentración (c), la absorbancia (A) dependerá de la
longitud de onda ( ); esto permite hallar la curva espectral, así como la longitud de onda de máxima
absorción del colorante.
Puesto que los compuestos coloreados presentan espectros de absorción característicos, la
selección cuidadosa de las longitudes de onda de máxima absorción permitirá analizar los componentes
de una mezcla de estas sustancias.
MATERIAL
1. Aparatos: Fotocolorímetro Klett-Summerson o Espectrofotómetro.
Tubos de ensayo
Fiolas
Gradillas
Pipetas
2. Reactivos: Azul de bromofenol 10 mg/ml.
Anaranjado de metilo 10 mg/ml.
Mezcla problema de los colorantes.
MÉTODO DE TRABAJO
Calibrar el fotocolorímetro o espectrofotómetro a cero utilizando agua destilada como blanco.
Luego, determinar la extinción de cada colorante, usando los diferentes filtros del fotocolorímetro (si se
usa espectrofotómetro se puede seleccionar a voluntad el intervalo de longitud de onda). Para esto utilizar
5 ml de cada solución colorante (azul de bromofenol y anaranjado de metilo 10 mg/ml). Recordar que cada
vez que se cambie de filtro o de longitud de onda es necesario graduar el aparato a cero con agua destilada
en la cubeta o tubo Klett.
Anote en forma tabular las absorbancias para cada filtro o para cada longitud de onda y para cada
solución, teniendo especial cuidado de anotar la longitud de onda de máxima absorbancia (si se desea
puede cambiar las UK en A).

72
Azul de bromofenol Anaranjado de metilo Mezcla de ambos
UK Ab UK Ab UK Ab
Filtro azul
Filtro verde
Filtro rojo
Para obtener el espectro de absorción y la longitud de máxima absorbancia, utilizar papel

milimetrado y grafique los valores de absorbancia de cada solución (corregidos para la absorción del
disolvente, si se usó otro en vez de agua) en las ordenadas en función de la longitud de onda que se
coloca en las abscisas. Luego uni los puntos con un trazo suave.
Anotar en la gráfica, la longitud de onda de máxima absorbancia para cada colorante.

73
EXPERIMENTO N° 2. DEMOSTRACIÓN DE LA LEY DE BEER Y CONSTRUCCIÓN DE LA CURVA DE

CALIBRACIÓN PARA DOS COLORANTES.
OBJETIVOS:
Poner en evidencia la ley de Beer - Lambert haciendo uso de concentraciones progresivas de un
colorante.
FUNDAMENTO
Si se mantiene constante la longitud de onda de máxima absorción, la absorbancia dependerá de
la concentración.
MATERIALES
1. Aparatos: Fotocolorímetro Klett-Summerson o Espectrofotómetro.
Tubos de ensayo
Fiolas
Gradillas
Pipetas
2. Reactivos: Azul de bromofenol 10 mg/ml.
Anaranjado de metilo 10 mg/ml.
Mezcla problema de los colorantes.
METODO DE TRABAJO
Preparar varias concentraciones de cada uno de los colorantes como se indica a continuación:
TUBO N° Bl 1 2 3 4 5
Azul de bromofenol o Anaranjado de metilo

10 mg/ml
-- 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Agua destilada (ml)
5 4.9 4.8 4.7 4.6 4.5
Coloque el filtro que dió la máxima absorbancia (580 nm para azul de bromofenol y 460 nm para
anaranjado de metilo) y lleve el fotocolorímetro a cero con agua destilada (tubo Bl). Enseguida lea la
extinción de cada solución. Anote las lecturas en forma tabular (transforme las unidades Klett en
absorbancias).

74
Calcular la concentración de azul de bromofenol y anaranjado de metilo de cada tubo, expresada

en mg/ml.
Concentración
Tubo N° UK Ab Fc
(mg/ml)
Bl
Haga una gráfica colocando la absorbancia en las ordenadas y la concentración del colorante en
las abscisas (curva de calibración). Hallar el factor de calibración.

75
CUESTIONARIO
1. Cuál es la finalidad y el fundamento de la técnica espectrofotmétrica?
2. Conceptúe: ¿banda de sensibilidad del método espectrofotométrico?
3. Un determinado compuesto presenta un máximo de absorción a 660 nm. Para una concentración 0.75
µmol/ml se obtuvo una absorbancia de 0.4. Sabiendo que el límite de sensibilidad del método utilizado
es de 0.1 µmol/ml a 3 µmol/ml, calcule la concentración de este mismo compuesto correspondiente
a una absorbancia de 0.85.
4. Tres mililitros de una solución de azul de metileno (sol. A) fueron diluidos a 7.5 ml con agua destilada
(sol. B). La absorbancia de la solución B a 550 nm fue de 0.4. Cómo determinaría Ud. la concentración
de la solución A?

76
PRÁCTICA 05: RECONOCIMIENTO DE ELEMENTOS

BIOGENESICOS Y CONSTITUYENTES MINERALES
I. INTRODUCCIÓN
Los Bioelementos como el C, H, O, N, S, P, al unirse mediante enlaces forman las biomoléculas
orgánicas como los Carbohidratos, Lípidos, Proteínas, Ácidos Nucleicos. Por otro lado, es
necesario señalar que ciertos elementos minerales se presentan en forma iónica dentro del
organismo, en este estado realizan funciones específicas como por ejemplo el Calcio (Ca2+) que
interviene en la excitabilidad muscular y en la coagulación sanguínea, el ión Sodio (Na+)
abundante en los líquidos intersticiales y el ión Potasio (K+) necesarios en la transmisión de
impulsos nerviosos, el Carbonato de Calcio (CaCO3) que forman los caparazones de los
moluscos, el Fosfato de Calcio (CaPO4) que forman los esqueletos de los animales superiores, el
Cu2+, Zn2+ y otros que actúan como cofactores enzimáticos en las vías metabólicas de la célula.
El agua juega un papel importante dentro de la célula y los organismos vivos, lugar donde se
producen las reacciones enzimáticas. Las sales del medio interno y las proteínas contribuyen en
la regulación del pH debido a que el medio interno es metabólicamente activo pudiendo cambiar
su pH, por lo cual es necesario conocer los valores normales del pH, así como poder determinar
el valor que presenta en cada fluido biológico.
II. OBJETIVOS
- Identificar cualitativamente los elementos biogenésicos más abundantes de los seres vivos.
- Comprobar la presencia de agua y sales minerales en organismos vivos.
- Determinar el valor de pH de muestras biológicas.
III. MATERIALES Y REACTIVOS

Del Laboratorio
 Tubos de ensayo
 Mechero
 Placas Petri
 Vasos de precipitado Tubos de ensayo Gradillas
 Pinzas de madera
 Pipetas volumétricas
 Papel indicador de pH.
 Agua destilada
 Solución de glucosa 1%
 Solución de almidón
Del estudiante (por subgrupo)
 2 hojas frescas de cucarda

 1 trocito de carne
 1 Gillette

77
 5ml de lejía
 5ml de jugo de limón
 5ml de jugo de camu camu
 5ml de orina fresca
 5ml de leche
 1 manzana
 1 papa
 50g de almidón
 1 huevo de gallina.
Materiales de limpieza y descarte de los estudiantes (por subgrupo)
 Detergente (100g)
 Lejía (1 frasco) Toalla pequeña
 Papel toalla
 Bolsas plásticas color negro
 Plumón de tinta indeleble punta fina.
i. IDENTIFICACIÓN DE ELEMENTOS BIOGENÉSICOS MAYORES: C, H, O, N
 Cortar una pequeña hoja de cucarda en pedacitos e introducirlos en un tubo de ensayo que
esté limpio y seco.
 Calentar el tubo en la llama de un mechero y observar con detenimiento a medida que se va
calentando, el desprendimiento de gas, al mismo tiempo note que en las paredes del tubo
se forman gotitas y en el fondo quedan residuos.
 Anote sus resultados y grafique sus observaciones.
Repita la experiencia utilizando trocitos de carne fresca de pollo, de res o de pescado.
¿Nota Usted la diferencia? ¿Qué indica la formación de gotitas de agua?
¿Qué elementos identificó en las experiencias realizadas?

78
¿Cómo los reconoció a cada uno de ellos?
Esquematizar lo observado y responder las preguntas anteriores:
ii. IDENTIFICACION DE BIOMOLECULAS INORGANICAS

B-1.- IDENTIFICACION DE CLORUROS
Ensayo control
En un tubo de ensayo mezclar 2 ml de solución de ClNa al 1% (solución patrón) con 1 o 2 gotas
de AgNO3 observar y anotar los resultados
 Anote sus resultados y grafique sus observaciones.

79
Observación:
Se forma un precipitado blanco lechoso de cloruro de plata, que se torna negro o gris (plata
oxidada), que luego se sedimenta en el fondo del tubo de ensayo. El cloruro de plata indica la
presencia de cloruro en solución patrón.
La ecuación química de esta reacción es:
Conclusión
Los cloruros se identifican con el AgNO3 con el que forma un precipitado blanco lechoso de cloruro
de plata.
IDENTIFICACION EN UNA MUESTRA BIOLOGICA
 Carbonizar una hoja de una planta. Las cenizas se trituran en un mortero.

 Las cenizas se mezclan con 5 ml de agua destilada. Luego se filtra la mezcla
 Al filtrado recogido en un tubo de ensayo, agregar unos 5 ml de agua destilada y 1 ó 2 gotas
de solución de AgNO3 al 0.5 %. Observar y anotar los resultados.
Esquematizar:
Observación:
Discusión:

80
Conclusión
BIBLIOGRAFIA
RECONOCIMIENTO DE CRISTALES DE OXALATO, FOSFATO Y CARBONATOS
 Centrifugar 10 ml de orina a 3000 rpm durante 5 minutos.

 Eliminar con mucho cuidado el sobrenadante evitando remover el sedimento.
 Tomar una a dos gotas del sedimento y colocarlo en una lámina portaobjeto.
 Cubrir con una laminilla o cubreobjeto.
 Observar a menor aumento (10x) y gran aumento (40x)
 Identificar los diferentes tipos de cristales: la orina normal contiene cristales y
componentes amorfos que precipitan al enfriarse la orina. Según el pH de la orina pueden
precipitar:
 Orina alcalina: cristales de urato amónico, trifosfatos, fosfato cálcico, fosfatos amorfos y
carbonato cálcico
 Orina ácida: cristales de ácido úrico, cristales de oxalato cálcico, cristales de urato sódico
y uratos amorfos Estos cristales se consideran normales si proceden de solutos que
se encuentran fisiológicamente en la orina. Sin embargo, a v ec es pueden detectarse
cristales en la orina de pacientes con cistinuria (cristales de cistina) o con necrosis
hepática masiva (cristales de leucina y tirosina).
Esquematizar lo observado. Campos Microscópicos:

81
Muestra: Muestra:
Aumento: Aumento:
Morfología: Morfología:
Muestra: Muestra:
Aumento: Aumento:
Morfología: Morfología:

82

83
PRÁCTICA 06: RECONOCIMIENTO DE BIOMOLECULAS

ORGANICAS
I. INTRODUCCIÓN
En los organismos se encuentran cuatro tipos diferentes de moléculas orgánicas en gran cantidad:
carbohidratos, lípidos, proteínas y nucleótidos. Todas estas moléculas contienen carbono,
hidrógeno y oxígeno. Además, las proteínas contienen nitrógeno y azufre, y los nucleótidos, así
como algunos lípidos, contienen nitrógeno y fósforo. Se ha dicho que es suficiente reconocer
cerca de 30 moléculas para tener un conocimiento que permita trabajar con la bioquímica de
las células. Dos de esas moléculas son los azúcares glucosa y ribosa; otra, un lípido; otras
veinte, los aminoácidos biológicamente importantes; y cinco las bases nitrogenadas, moléculas
que contienen nitrógeno y son constituyentes claves de los nucleótidos. En esencia, la química
de los organismos vivos es la química de los compuestos que contienen carbono, o sea, los
compuestos orgánicos.
El carbono es singularmente adecuado para este papel central, por el hecho de que es el átomo
más liviano capaz de formar múltiples enlaces covalentes. A raíz de esta capacidad, el carbono
puede combinarse con otros átomos de carbono y con átomos distintos para formar una gran
variedad de cadenas fuertes y estables y de compuestos con forma de anillo. Las moléculas
orgánicas derivan sus configuraciones tridimensionales primordialmente de sus esqueletos de
carbono. Sin embargo, muchas de sus propiedades específicas dependen de grupos funcionales.
Una característica general de todos los compuestos orgánicos es que liberan energía cuando se
oxidan. Entre los tipos principales de moléculas orgánicas importantes en los sistemas vivos
están los carbohidratos, los lípidos, las proteínas y los nucleótidos.
II. OBJETIVOS
 Determinar cualitativamente los carbohidratos presentes en muestras biológicas.
 Reconocer cualitativamente las proteínas presentes en muestras biológicas.
 Demostrar la solubilidad de los lípidos en diferentes tipos de solventes.
III. MATERIALES Y REACTIVOS

De la Laboratorio
- Tubos de ensayo
- Mechero
- Placas petri
- Vasos de precipitado Tubos de ensayo Gradillas
- Pinzas de madera Pipetas volumétricas Agua destilada
- Reactivo de Fehling Solución de glucosa 1% Solución de almidón Solución de lugol Acetona
- Cloroformo
- Sulfato de cobre al 1% NaOH 5%.
Del estudiante (por subgrupo)

- 1 Gillette
- 5ml de leche

84
- 5ml de aceite
- Bilis de pollo (1)
- 1 manzana
- 1 papa
- 50g de almidón
- 1 huevo de gallina.
Materiales de limpieza y descarte de los estudiantes (por subgrupo)
- Detergente (100g) Lejía (1 frasco) Toalla pequeña
- Papel toalla
- Bolsas plásticas color negro
- Plumón de tinta indeleble punta fina.
IDENTIFICACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES

A) Reacción de Fehling:
Es una reacción cualitativa que sirve para determinar la presencia de un azúcar reductor que
no sea sacarosa (carece de carbono anomérico y no es azúcar reductor).
El reactivo de fehling presenta sulfato de cobre, carbonato de sodio, citrato de sodio, y agua. En
la reacción para determinar a los azucares reductores los agentes estabilizantes de la reacción
son el carbonato y citrato, el sulfato de cobre es el reactante específicamente el Cu que va a
reaccionar con los grupos químicos de aldehídos y cetonas. Que en reacciones de óxido reducción
el Cu se convierte en CuO dando un color rojo ladrillo que precipitará posteriormente.
TUBO DE ENSAYO
COMPONENTES
I II III
Solución de glucosa 1 ml
Leche evaporada 1 ml
Manzana rallada 1 ml
Reactivo de fehling 2 ml 2 ml 2 ml
Mezclar por inversión el reactivo con cada uno de los componentes
Someter a la acción del calor
Observar la formación de un precipitado rojo ladrillo (CH2O), en baño de agua fría

85
RESULTADOS: Graficar sus observaciones
DISCUSIÓN
CONCLUSION:
BIBLIOGRAFIA:

86
RECONOCIMIENTO DEL ALMIDÓN
El fundamento de esta técnica se basa en la especificidad del almidón cuando está presente
en solución, la cual da un color azul en presencia del Yodo. El yodo presenta: yoduro de potasio
y yodo bisublimado, más agua (solución de Lugol). El yodo de la solución tiene afinidad por los
enlaces α 1-4 y α 1-6 de la moléculas de almidón, esta interacción del yodo por dichos enlaces
producen el cambio de coloración. La amilosa en disolución coloidal toma color azul, la
amilopectina da una coloración rojo violácea.
Experimento:
TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES
I II III
Solución de almidón 1 ml
Papa rallada 1 ml
Clara de huevo 1 ml
Reactivo de lugol 2 gotas 2 gotas 2 gotas
Observar los primeros cambios de coloración
Mezclar por inversión
DISCUSIÓN

87
CONCLUSION:
BIBLIOGRAFIA:
RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS
A) Reacción de Biuret:
Se debe a los componentes que presenta: el hidróxido de sodio y sulfato de cobre; el cual el
agente desnaturalizante de las proteínas es el hidróxido y el reactante es el sulfato de cobre. Las
proteínas después de ser desnaturalizadas facilitan la interacción del Cu con los pares de
electrones sin compartir del grupo amino del péptido mediante enlaces de coordinación con la
formación de un complejo coloreado púrpura – violáceo.
Experimento
- Rotular tres tubos de ensayo, en el primero agregar 1 ml de albúmina (huevo), en el
segundo tubo leche, y en el tercero la solución de almidón.
- Añadir 0.5 ml de NaOH al 40%, y 4 gotas de sulfato de cobre al 1% a cada tubo.
TUBOS Huevo Leche Sol. Almidón NaOH 40% SO4Cu2 1%

1 1 ml. 0,5 ml. 4 gotas.
2 1 ml. 0,5 ml. 4 gotas.
3 1 ml. 0,5 ml. 4 gotas.
Observar la formación del color violeta en los tubos que presentan proteínas
- Observar en los dos tubos la formación de un color violeta, si fuera la reacción Biuret (+)
caso contrario de Biuret (-)

88
DISCUSIÓN
CONCLUSION:
BIBLIOGRAFIA:

89
RECONOCIMIENTO DE LÍPIDOS
En este experimento la identificación se da por el comportamiento de las moléculas de aceite

con el agua, las cuales no se homogenizan, debido a que estas presentan características
diferenciales, mientras que el agua es polar, el aceite es no polar, esto hace que
microscópicamente se note que el aceite forme micelas en solución acuosa. Donde las colas
hidrofóbicas de las moléculas de aceite se “esconden” del agua adoptando la forma de micelas.
Experimento:
SOLUBILIDAD EN SOLVENTES ORGANICOS

TUBO DE ENSAYO
COMPONENTES
I II III
Aceite 2 ml 2 ml 2 ml
Agua destilada 2 ml
Acetona 2 ml
Cloroformo 2 ml
Después de agregar por las paredes del tubo cada componente
Hacer una primera observación, luego
Mezclar por inversión cada tubo y dejar en reposo unos 5 minutos
DISCUSIÓN

90
CONCLUSION:
BIBLIOGRAFIA:
BIBLIOGRAFÍA
 CORTEZ, R. 1181, Guía de práctica de laboratorio – Biología 1.a Edición. Edit. UNT. Pag. 75.
 LEHNINGER, A. 1987 Bioquímica. 2a edición. Edt. S.A. Barcelona – España Pag. 1095.
 PLANAS M. 1982. Biología de los Elementos. 2a edición. Edit. OMEGA. Madrid. España. pag.
961.
 CORTEZ R. 1981. Guía de Practicas de Laboratorio - Biología .2° edición. Edit. UNI, pag 77.
 LENINGER, A. 1987. Bioquímica 2° Ed. Omega S.A. Barcelona- España. pag. 1095.
 MURRAY R.K. GRANNER DE MAYES P.A. Y RODWELL. V.W. 1994. Bioquímica de Harper
13° ed. Edit.
 El Manual S.A. de C.V. México D.F. pp. 961. Plummer PT 1981. Bioquímica Práctica. Edit.
Mc. Graw Hill Latinoamericano S.A. Bogotá Colombia.
 SALOMON, F. CANTARINO, M. 1979. Curso de práctica de Biología General.

91

92
PRACTICA 07: CARACTERIZACION DE AMINOACIDOS
INTRODUCCIÓN
Los aminoácidos son los sillares de construcción de las proteínas. El número de aminoácidos
comunes se reduce a 20. Todos con excepción de la prolina, tiene un grupo carboxilo libre y un grupo
amino libre no sustituido unido al carbono a. Difieren unos de otros en la estructura de su cadena lateral
que se denomina grupo R. Siendo su estructura general:
H
|
HOOC - C - R
|
NH2
Los aminoácidos son importantes en la alimentación humana. En forma de proteínas los

aminoácidos realizan una multitud de funciones estructurales, hormonales y catalíticas esenciales para la
vida. Por lo tanto, no sorprende que defectos genéticos en el metabolismo de los aminoácidos pueden
conducir a transtornos graves como el retraso mental y muerte temprana. Además de sus actividades
como proteínas, los L-aminoácidos y sus derivados participan en funciones intracelulares tan diversas
como transmisión nerviosa, regulación del desarrollo celular y en la biosíntesis de porfirinas, purinas y
pirimidinas así como urea.
DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO EN LOS AMINOACIDOS

Los aminoácidos presentan propiedades eléctricas por lo que son considerados como anfolitos,
puesto que poseen un grupo ácido y un grupo básico. En solución existen como moléculas cargadas. En
su punto isoeléctrico, existen en forma de zwitterion o ion dipolar (sal); a pH menor que el punto isoeléctrico
existen como cationes, que actúan como ácidos; y a un pH mayor, existe como un anión, que actúa como
base. Estas formas no tienen una acción buffer buena o total y la adición de pequeñas cantidades de H + ó
OH- alteran rápidamente el pH de la solución. Cuando el aminoácido existe como una mezcla de la sal y
la forma ácida o básica en concentraciones aproximadamente equimolares (en la región de sus valores de
pK), el sistema actúa como un buffer estable.
Como se mencionó anteriormente el punto isoeléctrico es el pH al que el aminoácido no lleva carga
neta; es en esta forma que los aminoácidos no poseen acción buffer. La acción tamponante es más grande
cuando la concentración de la forma de la sal iguala a la concentración de la forma ácido o de la forma de
base.
Considere la reacción:
𝐴𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑆𝑎𝑙
[𝑆𝑎𝑙][𝐻+]
𝐾𝑎 =

93
[𝐻+] = 𝐾𝑎
[𝑆𝑎𝑙]
[𝑆𝑎𝑙]
El pK = pH cuando la [sal] = [ácido]. Esto en el rango de pH ácido para la mayor capacidad

tamponante.
Similarmente para la reacción:
𝑆𝑎𝑙 𝐵𝑎𝑠𝑒
[𝐵𝑎𝑠𝑒]
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑏 + log
[𝑆𝑎𝑙]
El pKb = pH cuando la [base] = [sal]. Esto en el rango de pH alcalino para la mayor capacidad
tamponante.
En el punto isoeléctrico la concentración de ácido iguala a la concentración de base:
[𝐻+][𝑆𝑎𝑙] [𝐻+][𝑆𝑎𝑙]
𝐾𝑎 = [𝐴𝑐𝑖𝑑𝑜] =
[𝐴𝑐𝑖𝑑𝑜] 𝐾𝑎
[𝐻+][𝐵𝑎𝑠𝑒] [𝑆𝑎𝑙]
𝐾𝑏 = [𝐵𝑎𝑠𝑒] = 𝐾𝑏 𝑥
[𝑆𝑎𝑙] [𝐻+]
Por lo tanto:
[𝐻+][𝑆𝑎𝑙] [𝑆𝑎𝑙]
= 𝐾𝑏 +
𝐾𝑎 [𝐻 ]
[𝐻+]2 = 𝐾𝑎 𝑥 𝐾𝑏
𝑝𝐾𝑎 + 𝑝𝐾𝑏
𝑝𝐻(𝑝𝐼) =
2

94
Si disponemos de una solución que contiene 1 mol de un aminoácido monocarboxílico y

monoaminado a un pH de 0 y le agregamos progresivamente alícuotas de una solución de NaOH con el
objeto de hacer variar el pH de la solución, se podrá obtener una gráfica como la que muestra la Fig. 1.
12
10
pKb
8
pH
6 Punto
isoeléctrico
4 pKa
ml de ácido 0 ml de álcali
Fig.1. Curva de titulación de la glicina.
Se puede notar dos sectores en donde la curva tiende a la horizontalidad, es decir en donde ocurren
las menores variaciones en el pH, no obstante que la cantidad de NaOH añadida, es la misma que para
otros sectores de la curva. Si reparamos en que pH ocurren estos sectores de casi horizontalidad de la
curva, notaremos que están muy próximos a 2.3 y 9.6; lo que quiere decir que en las proximidades del pK
de sus grupos ionizables, el aminoácido tendrá una mayor acción amortiguadora del pH. Esto nos permite
anotar que de los diferentes aminoácidos, la histidina (por su núcleo imidazol) es el más importante en el
control del pH de los líquidos extracelulares, que como se sabe es de aproximadamente 7.4.
En el punto isoeléctrico los aminoácidos son menos solubles en agua y no migran a ningún
electrodo bajo la influencia de una corriente eléctrica.
AISLAMIENTO Y SEPARACION DE AMINOACIDOS

Los aminoácidos pueden ser separados por Cromatografía de intercambio iónico, en este
procedimiento las moléculas de las soluciones son separadas por diferencias en sus propiedades ácido-
base. Para tal fin, se usan columnas con resinas sintéticas, la cual tiene grupos químicos con una carga
determinada. Una de las más usadas corresponde al poliestireno, con grupos de ácido sulfónico (SO 3-)
unidos coovalentemente a los anillos bencénicos. Esta resina, por intermedio de sus grupos sulfónicos
puede captar cationes e intercambiarlos con otros cationes (resina de intercambio catiónico).
En virtud de la propiedad de los aminoácidos de adoptar determinada forma eléctrica según el pH
del medio en que se encuentren, los aminoácidos pueden ser separados fácilmente por Electroforesis. La
técnica consiste en suspender a los aminoácidos en un medio de pH determinado y colocar la solución
sobre un soporte, que puede ser simplemente papel y someterlo a la acción de un campo eléctrico. Según
la intensidad de carga y secundariamente según su tamaño, los aminoácidos migrarán a uno u otro polo y
con mayor o menor velocidad.

95
Existe otro método muy usado para la separación de aminoácidos y que no está basado en sus
propiedades eléctricas sino en la diferente solubilidad que tienen en una mezcla de solventes no miscibles.
Cuando un aminoácido se disuelve en una mezcla de solvente no miscible se reparte entre ellos
de acuerdo a su grado de solubilidad, que en la práctica corresponde a su coeficiente de partición o de
reparto. Este principio se aplica en la técnica denominada Cromatografía de Papel y Cromatografía de
Capa Fina.
REACCIONES QUIMICAS DE LOS AMINOACIDOS

Los aminoácidos presentan reacciones de significación biológica que evidencian su capacidad de
interactuar coovalentemente entre sí mediante el grupo a-carboxilo de una molécula y el a-amino de otra
molécula para formar un enlace peptídico.
Los aminoácidos participan además en una gran variedad de reacciones químicas que incluyen la
alquilación, arilación y acilación del grupo amino, la formación de ésteres y anhídridos que implican al
grupo carboxilo y reacciones similares en las que interviene los grupos reactivos de las cadenas laterales.
El conocimiento de estas reacciones es útil en varios aspectos importantes de la química proteica:
a. Para identificar y analizar los aminoácidos en un hidrolizado proteico.
b. Para identificar la secuencia de los aminoácidos en las proteínas.
c. Para la identificación de los residuos específicos de aminoácidos requeridos para la función biológica
de las proteínas.
d. Para producir cambios en la actividad biológica de la proteína mediante modificaciones químicas de los
residuos de los aminoácidos constituyentes.
e. Para la síntesis química de los polipéptidos.
Dentro de las principales reacciones podemos mencionar:
1. REACCION CON ACIDO NITROSO.- El ácido nitroso reacciona con los grupos amino primarios
alifáticos con liberación de nitrógeno para formar alcoholes. Esta reacción puede ser usada para
estimar cuantitativamente los aminoácidos midiendo la cantidad de nitrógeno liberado.
2. REACCION CON NINHIDRINA.- Usada para la determinación cuantitativa de los aminoácidos y

péptidos. Los aminoácidos reaccionan con la ninhidrina para dar un característico color azul violáceo
llamado azul de Ruheman con una absorción máxima a 540 nm a excepción de la prolina e
hidroxiprolina que dan un color amarillo, con una absorción máxima a 440 nm. La ninhidrina es reducida
y el aminoácido es desaminado y descarboxilado. La determinación cuantitativa puede hacerse
también midiendo el CO2 desprendido.

96
3. REACCION CON EL DINITROFLUOROBENCENO (DNB).- El grupo amino reacciona con el DNB en

condiciones alcalinas para formar un derivado amarillo. Esta reacción es importante en la
determinación del grupo amino terminal en proteínas, lo que permite identificar el aminoácido iniciador
de la cadena polipeptídica. Ya que al realizar la hidrólisis ácida de la proteína se libera el aminoácido
N-terminal arilado; pudiendo ser identificado por cromatografía en papel o capa fina.
4. REACCION CON CLORURO DE DANSILO.- Un grupo amino libre reacciona con el cloruro de dansilo
para formar un compuesto fluorescente que puede detectarse y medirse en cantidades pequeñas,
mediante métodos fluorimétricos.

97
5. REACCION CON FENILISOTIOCIANATO.- Es la reacción de Edman para determinar el N-terminal de

una cadena polipeptídica. El fenilisotiocianato reacciona con los a-aminoácidos para dar los ácidos
feniltiohidantóicos correspondientes. Estos ácidos al ser tratados con solventes no hidroxilados, como
el nitrometano; se ciclan para dar las feniltiohidantoínas; las cuales son reconocidas por cromatografía
de gas-líquido, de papel o de capa fina.
6. REACCION CON CLORURO DE TRIOFLUOROACETILO.- Se utiliza en la cromatografía de gas-

líquido. Los derivados trifluoroacéticos se volatilizan fácilmente sin descomponerse para separarse por
cromatografía gas-líquido mientras que los aminoácidos libres se descomponen.
Las reacciones antes señaladas son comunes a todos los aminoácidos. Pero los aminoácidos
presentan reacciones que dan color y dependen de su cadena lateral y por lo tanto, son más específicas
en la identificación de aminoácidos. Entre las reacciones químicas que se usan para la detección o
estimación de algunos aminoácidos específicos tenemos: reacción xantoproteica, reacción de millon,
reacción del acetato de plomo, reacción de sakaguchi, etc. Cuyo fundamento se explica en la parte
experimental.

98
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO N° 1. REACCION CON NINHIDRINA

FUNDAMENTO
Los aminoácidos reaccionan con la ninhidrina dando un color azul violáceo. En eta reacción la
ninhidrina es reducida y el aminoácido es desaminado y descarboxilado.
MATERIAL
1. Aparatos: Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
2. Reactivos: Solución de aminoácidos 0.1 M
(glicina, metionina, cisteína, histidina, arginina, tirosina, triptofano y cistina)
Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de huevo 5%)
Ninhidrina 0.1% en etanol de 95%
METODO DE TRABAJO
Prepare el siguiente sistema de tubos:
Color
TUBO N° 1 2 3 4 5 6 7 8
observado
Glicina 0.1 M Metionina 0.5 - - - -- - - - …………….

0.1 M Cisteina 0.1 M
- 0.5 - - - - - - …………….
Histidina 0.1 M Arginina
0.1 M - - 0.5 - - - - - …………….
Tirosina 0.1 M - - - 0.5 - - - - …………….
Ovoalbumina 0.1% Agua
destilada Ninhidrina - - - - 0.5 - - - …………….
0.1% - - - - - 0.5 - - …………….
- - - - - - 0.5 - …………….
- - - - - - - 0.5 …………….
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 …………….
Mezclar mediante agitación suave y llevar a baño de agua hirviente por 10 minutos. Retire y enfríe.
Observe e interprete los resultados.

99
EXPERIMENTO N° 2. REACCION XANTOPROTEICA
FUNDAMENTO
Es una prueba positiva para aminoácidos aromáticos (tirosina, fenilalanina y triptófano). Se basa
en la nitración del núcleo de benceno (anillo aromático) dando derivados amarillos, cuando se calientan
con ácido nítrico concentrado; estos derivados se tornan anaranjados por adición de NaOH (se forman
sales).
MATERIAL
Pipetas
Gradillas
Baño maría
2. Reactivos: Solucion de aminoácidos 0.1 M
(glicina, tirosina y triptofano)
Ovoalbumina 0.1% (o Clara de Huevo 5%)
Acido nítrico concentrado
NaOH 1 N
METODO DE TRABAJO
Color
TUBO N° 1 2 3 4 5
observado
Glicina 0.1 M 1.0 - - - -- ……………

Tirosina 0.1 M Triptofano 0.1 - 1.0 - - - ……………
M Ov
- - 1.0 - - ……………
+
- - - 1.0 - ……………
- - - - 1.0 ……………
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 ……………
oalbumina 0.1% Agua
destilada
Acido nítrico
Agite suavemente y lleve a baño maría por 10 minutos. Retire y enfrie. Adicione 1.0 ml de NaOH.
Observe e interprete los resultados.

100
EXPERIMENTO N° 3. REACCION DE MILLON

FUNDAMENTO
Esta prueba para ser positiva requiere la presencia de un radical hidroxibenceno, y por lo tanto, es
espacífica para tirosina y sus derivados ya sea que estén libres o en una proteína o en sus productos de
hidrólisis. Esta reacción también se emplea en la cuantificación de tirosina.
El reactivo de Millon es una solución de nitratos mercuriosos y mercúricos, conteniendo ácido
nítrico. Las proteínas del tipo de las albúminas de huevo, que precipitan por ácidos minerales fuertes,
producen un precipitado blanco que se va volviéndo rojo a medida que se calienta. Otras proteínas como
las proteosas y peptonas solo producen una coloración roja en las mismas condiciones, debido a que las
soluciones contienen sales inorgánicas (Cl-) en gran cantidad, precipitando el reactivo de Millon, este
método no se emplea para determinar proteínas en la orina
MATERIAL
Pipetas
Gradillas
Baño maría
2. Reactivos: Solucion de aminoácidos 0.1 M (tirosina)
Reactivo de Millon
METODO DE TRABAJO
Color
TUBO N° 1 2 3
observado
Tirosina 0.1 M Ovoalbumina 1.0 - - …………….

0.1% Agua destilada
- 1.0 - …………….
Reactivo de Millon
- - 1.0 …………….
1.0 1.0 1.0 …………….
Mezclar y llevar a baño de agua hirviente por 5 minutos. Retire y enfrie. Observe e interprete los
resultados.

101
EXPERIMENTO N° 4. REACCIÓN CON ACETATO DE PLOMO

FUNDAMENTO
Cuando un compuesto orgánico que contiene azufre, es tratado con una solución fuerte de NaOH,
este se hidroliza según:
𝑅 − 𝑆 + 2𝑁𝑎𝑂𝐻 ⇌ 𝑅𝑂𝐻 + 𝑁𝑎2𝑆 + 𝐻2𝑂
Este sulfuro inorgánico es altamente ionizable y como resultado de esto se puede obtener algún
test de precipitación para el ion sulfuro. Uno de los más comunes es la precipitación por el plomo. En
efecto, la adición de acetato de plomo causa la formación de sulfuro de plomo (negro o pardo).
El azufre de la cisteína reacciona fácilmente con el acetato de plomo en cambio el azufre de la
metionina a causa de su gran estabilidad no ennegrece con el plomo. La mayor parte de las proteínas
contienen azufre formando parte de la metionina. Son excepciones las queratinas, insulina y ciertas
seroalbúminas que contienen azufre en forma de cistina o cisteína. La fibroína de la seda y algunas
protaminas no contienen azufre. La ergotioneina también contiene azufre y puede dar esta reación.
MATERIAL
Pipetas
Gradillas
Baño maría
(cisteína, cistina y metionina)
NaOH 40%
Acetato de Plomo 0.5 M
METODO DE TRABAJO
Color observado
TUBO N° 1 2 3 4 5 6
Metionina 0.1 M 2.0 - - - -- - ………………..

Cisteina 0.1 M - 2.0 - - - - ………………..
Cistina 0.1 M - - 2.0 - - - ………………..
Caseina 0.1% - - - 2.0 - - ………………..
Ovoalbumina 0.1% - - - - 2.0 - ………………..
Agua destilada - - - - - 2.0 ………………..
NaOH 40% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 ………………..
Acetato de plomo 0.5 M (Gotas) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 ………………..
Mezclar y llevar a baño de agua hirviente por 3 minutos. Retire y enfrie. Observe e interprete los resultados.

102
EXPERIMENTO N° 6. REACCIÓN MCCARTHY-SULLIVAN

FUNDAMENTO
Sirven para identificar la presencia de metionina. Para tal efecto se utiliza nitroprusiato de sodio
(Na2NOFe(CN)5) desarrollándose una coloración roja en presencia de dicho aminoácido.
MATERIAL
Pipetas
Gradillas
Baño maría
2. Reactivos: Solucion de aminoácidos 0.1 M (glicina, metionina)
NaOH 6 N
Nitroprosiato de sodio (20 g/L. Prepárese fresco).
HCl 2 M
METODO DE TRABAJO
Color
TUBO N° 1 2 3 4
observado
Glicina 0.1 M 1.0 ......................

Metionina 0.1 M 1.0 ......................
Ovoalbumina 0.1% 1.0 ………………
Agua destilada 1.0 ………………
NaOH 6 N 1.0 1.0 1.0 1.0 ………………
Nitroprusiato de sodio 0.5 0.5 0.5 0.5 ………………
Lleve los tubos a baño maría a temperatura no mayor de 40°C durante 10 minutos. Luego enfrié y
por las paredes del tubo deslice 1.0 ml de HCl. Anote los resultados. Luego agite los tubos y observe otra
vez.

103
EXPERIMENTO N° 7. REACCION DE HOPKINS-COLE

FUNDAMENTO
Esta prueba es positiva para aminoácidos que poseen un anillo indol como el triptofano. El grupo
indol del trptofano reacciona con el ácido glioxílico (CHO-COOH) del reactivo en presencia del ácido
sulfúrico dando un color púrpura o violeta en la interfase de los dos líquidos.
MATERIAL
Pipetas
Gradillas
Baño maría
(glicina, triptofano)
Acido sulfúrico concentrado
Reactivo de Hopkins-Cole
METODO DE TRABAJO
Color
TUBO N° 1 2 3 4
observado
Glicina 0.1 M 1.0 …………….

Triptofano 0.1 M 1.0 …………….
Ovoalbumina 0.1% 1.0 …………….
Agua destilada 1.0 …………….
Reactivo Hopkins-Cole 0.2 0.2 0.2 0.2 …………….
Después de añadir el reactivo de Hopkins-Cole agite y agregue a cada tubo, deslizando por las
paredes, 1.0 ml de ácido sulfúrico concentrado, luego lleva al baño de agua hierniente por 3 minutos. Retire
y enfri. Observe los resultados.

104
CUESTIONARIO
1. La hormona peptidica estimuladora de melanocitos, -melanotropina, tiene la siguiente secuencia: Ser-
Tyr-Ser-met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val
a) Escribir la secuencia utilizando las abreviaturas de una letra.
b) Calcular el peso molecular relativo del peptido.
c) Estimar la carga neta a pH 7.4
2. Dado el peptido siguiente: Ser-glu-Pro-Ile-Met-Ala-Pro-Val-Glu-Tyr-Pro-Lys

a) Estimar la carga neta a pH 7 y a pH 12
b) Cuantos peptidos se producirian si este peptido se corta con: 1) Bromuro de cianogeno, 2) Tripsina
y 3) Quimotripsina?
3. La apamina es una pequeña toxina proteica presente en el veneno de las abejas. Su secuencia es la
siguiente: CNCKAPETALCARRCQQH
a) Se sabe que la apamina no reacciona con yodo acetato. ¿Cuantos enlaces disulfuro están
presentes?
b) Supóngase que la fragmentación con tripsina produce dos péptidos. ¿Dónde está (o están) el
enlace o enlaces S-S?

105
PRÁCTICA 08: CARACTERIZACION Y CUANTIFICACION DE

PROTEINAS I
INTRODUCCIÓN
Las proteínas constituyen más del 50% del peso seco de las células. Son estructuras formadas por
una o más cadenas polipeptídicas. El número de permutaciones y combinaciones que se pueden obtener
a partir de los 20 aminoácidos es enorme y por esto el número posible de proteínas es realmente muy
grande.
Las proteínas, presentes en los organismos vivos, cumplen diferentes funciones. Actúan como
transportadoras de vitaminas, oxígeno y bióxido de carbono. Actúan también como enzimas, hormonas,
anticuerpos, moléculas de almacenaje, unidades estructurales, fuentes de energía, etc.
Uno de los trabajos más laboriosos e interesantes del Bioquímico es la purificación de proteínas
para su caracterización y cuantificación posterior.
PRECIPITACION DE PROTEINAS
Las proteínas son coloides liofílico (en particular, hidrofílicos); se hallan estabilizadas por ambas
cargas y por interacciones proteína-solvente. Cuando una de estas influencias estabilizadoras es
removida, la proteína precipita algunas veces; cuando ambas de estas influencias son eliminadas, la
proteína siempre precipita.
1.1. Precipitación en el Punto Isoeléctrico.- Las proteínas, como los aminoácidos, son menos solubles
en su punto isoeléctrico. Algunas proteínas, por ejm. caseína, son precipitadas ajustando el pH de la
solución al punto isoeléctrico de la proteína.
1.2. Precipitación por Sales.- La adición de una sal neutra causa la precipitación de las proteínas. Las
diferentes proteínas son precipitadas a diferentes concentraciones de sal. Esto ocurre más fácilmente en
el punto isoeléctrico de la proteína. El efecto de la sal es eliminar el agua de solvatación, lo cual disminuye
la interacción proteína-agua y aumenta la interacción proteína-proteína, causando así la precipitación. La
sal comúnmente usada para este tratamiento es el sulfato de amonio, pues es extremadamente soluble.
1.3. Precipitación por Solventes Orgánicos. - La adición de ciertos solventes orgánicos, como etanol y
acetona, precipitan las proteínas, y otra vez la precipitación ocurre más fácilmente en el punto isoeléctrico
de la proteína. Los solventes orgánicos también eliminan agua, así disminuyen la interacción proteína-
agua. Este procedimiento debe ser llevado a cabo a 0°C, de otro modo puede ocurrir desnaturalización.
1.4. Precipitación por Aniones Complejos.- Los ácidos como tricloroacético, sulfosalicílico, pícrico,
tánico, tungstico, fosfomolibdico, etc. precipitan proteínas. La precipitación probablemente se debe a la
neutralización de la carga positiva de la proteína por el anión libre. Este tipo de precipitación causa muchas
veces desnaturalización debido al pH extremo al que se le lleva a la proteína.
1.5. Precipitación por Metales Pesados.- Los cationes de metales pesados como mercurio, plomo,
cobre, plata, oro, platino, etc., precipitan las proteínas en condiciones alcalinas. El catón libre disminuye la
carga negativa de la proteína, causando así la precipitación. Estos iones algunas veces desnaturalizan las
proteínas porque reaccionan con los grupos SH para formar sulfuros.
II. DESNATURLIZACION DE LAS PROTEINAS
Las proteínas nativas son altamente ordenadas, son moléculas complejas. Cualquier fuerza que
altere la estructura tridimensional de la molécula sin que haya ruptura del enlace peptídico causa

106
desnaturalización. las proteínas desnaturalizadas tienen propiedades diferentes a las proteínas nativas y
ellas ya no poseen actividad fisiológica. Además, la desnaturalización desminuye la solubilidad de las
proteínas en agua, porque el arreglo de los grupos hidrofílicos, orientados hacia la superficie, está
destruído. Son comunes agentes desnaturalizantes, el calor, pH extremo, oxidación y reducción los cuales
afectan el enlace disulfuro, agitación, radiación y úrea. Las proteínas presentan diferentes
susceptibilidades para cada agente desnaturalizante. La desnaturalización puede ser un proceso
reversible. Algunas veces, cuando se remueve el agente, como en el caso de la úrea, a proteína nativa es
restaurada.
PARTE EXPERIMENTAL
OBJETIVOS
- Caracterizar la presencia de proteínas en material biológico
- Demostrar las reacciones de coloración para las proteínas
- Verificar experimentalmente la precipitación de proteínas con y sin desnaturalización
- Relacionar las observaciones prácticas con la teoría de propiedades generales, estructura y
aislamiento de proteínas
REACTIVOS
- Solución de proteínas al 10%
- Solución de ninhidrina 0,1%
- Hidróxido de sodio 2,5 M
- Solución de sulfato de cobre al 1%
- Ácido tricloroacético (TCA) al 10% v/v
- Acetato de plomo al 5% p/v
- Alcohol etílico absoluto
- Clara de huevo “in natura”
- Cloruro de sodio 1 M
- Solución saturada de sulfato de amonio 76,6 g% p/v
EXPERIMENTO I. REACCIONES DE COLORACIÓN

a) REACCIÓN DE NINHIDRINA
Tubo 1: 2 ml de ninhidrina + 5 gotas de proteína al 10%, llevar a baño maría por 5 minutos a 100ºC.
Anotar el resultado.
b) REACCIÓN DE BIURET
Tubo 2: 1 ml de proteína al 10% + 5 gotas de NaOH 2,5 M y 3 gotas de sulfato de cobre al 1%
Tubo 3: 1 ml de agua destilada + 5 gotas de NaOH 2,5 M y 3 gotas de sulfato de cobre al 1%. Anotar
los resultados.
Tubo 1 2 3
Ninhidrina
Biuret
Agua + Biuret
EXPERIMENTO II. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN

a) ACCIÓN DEL CALOR
Tubo 4: 2 ml de proteína al 10%; colocar en baño maría a 100ºC por 3 minutos. Anotar el resultado

107
b) REACCIÓN CON REACTIVOS PARA ALCALOIDES

Tubo 5: 1 ml de proteína al 10% + 1ml de TCA al 10%, Anotar el resultado
c) REACCIÓN CON SALES DE METALES PESADOS

Tubo 6: 1 ml de proteína al 10% + 1 ml de acetato de plomo al 5%. Anotar el resultado,
d) REACCIÓN CON SOLVENTES ORGÁNICOS

Tubo 7: 1 ml de proteína al 10% + 3 ml de alcohol etílico. Anotar el resultado
e) EFECTO DE LA ADICIÓN DE SALES
Tubo 8: 3 ml de clara pura + agua destilada hasta la formación de un precipitado blanquecino. Disolver
con ayuda de una varilla, adicionar NaCl 1 M gota a gota hasta redisolver el precipitado,
Tubo 9: 2 ml de la solución anterior + 4 ml de solución saturada de sulfato de amonio. Observar. Añadir
4 a 6 ml de agua destilada y observar el efecto,
Tubos 4 5 6 7 8 9
100ºC
TCA al 10%
Acetato de plomo al 5%
Alcohol etílico
NaCl 1 M
Sulfato de amonio
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es el fundamento de la reacción de la ninhidrina y que clases de sustancias reaccionan
positivamente?
2. ¿Cuáles el fundamento de la reacción de biuret y qué grupos de las proteínas son responsables de
esta reacción?
3. ¿Cuál es la importancia de la reacción de biuret?
4. ¿Cuál es la importancia de las reacciones de precipitación de proteínas por los reactivos de los
alcaloides y por sales de metales pesados? Explique los mecanismos de las precipitaciones.
5. Explique los mecanismos que llevan a una proteína a disolverse cuando hay un pequeño aumento de
la fuerza iónica de la solución y los mecanismos que llevan a una proteína a precipitar cuando hay un
gran aumento de la fuerza iónica de la solución.
6. ¿Qué cambios ocurren en una proteína cuando está en contacto con el etanol?

108
PRACTICA 09: CARACTERIZACION Y CUANTIFICACION DE

PROTEINAS II
EXPERIMENTO N° 1. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELECTRICO Y SOLUBILIDAD DE LA

CASEINA.
FUNDAMENTO
El punto isoeléctrico (pI) es la concentración de iones hidrógeno a la que la proteína es
eléctricamente neutra, porque el número total de cargas positivas es igual al número total de cargas
negativas de la proteína. En este punto, algunas proteínas son muy insolubles y precipitan, pero otras
permanecen en solución (ovoalbúmina, gelatina). En este punto la carga neta de todos los grupos
disociables, como carboxilo, amino, imidazol, guanidino, etc., es igual a cero. La superficie de la proteína
siempre posee una carga eléctrica que depende del pH, de los electrolitos presentes y del solvente, en
particular del agua, y de los puentes hidrógenos; pero existe un conjunto de condiciones, basado en las
relaciones de todos estos factores, para el cual la suma de las cargas positivas es igual a la suma de las
cargas negativas. En este momento el número de moléculas de proteína que tienen una carga neta positiva
o negativa es mínimo o nulo.
MATERIAL
Pipetas
Gradillas
2. Reactivos: Solución de caseína al 0.5% en acetato de sodio 0.1 N
Ácido acético 1 N
Ácido acético 0.1 N
Ácido acético 0.01 N
NaOH al 10%
METODO DE TRABAJO
Preparar el siguiente sistema de tubos:
TUBO N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Ac. acético 0.01 N 0.62 1.25
Ac. acético 0.1 N 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0
Ac. acético 1.0 N 1.6
Agua destilada 8.38 7.75 8.75 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4
Caseína 0.5% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
pH
Turbidez
Agitar los tubos antes y después de agregar la caseína. Haga el cálculo del pH teórico para cada

109
uno de los tubos y si fuera posible determine el pH de cada tubo en un pHmetro. Con los resultados
construya una gráfica. Además anote la presencia o falta de turbidez de 0 a ++++, según corresponda
para cada tubo. Determinar con la mayor precisión el tubo que presenta el máximo de precipitación, lo cual
se producirá en el tubo que tiene un pH próximo al punto isoeléctrico y al de solubilidad mínima de la
caseína. Observar a los 10 minutos y 30 minutos, anote los cambios.
Seguidamente calentar los tubos en baño maría y apreciar el resultado. Anote sus apreciaciones.
Agregar NaOH al 10% gota a gota y observe. Anote los resultados.
EXPERIMENTO N° 2. ESTIMACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS A PARTIR DE ALGAS MARINAS

POR EL MÉTODO DE BIURET DE LAYNE
FUNDAMENTO
Este método colorimétrico distinto está basado en un complejo purpura que se produce entre las
sustancias que contienen dos o más enlaces peptídicos y sales de cobre en una solución alcalina (Layne
1957). Dado que ninguna otra sustancia distinta a las proteinas que de la reacción de biuret está
normalmente presente en los materiales biológicos, está es una excelente prueba. Aunque la aparición de
color con varias proteinas (especificas) no siempre es idéntica, las excepciones se encuentran con menos
frecuencia que con la reacción de Folin-fenol. Sin embargo, se requiere de más material para efectuar las
pruebas. La ventaja principal de este método es el sitio de reacción, los enlaces peptídicos, lo cual permite
hacer más eficazmente el análisis de todas las proteínas.
PROCEDIMIENTO:
Para obtener el reactivo de biuret disuelva 1.5 g de sulfato cúprico (CuSO4 . H2O) y 6.0 g de tartrato
de sodio y potasio (NaKC4H4O6 . 4H2O) en 500 ml. de agua. Añada, agitando constantemente, 300 ml de
NaOH al 10% (solución libre de carbonato).
Diluya en un litro de agua y almacene en una botella revestida de plástico. Cualquier signo de
precipitado negro o rojizo indica contaminación.
1. Pese de 100 a 200 gr de la muestra y añada 5 ml de NaOH 1N. Deje que repose de 24 a 72 horas a la
temperatura del lugar. Agite ocasionalmente la solución golpeando la base del tubo de prueba.
2. Tome una alícuota de 1 ml del extracto y añada 4 ml del reactivo de biuret, mezcle con un agitador
Vortex o golpeando rápidamente el fondo del tubo de prueba y deje que repose durante 30 minutos a la
temperatura del lugar.
3. Determine la densidad óptica a 540 nm. Utilice un testigo (tubo control que tiene 1 ml de NaOH 1N y 4
ml de Biuret).
4. Determine el porcentaje de proteínas utilizando la siguiente formula y una curva estándar como lo indica
el procedimiento de lowry, pero con la solución estándar de 100 mg en 50 ml.
( mgdeproteínas )( 5)
mg det ejido x100
5. Para obtener la curva estándar disuelva 25 mg de la albúmina de suero de bovino en NaOH 1N y haga
una serie de diluciones de 0.0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 ml de la solución estándar; añada 4 ml de reactivo
de biuret. Obtenga la diferencia utilizando NaOH 1N.

110
[Proteína]
Tubo N UK UK neta Ab Fc
mg/ml
Bl

111
PRÁCTICA 10: ESTUDIO DE LOS PRINCIPALES FACTORES

CINETICOS DE LA FOSFATASA ACIDA DE QUINUA
INTRODUCCIÓN
Las enzimas son moléculas proteicas especializadas, que aceleran las reacciones químicas
llevándolas más rápidamente a su posición de equilibrio.
Las fosfatasas ácidas denominadas también monoéster ortofosfórico fosfohidrolasa, actúan en un
rango de pH entre 5.0 y 6.5, hidrolizan sustratos que tienen un enlace fosfoéster, liberando como productos
de la reacción fosfato inorgánico y un alcohol, el cual varía dependiendo del sustrato utilizado. Estas
enzimas no necesitan de metal alguno para evidenciar su actividad.
Son varios los factores que afectan la actividad enzimática, haremos mención de laguno de ellos:
1. EFECTO DEL TIEMPO.- La cantidad de producto formado en una reacción enzimática es proporcional
al tiempo de incubación. La reacción es lineal en el tiempo hasta un período determinado en que se puede
expresar la actividad enzimática en términos de velocidad, o sea la cantidad de producto formado por
unidad de tiempo. Generalmente la velocidad se expresa en micromoles de producto formado por minuto.
2. EFECTO DE LA CONCENTRACION DE ENZIMA.- Cuando el sustrato se encuentra en exceso, a
concentraciones saturantes, la velocidad de la reacción es proporcional a la concentración de la enzima.
3. EFECTO DEL pH.- La mayor parte de las enzimas tienen un pH característico en el cual su actividad
es máxima, a ese pH se le denomina pH óptimo, y se define como el pH en el cual la enzima y el sustrato
presentan una conformación estructural adecuada para la actividad catalítica. Por encima y por debajo de
este pH la actividad declina, adoptando una forma característica de campana.
4. EFECTO DE LA TEMPERATURA.- La velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas
generalmente se incrementan con la temperatura dentro del margen de estabilidad y plena actividad de la
enzima. Cuando la temperatura alcanza un cierto valor, variable, según la enzima que se trate, esta
empieza a desnaturalizarse y la velocidad de la reacción empieza a disminuir. La temperatura a la que se
alcanza ese valor máximo se denomina temperatura óptima.
5. EFECTO DE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO.- Es el más importante, ya que determina la
velocidad de la reacción. En la mayoría de los casos, cuando se representa la velocidad en función de la
concentración de sustrato, manteniéndose constante la concentración de enzima, se obtienen curvar
hiperbólicas en las cuales puede observarse que para valores muy pequeños de concentración de sustrato
[S], la velocidad de reacción es directamente proporcional a la concentración del propio sustrato.
PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAL
Pipetas
Gradillas
Fotocolorímetro o Espectrofotómetro
Baño maría
2. Reactivos: Buffer Acetato de Sodio 0.1 M pH 5

112
Buffer Acetato de Sodio 0.1 M pH 3

Buffer Acetato de Sodio 0.1 M pH 7
p-Nitrofenilfosfato 1 x 10-2 M y 1 x 10-3 M
Fosfatasa ácida de quinua
NaOH 1 N
EXPERIMENTO N° 1. EFECTO DEL TIEMPO

Prepare un sistema de tubos por duplicado tal como se indica a continuación:
Tubo N° B1 1 B2 2 B3 3 B4 4
Buffer Acetato 0.1 M pH 5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
p-Nitrofenilfosfato 1 x 10-2 M 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Agua Destilada 0.8 0.7 0.8 0.7 0.8 0.7 0.8 0.7
Preincubar 2 min a 37 °C
Enzima 0.1 0.1 0.1 0.1
Incubar a 37 °C (min) 1 1 2 2 5 5 10 10
NaOH 1 N 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
Leer en fotocolorímetro a 420 nm (filtro azul). Graficar velocidad frente al tiempo.
Tubo UK UK neta Ab Tiempo (min)

B1
1 1
B2
2 2
B3
3 5
B4
4 10
EXPERIMENTO N° 2. EFECTO DE LA CONCENTRACION DE ENZIMA

Tubo N° Bl 1 2 3 4

113
Buffer Acetato 0.1 M pH 5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

P – Nitrofenilfosfato 1 x 102 M 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Agua Destilada 0.8 0.75 0.7 0.65 0.6
Enzima - 0.05 0.10 0.15 0.20
Incubar 3 min a 37 °C
NaOH 1 N 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
Leer en fotocolorímetro a 420 nm (filtro azul). Graficar velocidad frente a concentración de enzima.
Tubo UK UK neta Ab [E]
B1
1 0.05
2 0.1
3 0.15
4 0.2
EXPERIMENTO N° 3. EFECTO DEL PH

Tubo N Bl 1 B2 2 B3 3
Buffer Acetato 0.1 M pH 1.0 1.0

Buffer Acetato 0.1 M pH 5 1.0 1.0
Buffer Acetato 0.1 M pH 7 1.0 1.0
p – Nitrofenilfosfato 1 x 102 M 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Agua Destilada 0.8 0.7 0.8 0.7 0.8 0.7
Enzima 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
NaOH 1 N 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
Leer en fotocolorímetro a 420 nm (filtro azul). Graficar velocidad frente a pH.

114
Tubo UK UK neta Ab pH
B1
1 3
2 5
3 8
EXPERIMENTO N° 4. EFECTO DE LA TEMPERATURA

Tubo N° Bl 1 B2 2 B3 3
Buffer Acetato 0.1 M pH 5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

p – Nitrofenilfosfato 1 x 102 M 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Agua Destilada 0.8 0.7 0.8 0.7 0.8 07
Enzima 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Incubar 3 min (°C) 20 20 37 37 60 60
NaOH 1 N 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
Leer en fotocolorímetro a 420 nm (filtro azul). Graficar velocidade frente a temperatura.
Tubo UK UK neta Ab T C
B1
1 20
2 37
3 60

115
EXPERIMENTO N° 5. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO

Conc. Inicial de p-NO2ϕ-P 1 x 10-2 M 1 x 10-3 M
Conc. Final de p-NO2ɸ-P 1x10-3 B 5x10-4 B 2x10-4 B 1x10-4 B 5x10-5 B
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Buffer Acetato 0.1 M pH 5 p-
NO2o-P (ml de solución) Agua 0.2 0.2 0.1 0.1 0.4 0.1 0.2 0.2 0.1 0.1
Destilada
0.7 0.8 0.8 0.9 0.5 0.6 0.7 0.8 0.8 0.9
Enzima
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
NaOH 1 N
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
Leer en fotocolorímetro a 420 nm (filtro azul). Graficar velocidad frente a concentración de sustrato y
1/velocidad frente a 1/concentración de sustrato. Determinar los valores de Km y Vmax.
* Tome en cuenta que el coeficiente de extinción molar del p-Nitrofenol es 1.8 x 104 M-1 cm-1 *.
Blanco UK T UK UK neta Ab [S] 1/[S] 1/v
B1 1
B2 2
B3 3
B4 4
B5 5
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la reacción catalizada por la fosfatasa ácida?
2. ¿Cuáles son las fuentes a partir de la cuales se puede obtener la enzima utilizada en la práctica?
3. ¿Qué importancia tienen los valores de Km y Vmax de una enzima?

116
PRÁCTICA 11: CICLO DE KREBS: ESTUDIO DE LA ACCION

ENZIMATICA DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA
OBJETIVO
1. Poner de manifiesto experimentalmente una de las etapas del metabolismo intermediario y la acción de
las enzimas de óxido-reducción, haciendo uso de un aceptor de electrones como el azul de metileno.
2. Verificar la acción inhibitoria del malonato sobre la succinato deshidrogenasa y del cianuro a nivel de la
cadena respiratoria mitocondrial.
1. ESTUDIO DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA

FUNDAMENTO
Las transformaciones biológicas de sustratos comprenden procesos de óxido-reducción y
transferencia de electrones a través de una serie de sistemas enzimáticos.
En las oxido-reducciones se produce transferencia de electrones a partir de un dador hasta un
aceptor. Algunas veces el transporte de electrones es realizado mediante la transferencia de átomos de
hidrógeno o bien átomos de hidrógeno y un electrón. las enzimas que realizan este tipo de reaccione son
las deshidrogenasas pudiendo ser piridin (NAD, NADH) o flavina (FAD) dependientes; además existen los
citocromos que son de naturaleza ferroporfirínica y se encuentran ordenados de acuerdo a su potencial
de óxido reducción constituyendo la llamada "Cadena de Transporte Mitocondrial".
Algunos compuestos orgánicos coloreados, al aceptar hidrógenos se convierten en leucoderivados.
Tal es el caso del azul de metileno cuyo potencial de óxido-reducción es +0.01 y el 2,6-
diclorofenolindofenol cuyo potencial de óxido-reducción es +0.22.
La succinato deshidrogenasa (SHD) es una flavoproteína unida a hierro no hémico. El metal tiene
como finalidad actuar como enlace para conservación de energía y desacoplar los dos equivalentes
reductores del ion hidrogeno aceptado por la flavina y, finalmente estabilizar la forma semiquinoide de la
flavina. Diversas sustancias pueden actuar inhibiendo los sistemas biológicos de óxido-reducción. Por
ejemplo, el malonato actúa específicamente inhibiendo a la succinato deshidrogenasa por un mecanismo
competitivo; por lo tanto, la prueba experimental con azul de metileno será negativa, es decir no se
decolora por no haber movilización de electrones. El cianuro, actúa impidiendo la reoxidación de los
citocromos, pués se combina específicamente con el Fe++ del citocromo oxidasa; por ello los ciocromos
permanecen reducidos e incapaces de seguir actuando y se bloquea la respiración.
Las enzimas que se utilizan pueden ser de dos tipos:
1) Oxidasas y deshidrogenasas aeróbicas
2) Deshidrogenasas anaeróbicas
Las oxidasas catalizan la eliminación de hidrógeno de un sutrato usando al oxígeno como aceptor
de hidrógeno. Forman agua o peróxido de hidrógeno como un producto de la reacción. Las
deshidrogenasas no entregan los electrones directamente al oxígeno y requieren la participación de
cofactores para transferir el oxígeno. Los sustratos oxidables ceden sus electrones a cofactores que los
transportan hasta los citocromos de la cadena respiratoria mitocondrial, la cual está constituida por una
serie de enzimas que se protonan eslabonadamente de acuerdo a sus potenciales de óxido-reducción
hasta reducir al oxígeno, para formar agua. Existen tres centros de formación de ATP en la cadena
respiratoria mitocondrial cuando los electrones provienen del NAD reducido, estos son:

117
- Paso de los electrones del NAD al FAD FMN

- Paso de los electrones del Cit.b al Cit.c
- Paso de los electrones del Cit. oxidasa al O2
MATERIAL
1. Reactivos: Sucrosa 0.25 M
Succinato de sodio 0.1 M
Malonato de sodio 0.5 M
Buffer fosfato pH 7.4 0.1 M
Azul de metileno 0.05%
Aceite mineral
Pipetas
Morteros
Centrífuga
METODO DE TRABAJO
A) PREPARACION DEL HOMOGENIZADO.- Colocar un mortero sobre hielo picado, luego pesar 10.0 g.
de hígado, corazón o músculo de rata o de conejo; picarlo y colocarlo sobre el mortero. Añadir 90.0 ml de
sucrosa 0.25 M la cual debe estar fría, homogenizar y luego centrifugar a 8000 rpm durante 10 min.
Decantar el sobrenadante en un beaker y guardarlo en frío hasta su uso.
Tubo N° 1 2 3 4
Succinato de sodio 0.1 0.5 0.5 0.5

Buffer fosfato pH 7.4 2.0 2.0 2.0 2.0
Malonato de sodio 0.5
Cianuro de potasio 0.1 M 0.5
Agua destilada 1.5 1.0 0.5 0.5
Azul de metileno 0.05% 0.5 0.5 0.5 0.5
Extracto enzimático 0.5 0.5 0.5 0.5
Aceite mineral 1.0 1.0 1.0 1.0
El contenido de cada uno de los tubos se mezcla rápidamente antes de agregar el aceite mineral,
el cual tiene la función de crear un medio libre de oxígeno. Llevar a baño maría a 37°C observar el
decoloramiento de cada tubo cada 5 min. Discuta los resultados.

118
CUESTIONARIO
1. Escriba la reacción de la oxidación del succinato por acción de la succinato deshidrogenasa, además
acople la cadena respiratoria para indicar el destino final del hidrógeno y de los electrones del
succinato.
2. Cuál es el efecto de cada uno de los siguientes inhibidores sobre el transporte electrónico y la
formación de ATP en la cadena respiratoria.
a) Azida
b) Atractilósido
c) Rotenona
d) Monóxido de carbono
e) Antimicina A
3. Escriba tres reacciones químicas de oxido-reducción (diferente a las descritas) de ocurrencia celular
y donde se aprecie pérdida de hidrógenos por parte del sustrato.
4. Cual es el aceptor final de electrones normal en las mitocondrias y cual es el utilizado en el experimento?

119
PRÁCTICA 12. HIDRÓLISIS DE CARBOHIDRATOS
OBJETIVOS:
1. Demostrar la hidrólisis del almidón
2. Verificar los diferentes tipos de hidrólisis: por acción de ácido y enzimática
3. Verificar a través de reacciones especificas la desaparición de almidón y la aparición de azucares
reductores durante la hidrólisis.
FUNDAMENTO:
HIDROLSIS ÁCIDA: Por calentamiento de una solución de almidón en presencia de HCl, se hidrolizan los
enlaces glicosidicos. En función del tiempo de hidrólisis se encuentran como productos dextrinas y
oligosacaridos, siendo el producto final de la hidrólisis acida la glucosa. Las dextrinas dependiendo de su
tamaño y complejidad molecular dan lugar a diferentes coloraciones con el yodo: las dextrinas mayores
pueden dar un color azul o purpura, las de tamaño intermedio dan un color rojizo, y las más pequeñas no
dan color en presencia de yodo.
La reacción de hidrólisis del almidón puede ser seguida por la reacción con ácido 3,5-dinitrosalicilico
o con otros reactivos que determinen la concentración de azucares reductores que se forman durante el
curso de la hidrólisis.
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA: Las amilasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de almidón y están
ampliamente distribuidas en la naturaleza: la alfa amilasa de la saliva y del jugo pancreático, la beta
amilasa de la malta, la gama amilasa de los hongos, etc. La clasificación de las amilasas se realiza de
acuerdo a su modo de acción sobre los homoglicanos, es decir, las amilasas son endoenzimas, es decir,
actúan en el interior de la molécula, las beta y gama amilasas son exoenzimas, actúan a partir de los
extremos no reductores del polímero. La alfa amilasa salival y pancreática, catalizan la hidrólisis de los
enlaces glicosidicos (14) de la amilosa, amilopectina y del glucogeno produciendo inicialmente
oligosacaridos de 6 a 7 unidades de glucosa, los que posteriormente son degradados a maltotriosa y
maltosa.
La maltosa no es sustrato para la enzima. La glucosa puede aparecer entre los productos finales
de la reacción, siempre que el tiempo de acción de la enzima sobre los glucanos sea prolongado. Debido
a que el almidón está constituido por un polímero lineal (amilosa) de glucosa, que contiene enlaces
(14) y un polímero ramificado que contiene enlaces (14) y (16) (amilopectina), y debido a que
la amilasa es una enzima específica para enlaces (1 4), su acción sobre el almidón también producirá
oligosacaridos resistentes a la acción enzimática a causa de la presencia de los enlaces (16).

120
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO N°1. EXPERIMENTO HIDROLISIS ACIDA DEL ALMIDÓN
FUNDAMENTO
Durante el calentamiento del almidón con HCl diluido, este se descompone en fragmentos de
diferente tamaño llamados dextrinas. Estas se distinguen entre sí por la masa molecular y por el color que
dan en presencia de yodo. A continuación se da un esquema de la hidrólisis ácida del almidón:
Almidón + I2 azul
Amilodextrinas + I2 Violeta azul
Eritrodextrinas + I2 Pardo rojiza
Acrodextrinas + I2 incolora
Maltodextrinas + I2 incolora
Maltosa + I2 incolora
Glucosa + I2 incolora
MATERIAL
Pipetas
Gradillas
Baño maría
2. Reactivos: Almidón al 1%
Solución de Lugol (20 gr de ioduro potásico y 10 gr de yodo en 100 ml de agua)
Reactivo alcalino de cobre
HCl concentrado
METODO DE TRABAJO
Vierta 10.0 ml de solución de almidón en un tubo de ensayo; añadir 4 gotas de ácido clorhídrico
concentrado. Tomar 0.5 ml de la muestra y colocarla en 5.0 ml de agua destilada, agite y añada 1 gota de
lugol. Anote el color que aparece. Luego coloque la muestra en baño maría hirviente. Después de 1 minuto
se toma una muestra para la reacción con yodo. Para esto se extrae 0.5 ml de solución y se vierte en un
tubo de ensayo que contiene 5.0 ml de agua destilada, se agita y se añade 1 gota de lugol. El color azul
violeta indica la presencia de amilodextrinas en la solución. Se repita la misma operación cada minuto,
hasta que la prueba de lugol nos dé negativa.
Para comprobar que lo que ha quedado en el tubo es glucosa, tomar 2.0 ml de muestra y añadir
2.0 ml del reactivo de cobre. Colocar en baño maría hirviente hasta observar un precipitado rojo ladrillo.
En la siguiente tabla anote loscambios de color observados:

121
Tiempo (minutos) 0 1 2 3
Color observado
¿A qué se deben los cambios de color observados?
¿Cómo se puede aplicar este experimento en la industria alimentaria?
EXPERIMENTO N° 2. HIDROLISIS ENZIMATICA DEL ALMIDÓN
FUNDAMENTO
Por acción de la amilasa el almidón se hidroliza para dar lugar al disacárido maltosa, que luego se
hidroliza por acción de la maltasa hasta glucosa.
MATERIAL
Pipetas
Gradillas
Baño maría
2. Reactivos: Almidón al 1%
Solución de Lugol (20 gr de ioduro potásico y 10 gr de yodo en 100 ml de agua)
Reactivo alcalino de cobre
Solución de saliva diluida (1:5)
METODO DE TRABAJO
Verter en un tubo de ensayo 5.0 ml de la solución de almidón; añadir 1.0 ml de solución de saliva

122
diluida. Tomar 0.5 ml de la muestra y colocarla en 5.0 ml de agua destilada, agite y añada 1 gota de lugol.
Anote el color que aparece. Luego coloque la muestra en baño maría a 37 °C. Después de 3 segundos se
toma una muestra para la reacción con yodo. Para esto se extrae 0.5 ml de solución y se vierte en un tubo
de ensayo que contiene 5.0 ml de agua destilada, se agita y se añade 1 gota de lugol. Se repita la misma
operación cada minuto, hasta que la prueba de lugol nos dé negativa.
Para comprobar que lo que ha quedado en el tubo es glucosa, tomar 2.0 ml de muestra y añadir
2.0 ml del reactivo de cobre. Colocar en baño maría hirviente hasta observar un precipitado rojo ladrillo.
En la siguiente tabla anote los cambios de color observados:
Tiempo (minutos) 0 1 2 3
Color observado
¿A qué se deben los cambios de color observados?
¿Cómo se puede aplicar este experimento en la industria alimentaria?
CUESTIONARIO
1. Con relación a la naturaleza de los productos de la hidrólisis, diferenciar la acción de un ácido mineral
y la alfa amilasa salival sobre el almidón.
2. Cuál es el fundamento del método del ácido 3,5 Dinitrosalicilico para el dosaje de azucares reductores.
3. Cuál es el fundamento del metodo del reactivo alacalino de cobre para el dosaje de azucares
reductores.
4. Explicar los resultados obtenidos en las hidrólisis acida y enzimatica del almidon, en funcion de la
evolucion de los colores obtenidos (A los 0, 5, 10, 20, 40 minutos) con el yodo.

123
5. Suponiendo que la hidrólisis acida del almidón fuera parcial al punto de permitir el aislamiento de
disacaridos, cuál sería la estructura de los mismos (Tipos de enlaces glicosidicos)?. Recordar que el
almidón está constituido por dos tipos de polisacaridos.

124
PRÁCTICA 13: HIDROLISIS DE TRIGLICERIDOS POR LIPASA

PANCREATICA
FUNDAMENTOS
Gran parte de los alimentos que ingiere un individuo está constituido por grasas, en los cuales los
triglicéridos constituyen un 90%. Los triglicéridos a nivel del intestino proximal, se hidrolizan en sus
componentes debido a la acción de la LIPASA PANCREATICA, cuya acción se incrementa por la presencia
de sales biliares que favorecen su emulsión. La lipasa pancreática actúa en un rango de pH de 7.8 a 8.0.
Los triglicéridos se hidrolizan en ácidos grasos, glicerol, monoglicéridos y diglicéridos. todos estos
componentes son emulsionados hasta pequeñas micelas que se absorben fácilmente.
Los aceites son lípidos constituidos básicamente de ácidos grasos insaturados, como el palmítico,
esteárico y el ácido mirístico.
La hidrólisis de los triglicéridos del aceite de oliva usando pancreatina (extracto de enzimas
pancreáticas) liberará ácidos grasos que podrán ser titulados.
EXPERIMENTO N° 1. HIDROLISIS DEL ACEITE DE OLIVA POR LA LIPASA PANCREATICA.
MATERIALES
1. Aparatos:
Tubos de ensayo
Baño maría
Pipetas
2. Reactivos:
Buffer fosfato pH 8.0: A 100.00 ml de fosfato monopotásico 0.2 M, se le agrega 93.6 ml de NaOH
0.2 M y se completa a 400.00 ml con agua destilada.
Solución de sales biliares al 1% en buffer fostato pH 8
Solución de pancreatina al 1% en suero fisiológico o buffer fosfato pH 8.0
Fenolftaleína al 0.1%
Hidróxido de sodio 0.01 N.
Emulsión de aceite: Agregar 5 gotas de fenolftaleína a 100.00 ml de aceite de oliva y la cantidad
suficiente de hidróxido de sodio 0.01 N para neutralizar. Se detiene la titulación cuando aparece

125
un color rosa tenue.
METODO DE TRABAJO
Tubo N° 1 2 3 4 5 6
Emulsión de aceite 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0

Buffer fosfato pH 8.0 2.0 2.0
Sol. de sales biliares 2.0 2.0
Sol. pancreatina 2.0 2.0 2.0
Sol. pancreatina hervida 2.0 2.0 2.0
Agua destilada 2.0 2.0
Mezclar y colocarlos en baño maría a 37 °C durante 30 min, agitando los tubos a intervalos. Al
finalizar el tiempo de incubación, retirar los tubos del baño maría y agregar a cad uno 3 gotas de
fenolftaleína y realizar la titulación de ácidos grasos liberados, por acción d ela lipasa sobre las grasas,
con NaOH 0.01 N hasta que aprezca una coloración rosada. Anotar el volumen de álcali gastado en cada
tubo. Calcular el númeo de equivalentes de ácidos presentes en cada tubo.
1 2 3 4 5 6
ml de NaOH gastados
Equivalentes de ácido
CUESTIONARIO
1. Explique cuál es la función de las sales biliares en la actividad de la lipasa pancreática.
2. Explique cómo es afectada la actividad de la lipasa cuando en el medio de reacción no existen sales
biliares.
3. Describa brevemente el mecanismo de acción de la lipasa sobre los triacilglicéridos.

126
4. Investigue acerca de los factores que afectan la actividad de la lipasa pancreática (pH óptimo,
inhibidores, activadores, temperatura óptima, etc).

127
PRÁCTICA 14: CARACTERIZACION Y CUANTIFICACION DE

CARBOHIDRATOS
Introducción
Los carbohidratos son compuestos polifuncionales que contiene grupos carbonilo (aldehído o cetónico) y
grupos hidroxilo alcohólicos. Por esto; poseen propiedades de aldehídos y cetonas y de alcoholes
polihidroxílicos. Los carbohidratos se dividen en monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.
Los monosacáridos pueden unirse entre sí mediante un proceso denominado síntesis por condensación o
deshidratación. En dicho proceso se unen dos o más monosacáridos para formar un disacárido, trisacárido,
tetrasacárico, etc. liberándose una molécula de agua. La fórmula general de los carbohidratos es (CH2O)n.
Todos los monosacáridos naturales que tienen átomos de carbono asimétrico, son ópticamente activos y
desvian el plano de la luz polarizada.
Los oligosacáridos y los polisacáridos son carbohidratos complejos, los cuales, al ser calentados con
ácidos diluidos o hidrolizados por enzimas, se desintegran en monosacáridos. Los polisacáridos poseen
una masa molecular muy elevada, son insolubles en agua y la mayoría de ellos forman soluciones
coloidales.
Los carbohidratos están muy difundidos en la naturaleza, sobre todo en el reino vegetal. Constituyen los
productos finales de la fotosíntesis en las plantas verdes. Los animales, incapaces de tal acumulación de
energía solar, aprovechan las sustancias acumuladas por las plantas. Los carbohidratos participan en la
construcción de las estructuras del organismo vivo, sirve como material para la biosíntesis de otro tipo de
compuestos y juega un papel importante en la bioenergética de la célula. Los carbohidratos entran a formar
parte de los ácidos nucleicos las glicoproteínas, glicolípidos y de algunas vitaminas y coenzimas. Como
integrantes de las glicoproteínas, participan en la formación de la capa externa adyacente a la membrana,
que desempeña un papel importante en la protección de las células contra la penetración en ellas de
microorganismos y virus. Estos carbohidratos están relacionados con las propiedades inmunoquímicas de
los tejidos.
PARTE EXPERIMENTAL
REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LOS

CARBOHIDRATOS
EXPERIMENTO N° 1. FORMACION DE FURFURALES
FUNDAMENTO
Esta reacción es general para los hidratos de carbono y se aplica para detectar su presencia en los
materiales biológicos. Por acción del ácido sulfúrico concentrado se forma furfural a partir de pentosas 5-
hidroximetilfurfural a partir de las hexosas. Cuando estos se combinan con el a-naftol aparece un color
violeta característico, y al combinarse con timol da una coloración roja.
MATERIAL

128
Pipetas
Gradillas
2. Reactivos: Timol al 1% en alcohol etílico
a-Naftol al 0.2% en alcohol etílico
Ácido sulfúrico concentrado
Soluciones al 1% de almidón, glucosa, maltosa, sacarosa, etc.
METODO DE TRABAJO
En cada uno de los tubos de ensayo colocar 2.0 ml de solución de carbohidrato. Añadir 4 gotas de
a-Naftol o Timol. Luego añadir, por las paredes del tubo, 2.0 ml de ácido sulfúrico concentrado teniendo
cuidado que no se mezcle con la capa acuosa. En la interfase aparecerá una coloración violeta (a-Naftol)
o roja (Timol).
Anote sus resultados en la siguiente tabla:
Carbohidrato Glucosa Sacarosa Almidón
¿Anillo de color rojo?
¿A qué se debe la coloración en la interface?
¿Cuál es la importancia o cómo aplicaría este experimento?
EXPERIMENTO N° 2. REACCIONES DE REDUCCIÓN:

129
PRUEBA DEL HIDRÓXIDO CÚPRICO.
FUNDAMENTO
Los carbohidratos que en su molécula poseen un grupo carboxilo libre, se llaman reductores. Estos
azúcares, en un medio alcalino tienen la capacidad de oxidarse, reduciendo a su vez las sales de óxido
cúprico (Cu+2) a sales de óxido cuproso (Cu+). Esta es la base para una serie de métodos de determinación
cualitativa y cuantitativa de carbohidratos. En solución alcalina los monosacáridos y disacáridos reductores
reducen el hidróxido cúprico (II) en óxido cuproso (I).
°T
C6H12O6 + 2Cu(OH)2 C5H11-COOH + 2CuOH + H2O
Glucosa Ac. Glucónico

H2O
Cu2O
MATERIAL
Pipetas
Gradillas
Baño maría
2. Reactivos: Reactivo alcalino de cobre
Soluciones al 1% de almidón, glucosa, maltosa,sacarosa, etc.
MÉTODO DE TRABAJO
En los tubos de ensayo vierta 2.0 ml de solución de carbohidratos; luego añada 2.0 ml del reactivo
de cobre, agite. Colocar en baño maría hirviente. La aparición de un precipitado de color rojo (óxido
cuproso) indica la presencia de carbohidratos reductores.
En otro tubo de ensayo colocar 2.0 ml del reactivo alcalino de cobre. No se añade carbohidrato. Al
calentar esta solución, se forma un precipitado negro de óxido cúprico. Por esta razón en esta reacción se
debe evitar el exceso de hidróxido cúprico o sulfato cúprico ya que la reacción entre el glúcido reductor y
el Cu(OH)2 se da cuantitativamente. El exceso del último durante el calentamiento pierda agua y se
transforma en óxido cuproso, lo cual oscurece la reacción principal y constituye un defecto del método.
Cu(OH)2 CuO + H2O

130
Anote sus resultados en la siguiente tabla:
Carbohidrato Glucosa Sacarosa Almidón
¿Anillo de color rojo?
¿A qué se debe la formación del precipitado de color rojo ladrillo?
¿Cuáles de los carbohidratos utilizados son reductores y porqué?
¿Cuál es la importancia o la aplicación de este experimento?
EXPERIMENTO N° 3. CUANTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS TOTALES EN ALGAS POR EL

METODO DE DUBOIS
El metodo de fenol ácido sulfurico de Dubois y colaboradores(1956) es un procedimiento

colorimétrico simple para carbohidratos disueltos. Los azucares simples, oligosacaridos, polisacaridos y
compuestos derivados que tienen grupos reductores libres o potencialmente libres dan un color anaranjado
– amarillo cuando se trata de denol y acido sulfurico concentrado. La reacción es sensible, estable y también
poco costosa. Los carbohidratos insolubles (como la celulosa) pueden determinarse por sustracción
después de determinar las proteinas, lípidos, cenizas y carbohidratos solubles.
PROCEDIMIENTO:
1. Pese 5 mg de las algas secas homogenizadas y colóquelas en un tubo de centrífuga de 10 ml.
2. Llene con 10 ml de TCA al 5% (acido Tricloroacetico) en agua(al nivel de la marca del tubo para retornar
el volumen original después de calentar la muestra).
3. Caliente en baño maria caliente durante 3 horas de (80 a 90 °C) Agite moderadamente los tubos al
menos dos veces para asegurar una adecuada extracción. Este paso debe estandarizarse para todas
las series.
4. Saque los tubos del baño maria, enfrielos y ajustelos al volumen (de la marca) original con agua
destilada. Centrifuge durante 10 minutos a la mayor velocidad en una centrifufa estandar.

131
5. Pipetee 0.2 ml de la alícuota en un tubo de prueba. Coloque uno de los dedos de su mano sobre la
pipeta e inserte el tubo a través de la supreficie antes de tomar la muestra para evitar que se forme
espuma.
6. Añada 1 ml de fenol al 5% y mezcle golpeando el tubo de prueba.
7. Añada rápidamente 5 ml de H2SO4 concentrado y mezcle golpeando el tubo. Esta es una reacción
exotermica.
8. Deje que se enfrie el tubo (durante 30 minutos) y lea a 490 nm (Filtro azul)
9. Haga los calculos con la siguiente formula:
%deCarbohidratos  mgdecarbohidratos
mg det ejidoutilizado x100
Nota: mg de carbohidratos = (mg de carbohidratos en 0.2 ml ) x ( 50). Los mg de carbohidratos en 0.2 ml

se obtienen a partir de la curva estandar.
CURVA ESTANDAR DEL GLUCÓGENO

1. Pese 25 mg de glucógeno (de grado analitico)
2. Diluya en una fiola de 50 ml con TCA al 5%
3. Haga una serie de diluciones:
Solución estandar (ml) TCA al 5% (ml) Glucógeno resultante (mg)
0.20 0.00 0.100

0.15 0.05 0.075
0.10 0.10 0.050
0.05 0.15 0.025
0.00 0.20 0.000
4. A cada tubo (con 0.2 ml) añada un ml de fenol al 5%.

5. Añada 5 ml de H2SO4, espere 30 minutos y lea a 490 nm.
6. Traze un curva estandar con lo mg de carbohidratos contra la densidad óptica.
CUESTIONARIO
1. Dibuje las proyecciones de Haworth de lo siguiente:

132
a) β-D-N-Acetilglucosamina
b) β-D-Fructofuranosa
c) β-D-Glucopiranosa
d) β-D-Glucosa-1-fosfato
e) Acido N-acetilmurámico
2. Cuál es el principio de la formación de furfurales.
3. ¿Cuál es el principio de la reacción de reducción de los carbohidratos?
4. ¿Explique, porque la sacarosa es un carbohidrato no reductor?
5. ¿Explique, porque la glucosa, maltosa y lactosa son carbohidratos reductores?
6. Analice la estructura de la molécula de almidón y explique si éste puede exhibir poder reductor frente
al ion Cu++.

133
PRÁCTICA 15: ANÁLISIS DE LIPIDOS
INTRODUCCIÓN
Los lípidos son un grupo heterogéneo de compuestos emparentados, con los ácidos grasos. Son
constituyentes importantes de la alimentación no solo por su elevado valor energético, sino también por
las vitaminas liposolubles y los ácidos grasos esenciales contenidos en la grasa de los alimentos naturales.
SOLUBILIDAD
Es importante tener presente que la solubilidad de los lípidos, en general, dependen de la relación
numérica entre el número de grupos hidrófilos de hidrófobos de los ácidos grasos, mientras que los grupos
hidrófobos están representados por el resto de la cadena hidrocarbonada. De esto se desprende que,
cuanto más larga sea la cadena hidrocarbonada del ácido graso, la relación entre los grupos mencionados
será tanto menor y menos soluble, en agua, será el ácido graso. La solubilidad en los solventes orgánicos,
por el contrario, depende de la afinidad del solvente por la cadena carbónica no funcional.
INDICE DE ACIDEZ
Se define como el número de mg de KOH necesarios para neutralizar 1 gr. de grasa. Está en
relación con la cantidad de ácidos grasos libres presentes en la grasa. Tiene interés porque nos indica el
estado de conservación y el grado de ranciamiento de una grasa, puesto que todo tipo de grasa tiene una
cantidad característica de ácidos grasos libres, más allá del cual significa alteración.
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO N° 1. SOLUBILIDAD DE LOS LIPIDOS

FUNDAMENTO
Los grupos principales de los lípidos tienen características de solubilidad diferentes y esta
propiedad se usa en su extracción y purificación a partir de materiales biológicos. La mayoría de los lípidos
son solubles en etanol al 95%, pero forman una emulsión de gotas pequeñas cuando se les agrega agua.
Esto da a la suspención una apariencia lechosa característica y constituye una prueba muy sencilla para
grasas.
MATERIAL
1. De Vidrio: Tubos de ensayo
Pipetas
2. Reactivos: Alcohol
Acetona
Eter Dietílico
Cloroformo
Aceite de Oliva

134
METODO DE TRABAJO
5
TUBOS 1 2 3 4 Solubilidad
Agua destilada (ml) 2.0 - - - - …………………..

Alcohol frío (ml) - 2.0 - - - …………………..
Alcohol caliente (ml) - - 2.0 - - …………………..
Eter (ml) - - - 2.0 - …………………..
Acetona (ml) - - - - 2.0 …………………..
Aceite de oliva (gotas) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 …………………..
Agitar enérgicamente, dejar en reposo. Observar y anotar los resultados obtenidos en cada uno de los
tubos.
EXPERIMENTO N° 2. DETERMINACIÓN DEL VALOR DE ACIDEZ DE UNA GRASA
FUNDAMENTO
Las grasas almacenadas pueden sufrir enranciamiento debido a la oxidación de los dobles enlaces
para formar peróxidos y a su hidrólisis por microorganismos con liberación de ácidos grasos. La cantidad
de ácidos grasos libres da, por lo tanto, un índice de la frescura y calidad de la grasa.
El presente experimento consiste en disolver la muestra con un solvente neutralizado y en titular la

acidez con una solución de KOH de normalidad conocida. Es decir, se titulan los ácidos grasos libres.
MATERIAL
1. De Vidrio: Matraz
Beaker
2. Reactivos: Cloroformo
Alcohol al 95%
Fenolftaleína al 1%
KOH 0.1 N
Aceite de Oliva

135
METODO DE TRABAJO
Proceder de la siguiente manera:
1. Neutralización de los solventes.- En un matraz se mezclan 25 ml de cloroformo y 50 ml de alcohol, se
agregan 4 gotas de fenolftaleína, seguidamente se titula con KOH, hasta que aparezca un leve color
rosado que persista durante 30 seg.
2. En un beaker previamente tarado, pesar 10 g. de grasa (aceite de oliva u otra grasa), agregar la mezcla
alcohol-cloroformo neutralizado, mezclar bien la grasa con los disolventes. Se agrega 4 gotas de
fenolftaleína y se valora inmediatamente con KOH, hasta que el color rosado pálido permanezca por
más de 30 seg. Anote el número de mililitros gastados de álcali y calcule el índice de acidez de la
grasa.
Aceite de oliva
Gasto de KOH (ml)
(𝑛)(0.056)(1000) (𝑛)(5.6)
𝐼. 𝐴 = =
𝑃 𝑃
Donde:
I.A. = Indice de Acidez
n = ml de KOH 0.1 N usados en la titulación.
1 ml de esta solución es igual a 0.0056 g. de KOH.
P = Peso de la muestra problema
Si se desea expresar en términos de % de ácidos grasos libres, referidos a ácido oleico, con los mismos
datos tendremos:
(𝑛)(0.0282) (𝑛)(2.82)
% 𝑑𝑒 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 = 𝑥 100 =
𝑃 𝑃
0.0282 = 1 g. de ácido oleico (PM = 282).
¿Qué indica este valor, respecto al estado de conservación y aptitud para el consumo de la grasa utilizada?

136
EXPERIMENTO N 3. CARACTERIZACIÓN DE LOS TRIACILGLICEROLES DE ACEITES
OBJETIVOS
- Caracterizar triacilgliceroles a través de la hidrólisis alcalina (reacción de saponificación)
- Evidenciar la formación de los productos de la hidrólisis (jabones) por sus propiedades
REACTIVOS
- Solución de potasa alcohólica: 1 volumen de hidróxido de potasio al 40% y 1 volumen de etanol al 95%
- Aceite de pescado
- Acido acético concentrado
- Solución saturada de cloruro de sodio
PROCEDIMIENTO
1. En un tubo de ensayo grande colocar 15 gotas de aceite de pescado y 5 ml de solución de potasa
alcohólica. Adicionar perlas de porcelana para evitar la ebullición tumultuosa. Calentar en baño María
hirviente durante 30 minutos. En estas condiciones, el aceite es saponificado obteniéndose una solución
opalescente de sales de potasio de ácidos grasos (jabones) y glicerol.
2. Repartir la solución de jabones en cuatro tubos de ensayo y realzar las siguientes pruebas:
a) Disminución de la tensión superficial: agitar la solución de jabones y verificar la formación de espuma,
b) Precipitación de ácidos grasos: al segundo tubo adicionar, gota a gota, ácido acético concentrado
hasta notar la aparición de un precipitado blanco de ácidos grasos, que son insolubles debido a su
bajo grado de disociación,
c) Precipitación de jabones de calcio: al tercer tubo adicionar cloruro de calcio al 10%, gota a gota, hasta
notar la aparición de u precipitado de jabones de calcio,
d) Precipitación por exceso de electrolitos: al cuarto tubo adicionar igual volumen de solución saturada
de cloruro de sodio, Observar la formación de un precipitado de jabón por exceso de sales neutras,
debido al efecto del ion común, que impide la disociación de los jabone haciendo que las miscelas
pierdan la carga y precipiten.
Tubo 1 2 3 4
Disminución dela tensión superficial
Precipitación de ácidos grasos
Precipitación de jabones de calcio
Precipitación por exceso de electrolitos
CUESTIONARIO
1. Escribir la reacción de hidrólisis alcalina de un triglicérido diferente de la trioleína
2. ¿Porque se utiliza etanol e la reacción de saponificación?
3. Explicar la acción detergente de los jabones.
4. Explicar la precipitación de los jabones por exceso de electrolitos.

137
PRÁCTICA 16. LAS RUTAS METABÓLICAS
OBJETIVO
Reconocer la degradación de la glucosa, dando por consiguiente el proceso de la glucólisis y respiración
(ciclo de Krebs).
FUNDAMENTO TEÓRICO
La degradación de la glucosa es realizada por el proceso de glucólisis en el citoplasma por la acción del
ADP obteniendo acido Pirúvico, De acuerdo a las circunstancias puede realizarse dos procesos:
1.- Sin oxígeno obtenemos el proceso de fermentación con la obtención de etanol o ácido láctico.
2.- Con oxígeno pasando al ciclo de Krebs obteniendo diferentes sustancias, la cual se realiza en las
mitocondrias.
LA GLUCÓLISIS:
Comienza con una molécula de glucosa. En este proceso, primero se invierte energía por transferencia de
un grupo fosfato desde una molécula de ATP, una por cada paso, a la molécula de azúcar. La molécula de
6 carbonos luego se escinde y, de allí en adelante, la secuencia produce energía. En cierto momento se
reduce una molécula de NAD+ a NADH e H+ almacenándose parte de la energía producida por la oxidación
del gliceraldehído fosfato. En los pasos finales las moléculas de ADP toman energía del sistema,
fosforilándose a ATP.
Glucosa+2ATP+4ADP+2Pi+2NAD => 2Ácido pirúvico+2ADP+4ATP+2NADH+2H+2H2O

De esta forma, una molécula de glucosa se convierte en dos moléculas de ácido pirúvico. La ganancia neta,
la energía recuperada, es dos moléculas de ATP y dos moléculas de NADH por molécula de glucosa. Las
dos moléculas de ácido pirúvico contienen todavía una gran parte de la energía que se encontraba

138
almacenada en la molécula de glucosa original. La serie de reacciones que constituyen la glucólisis se lleva
a cabo virtualmente en todas las células vivas, desde las células procarióticas hasta las células eucarióticas
de nuestros propios cuerpos.
LAS VIAS AEROBICAS - RESPIRACIÓN:

En el curso de la respiración, las moléculas de tres carbonos de ácido pirúvico producido por la glucólisis
son degradadas a grupos acetilo de dos carbonos, que luego entran al ciclo de Krebs. En una serie de
reacciones en el ciclo de Krebs, el grupo acetilo de dos carbonos es oxidado completamente a dióxido de
carbono. En el curso de la oxidación de cada grupo acetilo se reducen cuatro aceptores de electrones (tres
NAD+ y un FAD) y se forma otra molécula de ATP.
EL CICLO DE KREBS
En el ciclo de Krebs. Los carbonos donados por el grupo acetilo se oxidan a dióxido de carbono y los
electrones pasan a los transportadores de electrones. Lo mismo que en la glucólisis, en cada paso
interviene una enzima específica. La coenzima A es el nexo entre la oxidación del ácido pirúvico y el ciclo
de Krebs. A modo de resumen: en el ciclo de Krebs se producen una molécula de ATP, tres moléculas de
NADH y una molécula de FADH2 que representan la producción de energía de este ciclo. Se necesitan dos
vueltas del ciclo para completar la oxidación de una molécula de glucosa. Así, el rendimiento energético
total del ciclo de Krebs para una molécula de glucosa es dos moléculas de ATP, seis moléculas de NADH
y dos moléculas de FADH. La etapa final de la respiración es el transporte terminal de electrones, que
involucra a una cadena de transportadores de electrones y enzimas embutidas en la membrana interna de
la mitocondria. A lo largo de esta serie de transportadores de electrones, los electrones de alta energía
transportados por el NADH de la glucólisis y por el NADH y el FADH2 del ciclo de Krebs van "cuesta abajo"
hasta el oxígeno. En tres puntos de su pasaje a lo largo de toda la cadena de transporte de electrones, se
desprenden grandes cantidades de energía libre que impulsan el bombeo de protones (iones H+) hacia el
exterior de la matriz mitocondrial. Esto crea un gradiente electroquímico a través de la membrana interna
de la mitocondria. Cuando los protones pasan a través del complejo de ATP sintetasa, a medida que
vuelven a fluir a favor del gradiente electroquímico al interior de la matriz, la energía liberada se utiliza para
formar moléculas de ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico. Este mecanismo, en virtud del cual se lleva
a cabo la fosforilación oxidativa, se conoce como acoplamiento quimiosmótico.
En esta representación de la cadena respiratoria, las moléculas que se indican: flavina mononucleótido
(FMN), coenzima Q (CoQ) y los citocromos b, c, a y a3, son los principales transportadores de electrones
de la cadena. Al menos otras nueve moléculas transportadoras funcionan como intermediarias además de
las que se muestran aquí. Los electrones transportados por la NADH entran en la cadena cuando son
transferidos a la FMN, que entonces se reduce (azul). Casi instantáneamente, el FMN cede los electrones
al CoQ. El FMN vuelve así a su forma oxidada (naranja), listo para recibir otro par de electrones, y la CoQ
se reduce. CoQ entonces pasa los electrones al siguiente aceptor, y vuelve a su forma oxidada. El proceso
se repite en sentido descendente. Los electrones, al pasar por la cadena respiratoria, van saltando a niveles
energéticos sucesivamente inferiores. Los electrones que son transportados por el FADH2 se encuentran
en un nivel energético ligeramente inferior que los del NADH. En consecuencia, entran en la cadena de
transporte más abajo, a la altura de la CoQ. Los electrones finalmente son aceptados por el oxígeno, que
se combina con protones (iones hidrógeno) en solución, y forman agua.
Los electrones que son transportados por el FADH2 se encuentran en un nivel energético ligeramente
inferior que los del NADH. En consecuencia, entran en la cadena de transporte más abajo, a la altura de la

139
CoQ. Los electrones finalmente son aceptados por el oxígeno, que se combina con protones (iones
hidrógeno) en solución, para formar agua.
LAS VÍAS ANAEROBIAS: En ausencia de oxígeno, el ácido pirúvico puede seguir una de varias vías
llamadas anaeróbicas. Veremos brevemente dos de las vías anaeróbicas más interesantes. El ácido
pirúvico puede convertirse en etanol (alcohol etílico) o en uno de varios ácidos orgánicos diferentes, de los
cuales el ácido láctico es el más común.
En el primer paso de la glucólisis se desprende dióxido de carbono. En el segundo, se oxida el NADH y se

reduce el acetaldehído. La mayor parte de la energía química de la glucosa permanece en el alcohol, que
es el producto final de la secuencia. Sin embargo, regenerando NAD+, estos pasos permiten que la
glucólisis continúe, con su pequeño, pero en algunos casos vitalmente necesario, rendimiento de ATP.

140
Pasos por los cuales el ácido pirúvico, formado en la glucólisis, se convierte anaeróbicamente en etanol.
El ácido láctico se forma a partir del ácido pirúvico, por acción de una variedad de microorganismos y
también por algunas células animales cuando el O2 es escaso o está ausente.
Reacción enzimática que produce ácido láctico anaeróbicamente a partir de ácido pirúvico en las células
musculares. En el curso de esta reacción, el NADH se oxida y el ácido pirúvico se reduce. Las moléculas
de NAD+ producidas en esta reacción se reciclan en la secuencia glucolítica. Sin este reciclado, la glucólisis
no puede seguir adelante. La acumulación de ácido láctico da como resultado dolor y fatiga muscular.
OTRAS VÍAS CATABÓLICAS Y ANABÓLICAS:
La mayoría de los organismos no se alimentan directamente de glucosa. Otros alimentos son degradados
y convertidos a moléculas que pueden entrar en esta vía central.Dado que muchas de estas sustancias,
como las proteínas y los lípidos, pueden degradarse y entrar en la vía central, se puede suponer que es
posible el proceso inverso, o sea, que los distintos intermediarios de la glucólisis y del ciclo de Krebs pueden
servir como precursores para la biosíntesis. Y así es. Sin embargo, las vías biosintéticas, aunque son
semejantes a las catabólicas, se diferencian de ellas. Hay enzimas diferentes que controlan los pasos y
hay varios pasos críticos del anabolismo que difieren de los de los procesos catabólicos.
Para que ocurran las reacciones de las vías catabólica y anabólica debe haber un suministro constante de
moléculas orgánicas que puedan ser degradadas para producir energía y deben estar presentes moléculas
que serán los ladrillos de construcción. Sin el suministro de estas moléculas, las vías metabólicas dejan de
funcionar y la vida del organismo finaliza. Las células heterótrofas (incluyendo a las células heterótrofas de
los vegetales, tales como las células de las raíces) dependen de fuentes externas, específicamente de
células autótrofas, para obtener las moléculas orgánicas que son esenciales para la vida. Las células
autótrofas, por el contrario, son capaces de sintetizar monosacáridos a partir de moléculas inorgánicas
simples y de una fuente externa de energía. Luego, estos monosacáridos se utilizan no sólo para
suministrar energía, sino también como sillares de construcción para la variedad de moléculas orgánicas
que se sintetizan en las vías anabólicas. Las células autótrofas más importantes, sin lugar a dudas, son las
células fotosintéticas de las algas y las plantas que capturan la energía de la luz solar y la utilizan para
sintetizar las moléculas de monosacáridos de las cuales depende la vida en este planeta.

141
MATERIALES Y REACTIVOS
3.1 Muestra
 Azúcar o Uvas borgoña / Italia
 Hígado de res.
 Vela
 Aceite común
3.2 Material de vidrio

 Matraz
 Tapon de jebe con dos agujeros.
 Vasos precipitados 150 – 250 ml (12)
 pHmetro
 Bureta

142
 Varilla
 Matraz aforado de 50 ml
 pipeta graduada de 5,0 ml
 pipeta graduada de 1,0 ml
 Tubo de ensayo (12)
 Gradilla
 Termómetros
3.3 Reactivos
 Agua destilada
 Hidroxido de sodio
 Levadura
 Azul de metileno
 Buffer Fosfato
 Enzimas
METODOLOGÍA
Se utilizará la experimentación directa, acompañada de la observación y la deducción.
DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA
5.1 Práctica 1
1. Realizar un macerado del hígado con ayuda del mortero, con una adecuada cantidad de agua destilada.
2. Separar el extracto.
3. Sobre el extracto se coloca 10 ml. de buffer fosfato y 5 ml. de cloruro de sodio al 10%.
4. Se coloca 6 ml. De extracto en tubos de ensayo.
5. Se añade 2 ml. De una solución de azul de metileno. Mantenga un tubo a 37ºC y otro a temperatura
ambiente.
6. Luego observe el cambio de color del indicador y vuelva a incubar. Repetir dos veces. Repetir el
experimento dando condiciones de anaerobiosis parcial con el aceite y anaerobiosis total con la vela.
5.2 Práctica 2
1. Armar los instrumentos como el diseño:
Preparación de un fermento sin aire. Preparación de un fermento con aire

143
2. Aplicar en cada envase un caldo de cultivo conformado por:

 Azúcar 200 g.
 Agua 500 ml.
 Levadura 50 gr.
3. Controlar los parámetros de pH, temperatura, acidez.

4. Por espacio de 6 días
5. Apreciar los resultados y analizar llenando la siguiente tabla:
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Describir lo encontrado en la experiencia realizada y contestar las siguientes preguntas:
1. ¿Por qué el ácido pirúvico se convierte en ácido láctico sólo para volver a convertirse en ácido pirúvico?
2. ¿Cómo extraen energía de las grasas o de las proteínas?
.

144
Dia/ Horas de % Apariencia

pH Acidez Tº Observaciones
fecha monitoreo azúcar del caldo
Inicial: Hora:
24
24
12
12
12
12
12
12

145
PRACTICA 17: EXTRACCION E IDENTIFICACION DE DNA
Introducción
La Biología Molecular contemporánea se centra en: 1) como la información está ordenada en el
cromosoma, 2) como se procesa la información, 3) como se reproducen a sí mismas la información cada
vez que la célula se divide, y 4) como puede modificarse la información para generar nuevas instrucciones.
La regulación y el control de cada una de estas transacciones de información constituyen otro aspecto de
la biología molecular, disciplina que nos permite conocer la vida al facilitarnos la comprensión de las
funciones que desempeñan las macromoléculas.
Hoy se sabe que una sola molécula, el DNA, puede explicar en su totalidad los fenómenos de
codificación, procesamiento, replicación y modificación de la información. El DNA por lo tanto es el
responsable de la transmisión de la información de una generación a otra para conservar la continuidad
genética entre progenitores y descendientes
Uno de los procedimientos básicos en la biología molecular es la extracción y purificación de
moléculas de ácidos nucleicos (DNA o RNA), como primer paso a posteriores análisis.
Son varios los métodos utilizados para la extracción de DNA, todos ellos por lo general tienen el
mismo principio, es decir, empiezan con una lisis celular, seguido por una remoción de proteínas y por
último la obtención del DNA de alta pureza por precipitación etanólica.
Entre las técnicas más comunes de extracción de DNA, se considera:
- Hervir la muetra en agua destilada
- Acción de detergentes
- Acción de NaOH
- Acción de enzimas proteolíticas
- Uso de solventes orgánicos
- Sonicación
- Congelamiento y descongelamiento
Después de la extracción y purificación del DNA, el paso siguiente es la cuantificación del DNA.
Esta cuantificación es importante para posteriores análisis como PCR, secuenciación hibridación, etc. Tres
son los métodos más utilizados para la cuantificación, los cuales se diferencian en la precisión, así como
en la cantidad de muestra requerida. Dichos métodos son:
- Espectrofotometría
- Fluorometría
- Fluorescencia en Bromuro de Etidio
Otros métodos sólo nos determinan la presencia de bases nitrogenadas (espectrofotometría), la

identificación de desoxirribosas y la identificación de grupos fosfato.

146
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO N° 1. PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE DNA DE CEBOLLA
MATERIALES
1. Solución de lisis: preparar una solución 0.1% de SDS en EDTA 25 mmol de pH 8.0
1. Alcohol etílico al 95%
2. Reactivo de difenilamina: disolver 1 g de difenilamina en 100 ml de ácido acético glacial y adicionar
2.75 ml de ácido sulfúrico concentrado.
Beakers
Probetas
Baguetas
Media de nylon
Metodo de Trabajo
1. Pelar una cebolla de tamaño medio.
2. Rallar la cebolla con un rallador de cocina o utilizar un procesador de alimentos. Es importante que
no haya pedazos grandes de cebolla.
3. Pesar unos 25 g de cebolla rallada y añadir 50 ml de solución de lisis.
4. Dejar en reposo la mezcla a temperatrura ambiente por 10 a 20 minutos.
5. Filtrar la supensión a través de una doble capa de tela de nylon, recogiendo el filtrado en una probeta.
Anotar el volumen.
6. Transferir 4 ml del filtrado y colocar en un tubo de ensayo. Adicionar 2 volúmenes de etanol al 95%
procurando no mezclar las dos soluciones. Observar en la interfase la formación de un precipitado
blanquesino. Con la ayuda de una varilla de vidrio enrrollar el material blanquesino.
7. Transferir el material de la varilla de vidrio a otro tubo y disolverlo en 0.5 ml de agua. A esta solución
adicionarle 1.5 ml de reactivo de difenilamina.
8. En otro tubo de ensayo colocar 0.5 ml de agua y 1.5 ml de difenilamina. Colocar los dos tubos en
baño de agua hirviente por 10 minutos. Comparar los resultados obtenidos.
9. El filtrado restante (item 4) debe ser transferido a un vaso de precipitados y a esta solución se le
adiciona 2 volumenes de etanol al 95%. El material blanquesino que se forma en la interfase de las
dos soluciones se enrolla en una varilla de vidrio y se tranfiere a otro tubo de ensayo
10. Disolver el precipitado en 5 ml de agua con ayuda de una varilla de vidrio. Dividir esta solución en
dos tubos para observar los cambios d viscosidad en diferentes condiciones.
11. Pipetear la solución de uno de los dos tubos con una pipeta gradiada de 0.2 ml y cronometrar el
tiempo de deslizamiento de la solución a partir de la marca 0 ml hasta la marca 0.15 ml.
12. El otro tubo debe ser calentado en baño maria hirviente por 10 minutos. Después del periodo de
calentamiento, proceder como en el item 10 anotando en tiempo de deslizamiento.
13. Enfriar esta solución en hielo por 15 minutos y repetir el procedimiento 10.
14. Interpretar los resultados.
CUESTIONARIO
1. Cuál es la función de los componenetes de la solcuión de lisis?

147
2. A qué se debe la diferencia de viscosidad del DNA observada en los experimentos?
3. Para la extracción de DNA se puede utilizar proteinasas?. Si su respuesta es afirmativa, explique a que
componente podría reemplazar o en que paso sería apropiada utilizarla durante la extracción de DNA.
4. Averigue como se realiza una prueba de paternidad utilizando ADN.

148
BIBLIOGRAFIA
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7. Chang, R. (1986). Fisicoquímica con Aplicaciones a Sistemas Biológicos. C.E.C.S.A.
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14. Fiske y Subbarow (1925). J. Biol. Chem. 66. 375
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17. Goham, P.R. (1955). Preparation of chloroplasts and Desintegrates Chloroplasts. Met. In Enz. Vol. I.
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32. Montgomery, Rex y otros (1975). Problemas cuantitativos de las Ciencias Bioquímicas. Ed. Acribia
33. Moreland, D.E. (1967). Machanisms of Action of Herbicides. Ann Rev Plant Physiol 18, 365-386
34. Morris, J.G. (1976). Físico Química para Biólogos. Ed. Reverté
35. Nord, F.F. (Editor) (1951). Advances in Enzymology. Vol. XII. Interscience. New York. Pp. 379-395
36. Plummer, D.T. (1981). Bioquímica Práctica. McGraw-Hill
37. Price, N.C. y Dwek, R.A. (1969). Principios y Problemas de Química Física para Bioquímicos. Ed.
Acribia
38. Quintanilla Paulet, A. (1969). PH y Equilibrio Acido Básico. Arequipa
39. Rendina, G. (1974). Técnicas de Bioquímica Aplicada. Interamericana
40. Risen, W.M. y Flynn, G.P. (1979). Problemas de Química General y Ambiental. El Manual Moderno
41. Saunders, L. (1978). Físicoquímica para Estudiantes de Biología, Farmacia y Medicina. El Manual
Moderno.
42. Segel, I.H. (1982). Cálculos de bioquímica. Acribia
43. Wishniac, W. (1957). Methods for Study of the Hill Reaction. Met. In Enz. Vol. IV pp. 342-355

149
ANEXOS
Caso 1: Cólera
Un hombre de 38 años de edad con peso de 71 kg relata que su padecimiento actual se inició con anorexia,
dolor abdominal y diarrea. Un día después siguió con náusea intensa, vómito y diarrea muy abundante y
líquida. Ingresó al hospital con hipotensión postural y deshidratación. Se pudo aislar Vibrio cholerae
toxígeno de sus heces. El paciente mejoró rápidamente al reponerle agua, electrólitos y administrarle
tetraciclina por vía oral.
Preguntas de bioquímica
1. ¿Qué procesos de la membrana resultan afectados por Vibrio cholerae en un caso de cólera?
2. ¿Qué valores de laboratorio clínico podrían estar alterados en este paciente?
3. ¿Cuáles serían los datos de laboratorio que permitirían precisar el tratamiento hidroelectrolítico?
4. ¿Por qué en este caso hay que añadir glucosa al tratamiento hidroelectrolítico por vía oral?
5. ¿Cuáles son los signos de deshidratación?
6. ¿Cuál fue la situación ácido-base del paciente al momento de su ingreso al hospital?
Conceptos y áreas de aprendizaje

1. Describir la composición, las propiedades y las funciones de las membranas biológicas.
2. Estudiar la base bioquímica de algunos trastornos que afectan la función de las membranas.
3. Modelos de transporte transepitelial.
4. Describir los mecanismos por los cuales los organismos enteropatógenos ocasionan pérdida intestinal
de agua y electrolitos.
5. Control del agua y de la osmolaridad.
6. Equilibrio ácido-base.
7. Deshidratación y tratamiento de reposición hidroelectrolítica.
REFERENCIAS
1. Villazón SA, Cárdenas CO, Villazón DO, Sierra UA. Fluidos y
electrólitos. México: JGH Editores; 2000.
2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones
clínicas. 4a. ed. Barcelona: Editorial Reverté; 2004.
3. Montgomery R. Bioquímica: Casos y texto. 6a. ed. Barcelona:
Editorial Harcourt-Brace; 1998: cap. 4 y 12.

150
Caso 2: Oclusión intestinal. Acidosis metabólica. Deshidratación

grave
Se trata de un paciente masculino de 35 años de edad quien acude al servicio de urgencias de un
hospital por presentar dolor abdominal intenso acompañado de vómitos frecuentes y abundantes de
contenido intestinal. El paciente presenta un cuadro de deshidratación importante. A la exploración física
se obtuvieron los siguientes datos:
Tensión arterial (TA): 80/50 mmHg

Frecuencia cardiaca (Fc): 120/min
Frecuencia respiratoria (Fr): 32/min
Temperatura (T): 36o C
Los estudios de laboratorio mostraron lo siguiente:
Electrolitos séricos:
Na+ = 128 mEq/l
K+ = 2.8 mEq/l
Cl– = 100 mEq/l
Gasometría arterial:
CO2t = 12
pH = 7.29
pCO2 = 24 mmHg
pO2 = 95 mmHg
HCO3- = 11.2 mmol/l
EB (exceso de base) = 20
Química sanguínea:
Glucosa = 5.2 mmol/l (95 mg/dl)
BUN = 15 mmol/l
El tratamiento consistió, primero, en el restablecimiento del balance de líquidos con solución salina a
0.9%, electrólitos (reposición de K+ ) y cirugía.
1. Evaluar el estado ácido-base del paciente; tomar en cuenta los valores de pH y presión parcial de
bióxido de carbono (pCO2), el valor de bicarbonato plasmático (HCO3–), etcétera.
2. ¿Es normal el estado ácido-base del paciente? ¿Qué tipo de desequilibrio presenta? ¿Cuál podría ser
la causa de ese desequilibrio?
3. ¿Qué relación existe entre el metabolismo de los electrolitos y el agua y entre los trastornos ácido-base
y los electrolitos?
4. ¿Qué tipos de alteraciones de líquidos y electrolitos corporales existen?
5. ¿Cuáles son los signos de deshidratación?

151
CASO 3: HIPOGLUCEMIA SECUNDARIA A INTOXICACIÓN

ALCOHÓLICA
Se trata de un paciente de 58 años, alcohólico crónico, cuyos familiares relatan que ha ingerido una gran
cantidad de alcohol en los dos últimos días con un consumo muy escaso de alimentos. Inició su
padecimiento con náusea, vómito, mareo, sudación, cefalea, visión borrosa y confusión; presentó, en una
sola ocasión, una convulsión, por lo que es llevado al servicio de urgencias. A la exploración se encuentra
semiconsciente con aliento alcohólico e hipotermia. Se procede a un lavado gástrico para remover el alcohol
aún no absorbido; se mantienen permeables las vías respiratorias; se instala oxígenoterapia y se le
administra solución glucosada por vía endovenosa.
Los resultados de laboratorio muestran:
Alcohol 300 mg/dl
Glucosa 2.0 mmol/l
Lactato 9.0 mmol/l
pH 7.2
1. ¿Cuáles son los síntomas de la hipoglucemia?
2. ¿De qué forma el etanol produce acidosis láctica e hipoglucemia? ¿Cómo se encuentra la relación
intracelular de NADH/NAD+? ¿Qué procesos metabólicos se favorecen con los niveles altos de NADH?
3. El alcoholismo es la base de muchas deficiencias vitamínicas. ¿Qué implicaciones metabólicas tienen
estas deficiencias (complejo B)?
1. Hipoglucemia. Regulación de la glucemia.
2. Acidosis láctica.
3. Metabolismo de carbohidratos.
4. Trastornos del metabolismo de vitaminas.
5. Metabolismo del etanol.
REFERENCIAS
1. Murray KR, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. Bioquímica de Harper. 16a. ed. México: Editorial El
Manual Moderno; 2004. p. 980-981
2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona: Editorial Reverté;
2004.
3. Harrison. Principios de medicina interna. 15a. ed. Madrid: McGraw-Hill Interamericana Editores; 2001.
Capítulos: Acidosis láctica, hipoglucemia, alcohol y alcoholismo, deficiencia y exceso de vitaminas.
4. Academia Nacional de Medicina. Tratado de medicina interna. 2a. ed. México: Editorial El Manual
Moderno; 1994. Capítulos: Acidosis láctica e intoxicación aguda por alcohol etílico.

152
CASO 4: CETOSIS POR INANICIÓN OBESIDAD

Una mujer de 27 años llega al servicio de urgencias médicas después de haber sufrido un desmayo. Al
interrogarla, relata que lleva 15 días a dieta de agua, té y verduras cocidas para bajar de peso, sin ningún
control médico. Se detectó aliento con olor a manzana, cetonuria, cetonemia, ácidos grasos libres elevados,
triacilgliceroles elevados, hipoglucemia y presión arterial baja; su peso al iniciar la dieta era de 78 kg y su
estatura de 1.59 m. Se diagnostica cetoacidosis por inanición y obesidad exógena. El estudio de su dieta
mostró que gran parte de su ingesta calórica era en forma de carbohidratos (galletas, hocolates, pasteles,
refrescos, dulces, etcétera).
El tratamiento consistió en administrar parenteralmente solución glucosada y continuar con una dieta
normocalórica.
1. En esta mujer de 27 años: ¿corresponde el peso a su talla? Determinar su índice de masa corporal,
grado de obesidad y el porcentaje de sobrepeso.
2. ¿Cómo es posible que se formen grandes almacenes de energía en forma de grasas, si la dieta
contiene predominantemente carbohidratos?
3. ¿Cuáles son las interrelaciones metabólicas de los principales tejidos (hígado, tejido adiposo, cerebro,
músculo, etcétera) en la obesidad?
4. ¿Cuáles son las interrelaciones metabólicas de los principales tejidos en el estado de ayuno temprano
y en la inanición?
5. ¿Cuál es el papel de los cuerpos cetónicos en el metabolismo?
6. ¿Qué régimen dietético recomendaría a esta persona para bajar de peso?

1. Describir las principales rutas de biosíntesis, catabolismo y almacenamiento de lípidos.
2. Conocer la estructura y función de los triacilgliceroles, ácidos grasos y cuerpos cetónicos.
3. Establecer las bases bioquímicas de la cetosis y obesidad producidas por anomalías en el metabolismo
de los lípidos.
4. Describir las alteraciones del equilibrio ácido-base que se producen en la cetosis.
5. Conocer las interrelaciones metabólicas de los principales tejidos corporales en los estados de buena
nutrición, de ayuno temprano, de inanición, de renutrición, de homeostasis calórica, etcétera.
REFERENCIAS
1. Harrison. Principios de medicina interna. 15a. ed. Madrid: McGraw-Hill Interamericana Editores; 2001.
2004.
3. Montgomery R. Bioquímica: Casos y texto. 6a. ed. Harcourt-Brace; 1998.
4. Casanova E. Nutriología médica. Editorial Médica Panamericana; 1995.

153
CASO 5: HIPERCOLESTEROLEMIA Y ATEROSCLEROSIS
Un hombre de 56 años acudió al médico por presentar dolor precordial en reposo que se incrementaba con
el esfuerzo. Se le detectó hipercolesterolemia que, al análisis de los lípidos plasmáticos, mostró que la
mayoría del colesterol plasmático elevado se encontraba en la fracción de lipoproteína de baja densidad
(LDL). Se le realizó una arteriografía coronaria la cual mostró un estrechamiento de las arterias. La
evaluación de la dieta indicó que consumía gran cantidad de alimentos ricos en colesterol, aunque en los
últimos meses había seguido una dieta baja en grasas. Fue diagnosticado de aterosclerosis en las arterias
coronarias. El tratamiento consistió en una dieta sin colesterol y en administrar preparados de lovastatina,
un inhibidor de la HMGCoA reductasa. Fue tratado también con colestiramina, una resina que capta las
sales biliares. La resina no se absorbe y permanece en la luz intestinal donde se une a las sales y aumenta
la cantidad de las mismas que se excreta con las heces.
1. ¿Cuáles son algunos alimentos ricos en colesterol?
2. ¿Cuál es el destino del colesterol de la dieta?
3. ¿Cuál es la función de la bilis en la digestión?
4. ¿Qué conexión metabólica existe entre el colesterol y las sales biliares?
5. ¿Cómo disminuye la resina de colestiramina la concentración plasmática de colesterol?
6. ¿Por qué se le ha llamado al colesterol-LDL: “colesterol malo” y al colesterol-HDL: “colesterol bueno”?
7. ¿Cómo puede la hipercolesterolemia producir aterosclerosis, infarto del miocardio, xantomatosis,
etcétera?
8. ¿Por qué el hecho de disminuir la concentración plasmática de colesterol puede ser útil para la salud de
este paciente?
9. ¿Qué papel desempeña la HMG-CoA reductasa en la biosíntesis del colesterol?
10. ¿Cuál es la razón del uso de la lovastatina para el tratamiento del
paciente?
1. Estructura del colesterol y otros esteroles importantes.
2. Biosíntesis, metabolismo y excreción del colesterol y de los ácidos biliares.
3. Describir la función de la bilis y su relación con el colesterol.

154
Caso 6: GOTA
Un hombre de 53 años relata que su padecimiento actual se inició con una inflamación aguda del ortejo
mayor del pie derecho e intenso dolor, el cual se intensificaba con el frío y el movimiento. Además, asegura
que poco antes de presentar este episodio agudo el paciente había incrementado el consumo de carne,
vísceras, leguminosas y vino de mesa en abundancia. Fue tratado con fenilbutazona, pero presentó daño
gástrico, por lo que se cambió el medicamento por alopurinol y naproxén.
1. ¿Qué alteraciones metabólicas pueden traer como consecuencia un aumento en los niveles séricos de
ácido úrico?
2. ¿Son necesarias las purinas y las pirimidinas en la dieta?
3. ¿Qué alimentos son ricos en purinas y pirimidinas?
4. ¿Qué valores de laboratorio podrían estar alterados en este paciente?
5. ¿Son importantes los antecedentes familiares de este paciente?
6. ¿Cuál es la base bioquímica para sospechar que una dieta rica en proteínas puede provocar ataques
de gota en pacientes susceptibles?
7. ¿Cómo se relaciona la ingestión de etanol con el incremento de la concentración plasmática de ácido
úrico?
8. ¿Qué régimen dietético le recomendaría a esta persona para mejorar sus niveles de ácido úrico?
9. ¿Cuál es la base bioquímica para la acción de los medicamentos utilizados en la gota?

1. Características estructurales de los ácidos nucleícos.
2. Biosíntesis y catabolismo de purinas y pirimidinas.
3. Explicar cómo interfieren algunos medicamentos utilizados en el tratamiento de la gota con el
metabolismo de los nucleótidos.
REFERENCIAS
1. Harrison. Principios de medicina interna. 15a. ed. Madrid:McGraw-Hill Interamericana Editores; 2001.
2004.
3. Montgomery R. Bioquímica: Casos y texto. 6a. ed. Barcelona: Editorial Harcourt-Brace; 1998: Cap. 13.
4. Rodríguez Carranza R y col. Vademécum académico de medicamentos. 4a. ed. México: Facultad de
Medicina, UNAM y McGraw-Hill Interamericana Editores; 2004.

155
CASOS Anexos
Siendo las 17:30hrs, usted llega a su consultorio para brindar asesoría clínica. Ya en la sala de espera,
usted observa a seis pacientes sentados aguardando su turno:
Uno de ellos es un escolar de 9 años de edad acompañado por su madre. De primera impresión, parece
tener sobrepeso y se encuentra comiendo gomitas de azúcar.
2) Otra es una adolescente de 19 años quien luce delgada en extremo. Aunque también viene en compañía
de su madre, la chica parece permanecer en su lugar a regañadientes.
3) La tercera es una mujer de 27 años de edad en compañía de su esposo, quien la trae el día de hoy a su
tercera consulta prenatal.
4) Una mujer de 23 años ocupa el cuarto asiento. Con una complexión robusta y fascies circular, se trata,
en realidad, de una paciente ya conocida por usted.
5) Un varón de 45 años, somnoliento, con mal aliño y aliento alcohólico, yace en el penúltimo asiento. Un
muchacho, probablemente su hijo adolescente, permanecía de pie a su lado.
6) Por último, en la sexta banca hay un adulto mayor de 71 años acompañado por una mujer algunos años
más joven que él. En su última cita, usted lo envió a gestionar algunos estudios
de laboratorio (química sanguínea y perfil lipídico).
-------------------------------------------------------------------------
La joven madre y su hijo son los primeros en entrar al consultorio. Ella dice estar interesada en iniciar un
control de niño sano, ya que la maestra la había mandado a llamar para platicar con ella acerca de la apatía
que mostraba el infante ante el desarrollo de actividad física y por el alto consumo de carbohidratos simples
y complejos que tenía durante el recreo. En la exploración física se observó que el muchachito presentaba
un aspecto de tipología claramente pícnica, con la presencia de áreas hiperpigmentadas de aspecto
“aterciopelado” en los pliegues del cuello y ambas axilas. Asimismo, los panículos adiposos abdominal,
mamarios y suprailiacos resultaron ser voluminosos cuando se evaluaron mediante la palpación. Al ubicar
el peso del escolar en la tabla de percentiles de peso para la edad, el valor cayó por encima del percentil
95.
Diagnóstico: Obesidad infantil.
La mamá tomó entonces la iniciativa de abordarlo con las siguientes preguntas:
 ¿Por qué razón un aumento de la glucemia provoca la secreción de insulina por las células __pancreáticas?
 ¿Cómo son reguladas la glucólisis y la gluconeogénesis por la insulina?
 ¿Cómo son reguladas la oxidación y la reducción por la insulina?
 ¿Cómo son reguladas la lipólisis y la lipogénesis por la insulina?
 ¿Cómo puede usted fundamentar, bioquímicamente, el hecho de que el contenido de triacilglicéridos en el
tejido adiposo aumente con el consumo de una dieta que consiste básicamente en carbohidratos?
 ¿Cuál es la relación existente entre las somatomedinas y la insulina?
 ¿Qué explicación puede dar usted para que hayan aparecido las áreas de hiperpigmentación descritas en
el infante?
 ¿Qué es la leptina y en dónde se produce?
 ¿Cuál es el efecto de la leptina sobre las neuronas del núcleo
 arqueado?
 ¿Qué es la ghrelina y en dónde se produce?
 ¿Cuál es el efecto de la ghrelina sobre las neuronas del núcleo arqueado?
-------------------------------------------------------------------------
La adolescente y su madre fueron las segundas en entrar a consulta. Casi de inmediato la madre comenzó
a quejarse acerca de la falta de ingesta de alimentos de su hija, al grado de que solamente había consumido
té negro en los últimos cinco días.
 ¿Qué son las metilxantinas?
 ¿Cuál es su mecanismo de acción?
 ¿Qué vías metabólicas son favorecidas con el consumo de metilxantinas?
La hija, tratando de desmentir el argumento de su madre, afirmó que también había estado consumiendo,
por día, una lata de atún en agua. Por otra parte, la mamá comentó que también le preocupaba el hecho
de que, desde hace tres meses, su hija tuviese un retraso en la presentación del sangrado menstrual. En

156
la toma de signos vitales, se cuantificó una temperatura corporal de 36.5°C y una frecuencia cardiaca de
57 latidos/min. La exploración física evidenció a una adolescente con palidez egumentaria, cianosis acral y
con una marcada disminución del tejido adiposo subcutáneo. Además, los ritmos cardiaco y peristáltico se
escucharon disminuidos tanto en frecuencia como en intensidad. Finalmente, la conducta principal que
regía el cuadro clínico era el marcado rechazo hacia la ingesta de comestibles y el miedo irracional al
aumento de peso.
Diagnóstico: Anorexia nerviosa.
¿Qué vías metabólicas proveen combustible para el organismo
antes de 12 horas de ayuno?
¿Qué vías metabólicas proveen combustible para el organismo
después de 36 horas de ayuno?
¿Qué aminoácidos son gluconeogénicos?
¿Qué aminoácidos son cetogénicos?
¿Cuál es la razón de que pertenezcan a uno u otro grupo?
¿Qué son los estrógenos y en dónde se producen?
¿Qué función tiene la enzima denominada “aromatasa” en el metabolismo de los estrógenos?
¿En qué tejidos se localiza dicha enzima?
¿Cómo podría explicar usted, en este caso, la aparición de amenorrea secundaria?
-------------------------------------------------------------------------
Con pasos lánguidos y el apoyo de su esposo, la mujer del tercer asiento entró al consultorio. Durante la
tribuna libre no manifestó cursar con algún tipo de molestia, sin embargo, expresó que últimamente sentía
un apetito voraz por los alimentos dulces y que había notado un aumento en el número de micciones
durante el día. Al encontrarse la paciente en ayunas, usted consideró oportuno efectuar una prueba de
glucemia en sangre periférica, obteniéndose un valor de 212mg/dL. Ella también traía consigo un estudio
de química sanguínea realizado hace 5 días, mismo que reportaba hiperglucemia cuantificada en
196mg/dL.
Por otra parte, el cálculo de la edad gestacional, de acuerdo a la fecha de última menstruación (FUM),
resultó de 28 semanas. El resto de la exploración física se abocó a identificar las diversas características
obstétricas tanto de la madre como del producto.
Diagnóstico: Diabetes mellitus gestacional.
 ¿Qué hormonas se sintetizan en el tejido placentario?
 ¿Cuál es el efecto de la somatotrofina coriónica humana sobre
 el metabolismo lipídico?
 ¿Cuál es el efecto de la somatotrofina coriónica humana sobre
 el metabolismo de los carbohidratos?
 ¿Por qué razón es necesaria la aparición de un estado de
 resistencia a la acción de la insulina, por parte de la madre,
 durante el embarazo?
------------------------------------------------------------------------
La mujer robusta pasó a consulta. Su habitus exterior se caracterizaba por una complexión endomórfica
muy particular: obesidad central, cifosis torácica (a modo de “joroba de búfalo”), aumento de volumen de
los panículos adiposos del rostro (adoptando una apariencia de “cara de luna llena”), extremidades
delgadas y presencia de equimosis y estrías en diversas partes del cuerpo. Usted tomó el expediente y al
leerlo recordó que la paciente se encontraba en tratamiento con prednisona (un glucocorticoide)
debido a un diagnóstico, hecho hace tres meses, de lupus eritematoso sistémico (LES). Una de las
principales preocupaciones de la mujer era la pérdida progresiva y paulatina de su figura pues,
anteriormente, había trabajado como modelo y, debido a los cambios experimentados, no había recibido
ninguna oferta de trabajo recientemente. Salvo el cotejo de los rasgos físicos ya descritos, la exploración
física no aportó mayores datos al respecto.
Diagnóstico: Síndrome de Cushing iatrogénico.
 ¿Cuál es el efecto de los glucocorticoides en el metabolismo de proteínas?
 ¿Cuál es el efecto de los glucocorticoides en el metabolismo lipídico?
 ¿Por qué razones los glucocorticoides favorecen la vía gluconeogénica?
 ¿Por qué razones los glucocorticoides favorecen la vía glucogenogénica?
 ¿Qué efecto tienen los glucocorticoides sobre la acción de la insulina?

157
 Con base en las preguntas previas ¿cómo podría usted fundamentar la aparición de estrías y equimosis?
 Con base en las preguntas previas ¿podría usted explicar la redistribución de la grasa corporal que ocurre
en este trastorno?
-------------------------------------------------------------------------
Al llamar al siguiente paciente, el muchacho entró cargando con cierta dificultad a su padre. El interrogatorio
indirecto reveló que el paciente era un alcohólico crónico quien había iniciado el consumo de etanol desde
los 15 años de edad. No obstante, el consumo del mismo se había acentuado en el último mes debido
a problemas laborales y económicos, de tal forma que en los últimos días había comenzado a experimentar
cambios conductuales y en el estado de alerta.
La exploración física dio cuenta de un individuo de edad aparentemente mayor a la cronológica,
somnoliento, con mal arreglo personal y con un aroma a etanol fácilmente perceptible a distancia. A nivel
del tórax llamó la atención la presencia de ginecomastia, en tanto que su abdomen fue globoso a expensas
de la presencia de líquido de ascitis. Asimismo, se pudo observar la dilatación de venas colaterales
periumbilicales adoptando una morfología de “caput medusae”. Por otro lado, la hipotrofia muscular de las
cuatro extremidades era evidente.
Diagnóstico: Insuficiencia hepática secundaria a cirrosis hepática.
 ¿Qué enzimas intervienen en el metabolismo hepático del etanol?
 ¿Cómo puede explicar la aparición de cirrosis en una situación de consumo crónico de etanol?
 ¿Cuál es la importancia del hígado en el metabolismo de los aminoácidos?
 ¿Cómo podría explicar la aparición de una sintomatología neurológica con base en una alteración del ciclo
de la urea?
 ¿Qué alteración en el metabolismo de los esteroides sexuales podría explicar la aparición de ginecomastia
en un individuo con enfermedad hepática?
Si se efectuara un corte histológico en donde se demuestre la acumulación de gotas de triacilglicéridos
dentro de los hepatocitos (esteatosis).
 ¿Cómo podría explicar usted la aparición este fenómeno?
-------------------------------------------------------------------------
El hombre mayor había esperado pacientemente su turno. Entró al consultorio apoyado del brazo de su hija
menor y ambos tomaron asiento de nueva cuenta. En su última cita, usted le había solicitado el trámite de
algunos estudios de control, los cuales le mostró a usted con prontitud:
 Química sanguínea:
 Perfil lipídico:

158
Como antecedente de importancia, el señor proviene de una familia con predisposición al desarrollo de
diabetes mellitus tipo 2, sin embargo, los valores de glucemia determinados en varias pruebas previas casi
siempre han caído en el intervalo entre los 110 y 126 mg/dL. Además, cursaba también con dislipidemia a
expensas de la elevación tanto de triacilgliceroles como de colesterol, y los niveles de ácido úrico en el
plasma siempre habían estado por encima del límite de referencia superior. La tensión arterial también ha
sido refractaria al tratamiento con enalapril, siendo el valor promedio de 140/90mmHg.
Diagnóstico: Síndrome metabólico.
 ¿Cuál es el mecanismo de acción de la insulina?
 ¿Qué hormonas son secretadas por el tejido adiposo?
 ¿Cómo afectan estas hormonas la sensibilidad hacia la
 insulina?
 ¿Qué son las lipoproteínas?
 ¿Cuántos tipos hay?
 ¿Qué diferencias existen entre LDL y HDL?
 ¿A partir de qué compuestos se obtiene el ácido úrico?
 ¿Cuál es la razón de que un alto consumo de proteínas conduzca a la elevación del nivel plasmático
de ácido úrico?
Bibliografìa
 Nelson DL, Cox MM. “Hormonal regulation and integration of mammalian metabolism”. In: Nelson DL, Cox MM.
“Lehninger Principles of Bichemistry”. 5th Edition W.H. Freman and Company 2008. Chapter 23; Pp 901-944.
 Marks AD, Lieberman M. Marks AD. “The Fed or Absorptive State”. In: Lieberman M. “Marks´ Basical Medical
Biochemistry. A Clinical Approach”. 3rd Edition Lippincott Williams & Wilkins 2009. Chapter 2; Pp 22-30.
 Marks AD, Lieberman M. Marks AD. “Fasting”. In: Lieberman M. “Marks´ Basical Medical Biochemistry. A
Clinical Approach”. 3rd Edition Lippincott Williams & Wilkins 2009. Chapter 3; Pp 31-39.
 Marks AD, Lieberman M. Marks AD. “Actions of Hormones That Regulate Fuel Metabolism”. In: Lieberman M.
“Marks´ Basical Medical Biochemistry. A Clinical Approach”. 3rd Edition
 Lippincott Williams & Wilkins 2009. Chapter 43; Pp 805-830.
 Harris RA, Crabb DW. “Interrelaciones metabólicas”. En: Devlin TM “Bioquímica. Libro de Texto con
Aplicaciones Clínicas”. 4ª Edición en Español Editorial Reverté 2004. Capítulo 20; Pp 861-902.
 Ganong WF. “Funciones endocrinas del páncreas y regulación del metabolismo de carbohidratos”. En: Ganong
WF. “Fisiología Médica”. 20ª Edición en español. El Manual Moderno 2006.Capítulo 19; Pp 313-333.
 Ganong WF. “Médula y corteza suprarrenales”. En: Ganong WF. “Fisiologìa Médica”. 20ª Edición en Español El
Manual Moderno 2006. Capítulo 20; Pp 335-358.
 Ganong WF. “Hipófisis”. En: Ganong WF. “Fisiologìa Médica”. 20ª Edición en Español El Manual Moderno
2006. Capítulo 22; Pp 373-385.
 Ganong WF. “Gónadas: desarrollo y función del sistema reproductor”. En: Ganong WF. “Fisiologìa Médica”. 20ª
Edición en Español El Manual Moderno 2006. Capítulo 23; Pp 387-425.
 Guión y preguntas elaboradas por Salazar Morales Miguel Fdo. MPSS Departamento de Bioquímica Facultad
de Medicina UNAM.

159
Deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
Milagros es profesora de matemáticas de 5to grado de preparatoria. Tiene 23 años de edad y es originaria
de Moquegua. Hace tres días enfermó de faringoamigdalitis, sin embargo, al no haber mejoría, optó por
consumir trimetroprim con sulfametoxazol (TMP-SMZ). A la mañana siguiente, tras iniciar la administración
del fármaco, se miró al espejo y notó la aparición de un leve tinte amarillento en su piel, por lo que pensó
que se trataba de una reacción alérgica y acudió al hospital. Uno de los estudios paraclínicos gestionados
fue la citometría hemática, cuyos resultados se muestran a continuación
Con el fin de complementar el estudio anterior, se incluyó una solicitud para realizar un frotis de sangre
periférica, el cual reportó la observación de esquistocitos y cuerpos de Heinz.
1) ¿Qué son los cuerpos de Heinz?
2) ¿Qué es la hemoglobina?
3) ¿Qué es la metahemoglobina?
4) ¿Qué es la sulfahemoglobina?
Otro estudio tramitado, y que se justificó con base en la aparición de ictericia, fue la batería de pruebas de
función hepática, cuyos resultados también se despliegan:

160
Así, tras el análisis de los resultados previos, se llegó a la conclusión de la posible existencia de un
defecto enzimático a nivel de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, razón por la cual se cambió el
medicamento por un _-lactámico y se le dieron instrucciones de presentarse en la consulta externa del
servicio de hematología para la apertura del expediente clínico.
5) ¿Cuántas y cuáles son las fases de la vía de las pentosas?
6) ¿Cuáles son los metabolitos de mayor importancia de esta vía?
7) ¿Para qué se emplean dichos metabolitos?
8) ¿En qué reacciones de la vía se obtiene poder reductor como
producto?
9) ¿Cuál es el paso limitante de la velocidad de la vía del fosfogluconato?
10) ¿Cómo se encuentra regulada la enzima que cataliza dicho paso?
11) ¿Qué vías metabólicas, que utilizan glucosa como sustrato, se llevan a cabo dentro del eritrocito?
12) ¿Por qué razones son importantes estas rutas metabólicas para el hematíe?
13) En alusión a las preguntas 1 a 4 ¿Por qué se ve afectada la estructura de la hemoglobina en esta
patología?
14) ¿Qué otros factores pueden afectar negativamente a un individuo con esta deficiencia enzimática?
Sinopsis
La deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa es un padecimiento con un patrón de herencia recesivo
ligado a X que representa la primera causa de anemia hemolítica por deficiencias enzimáticas, seguida por
la deficiencia de piruvato cinasa y por la deficiencia de fosfohexosa isomerasa. La vía de las pentosas
(también conocida como vía del fosfogluconato o derivación de las hexosas monofosfato) es una vía
paralela a la ruta glucolítica, sin embargo, a diferencia de ésta, no utiliza la molécula de glucosa como una
fuente para la obtención de ATP sino como un sustrato para la generación tanto de poder reductor
(NADPH+H+) como de ribosa-5-fosfato. El NADPH+H+, al encontrarse en mayor concentración que su
contraparte no fosforilada, el NADH+H+, se emplea como donador de electrones en distintas biosíntesis
reductivas, al igual que en procesos implicados en la defensa en contra de especies reactivas de oxígeno
(EROs). Por otra parte, la ribosa-5-fosfato es una molécula que se utiliza para la síntesis de nucléotidos y
que se puede obtener a partir de la isomerización de ribulosa-5-fosfato, la cual es el producto de las
reacciones oxidativas de la ruta.
La vía cuenta con dos fases: una que es oxidativa y dependiente de NADP+, y otra no oxidativa que también
recibe el nombre de fase de interconversión de azúcares. Durante la fase oxidativa se obtienen dos
moléculas de NADPH+ H+ en las reacciones catalizadas por la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y por la
fosfogluconato deshidrogenasa, respectivamente, sin embargo, también se obtiene ribulosa 5-fosfato a
partir de la descarboxilación del fosfogluconato. La fase de interconversión de azúcares es una serie de
reacciones fácilmente reversibles que tiene por objetivo la obtención de intermediarios que contienen entre
tres y siete átomos carbonos. El paso limitante de la velocidad de la vía se encuentra a nivel de la enzima
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, la cual se regula a través de modulación alostérica positiva o negativa
dependiendo de las concentraciones relativas de NADP+ y NADPH+H+. De esta manera, cuando las
necesidades celulares de poder reductor son altas, hay suficiente NADP+ para derivar a la glucosa-6-
fosfato hacia la vía de las pentosas, por el contrario, si hay un exceso de NADPH+H+, la hexosa se
metaboliza por la vía glucolítica. Los hematíes son una estirpe celular que, debido a su función
transportadora de oxígeno, perdieron sus organelos durante el proceso de diferenciación. Esta es la razón
fundamental de que dos rutas metabólicas cobren una particular importancia para los mismos: la glucólisis
(para la obtención de ATP, pues no pueden realizar fosforilación oxidativa) y la vía de las pentosas (para la
producción de NADPH+H+ que sirva para la reconversión de glutatión a su forma reducida y proteger así
su integridad propia frente al daño oxidativo). La acción de las especies reactivas derivadas del oxígeno
ocasiona la oxidación de los grupos sulfhidrilo presentes en las cadenas de globina y la consecutiva
formación de puentes disulfuro, lo cual deriva en la desnaturalización de la proteína. Esto da por resultado
la agregación y precipitación de la hemoglobina, la cual se puede visualizar mediante el empleo de tinciones
supravitales como el naranja de acridina o el cloruro de tilrosanilina (violeta de cristal).
Estos corpúsculos reciben la denominación de cuerpos de Heinz. Además, durante su paso por los
cordones esplénicos, los eritrocitos con hemoglobina precipitada en su interior tienen mayor probabilidad
de ser fagocitados por los macrófagos, razón por la cual pueden perder fragmentos de su membrana y
observarse como esquistocitos en el frotis de sangre periférica. El glutatión es un tripéptido (Glut-Cys-Gly)

161
que protege indirectamente a los eritrocitos de la acción del radical hidroxilo al evitar su generación en la
reacción de Fenton: H2O2+Fe+2 Fe+3+OH- +OH.
A través de la reducción del peróxido de hidrógeno hasta agua por el glutatión, se evita que se lleve a cabo
la reacción anterior al transformar al reactivo en un producto inerte. 2 GSH+H2O2 GSSG+ 2H2O
El glutatión en su forma reducida es un monómero (GSH), en tanto que su forma oxidada es un homodímero
unido por un enlace disulfuro (GSSG). La enzima glutatión peroxidasa es la responsable de acoplar la
oxidación del glutatión con la reducción del peróxido de hidrógeno en agua. Por otra parte, la enzima
glutatión reductasa permite la reconversión del glutatión oxidado a glutatión reducido. Así pues, dentro del
eritrocito, este conjunto de reacciones de óxido-reducción mantienen reducidos a los grupos sulfhidrilo de
las globinas (al impedir la producción de radical hidroxilo) y al hierro del grupo hem en estado ferroso (al
consumir peróxido de hidrógeno). El cuadro clínico es variable y depende del grado de deficiencia
de la enzima, yendo desde la simple ictericia hasta la insuficiencia renal aguda por necrosis tubular. Lo más
común es que ocurra hemólisis tras la exposición a algún agente oxidante, como algunos medicamentos
(por ejemplo, sulfonamidas y antipalúdicos), ciertas leguminosas (como Vicia fava, cuyos _-glucósidos
producen especies reactivas de oxígeno) o durante procesos mórbidos (en los cuales los leucocitos
producen radicales libres durante el estallido respiratorio). Generalmente los episodios hemolíticos se
autolimitan.
Abreviaturas comúnmente empleadas para expresar los parámetros de la serie roja en la citometría
hemática:
 GR.-Cuenta de glóbulos rojos. Es la cantidad de hematíes expresada en millones por microlitro o en millones
por milímetro cúbico.
 Hb.-Hemoglobina. Es la cantidad de hemoglobina expresada en gramos por decilitro.
 Hto.-Hematocrito. Es la proporción de eritrocitos en el total de sangre.
 VCM.-Volumen corpuscular medio. También se suele acotar como VGM (volumen globular medio). Se trata
del promedio del volumen eritrocitario
 HCM.-Hemoglobina corpuscular media. Es la cantidad promedio de hemoglobina dentro de cada eritrocito.
 CmHb.-Concentración media de hemoglobina corpuscular (globular). También se suele acotar como CCMH
(concentración corpuscular media de hemoglobina).
 CV-VCM.-Coeficiente de variación del volumen corpuscular
 (globular) medio. Es frecuente encontrar este mismo índice con su abreviatura en inglés RDW (red cell
distribution width o anchura de la distribución eritrocitaria). Corresponde al producto de la desviación
estándar por el volumen corpuscular medio.
Bibliografía
 Lisker R. “Hemólisis asociada a deficiencias de enzimas de la vía de las pentosas”. En: Ruiz Argüelles GJ.
“Fundamentos de Hematología”. 4ª Edición Panamericana 2009. Capítulo 8
 Anemias Hemolíticas por Alteraciones de Enzimas Eritrocitarias; Pp 97-105.
 Ruiz Argüelles GJ, Ruiz Reyes G, Ruiz Delgado GJ. “Interpretación de la citometría hemática. Índices y
parámetros eritrocíticos. Definición de anemia”. En: Ruiz Argüelles GJ. “Fundamentos de Hematología”. 4ª
Edición Panamericana 2009. Capítulo 2; Pp 13-24.
 Quaranta JF, Pesce A, Cassuto JP. “ABC de El Hemograma. De la lectura al diagnóstico”. Editorial Masson
1989.
 Bunn HF, Rosse W. “Anemias hemolíticas y por pérdida aguda de sangre”. En: Kasper DL, Braunwald E,
et.al. Harrison Principios de Medicina Interna. 16ª Edición McGraw Hill 2006. Volumen 1, Parte V, Sección
2 Trastornos hematopoyéticos; Pg 685.
 Nelson DL, Cox MM. “Pentose phosphate pathway of glucose oxidation”. In: Nelson DL, Cox MM. Lehninger
Principles of Biochemistry. 5th Edition Freeman 2008. Chapter 14 Glycolisis, gluconeogenesis and the
pentose phosphate pathway. Pp 558-563.
 Marks AD, Lieberman M. “Pathways of sugar metabolism:pentose phosphate pathway, fructose and
galactose metabolism”. In: Marks AD, Lieberman M. “Mark´s basic medical biochemistry: a clinical approach”.
3rd edition Lippincott Williams & Wilkins 2009. Section 5 Chapter 29; Pp 536-549.

162

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Universidad José Carlos Mariátegui Valeriano-Zapana, J.A.

Valeriano Zapana, J.A. Manual de–prácticas

UNIVERSIDAD JOSÉ CARLOS MARIATEGUI

ESCUELA PROFESIONAL: ___________________________________________________________

Valeriano Zapana, J.A. Manual de prácticas de Bioquímica

MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUIMICA

Autores: Mgr. Blgo. José Antonio Valeriano Zapana

Valeriano Zapana, J.A. Manual de prácticas de Bioquímica

PRÁCTICA 01: GENERALIDADES: NORMAS DE BIOSEGURIDAD ..................................................................9

Valeriano Zapana, J.A. Manual de prácticas de Bioquímica

Valeriano Zapana, J.A. Manual de prácticas de Bioquímica

Moquegua, abril del 2019

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

Código de manejo dentro del laboratorio de Bioquímica

a) El uso del mandil (bata) es obligatorio.

Valeriano Zapana, J.A. Manual de prácticas de Bioquímica

1. MEDIDAS GENERALES EN CASO DE ACCIDENTE

2.1 PLAN GENERAL DE EMERGENCIA:

2.3 FUEGO EN EL LABORATORIO:

Valeriano Zapana, J.A. Manual de prácticas de Bioquímica

• Antes de cualquier actuación pide asistencia médica.

Valeriano Zapana, J.A. Manual de prácticas de Bioquímica

PRÁCTICA 01: GENERALIDADES: NORMAS DE

La bioseguridad comprende un conjunto de medidas preventivas, destinadas a mantener el

2.1 RIESGO DE INCENDIO

Valeriano Zapana, J.A. Manual de prácticas de Bioquímica

Cuadrado rojo Letra blanca

Pautas básicas para prevenir el riesgo de incendio:

Reglas elementales de ataque y modo de utilizar el matafuego:

Valeriano Zapana, J.A. Manual de prácticas de Bioquímica

2.2 RIESGO ELECTRICO

a) Electricidad: agente físico que se manifiesta como una diferencia de potencial

2.3 RIESGO QUIMICO

Valeriano Zapana, J.A. Manual de prácticas de Bioquímica

Almacenamiento: en términos generales, las drogas deben guardarse en lugares secos,

Efectos de las sustancias químicas sobre el organismo.

Valeriano Zapana, J.A. Manual de prácticas de Bioquímica

Pictograma Clasificación y Precaución

Peróxidos orgánicos, sustancias y mezclas que en contacto con materiales

Destrucción de la piel en su total grosor, en piel sana e intacta.

Valeriano Zapana, J.A. Manual de prácticas de Bioquímica

los cultivos celulares o endoparásitos humanos, susceptibles de originar cualquier tipo de

Accidentes más frecuentes Vías de ingreso Precauciones

2.5 Normas básicas de higiene y seguridad-Laboratorio de Biología

Las medidas de Seguridad en Laboratorios son un conjunto de medidas preventivas destinadas a

Valeriano Zapana, J.A. Manual de prácticas de Bioquímica

 Establecer pautas y recomendaciones necesarias en el estudiante sobre las normas de bioseguridad en el

Valeriano Zapana, J.A. Manual de prácticas de Bioquímica

 Área de tránsito limitado:

 Área de tránsito restringido:

 Cabina de flujo laminar:

 Cabina de seguridad biológica:

 Filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air):

Valeriano Zapana, J.A. Manual de prácticas de Bioquímica

 Sistema HVAC (Heating, Ventilation, and Air Conditioning):

4.5 Identificar e enumerar los riesgos biológicos

4.6 Identificar e enumerar los riesgos químicos

4.7 Identificar e enumerar los riesgos eléctricos

 ¿Cuáles son los niveles de Bioseguridad? (ANEXAR)

 ¿Por qué es importante seguir los procedimientos de Bioseguridad en el laboratorio?

Valeriano Zapana, J.A. Manual de prácticas de Bioquímica

 ¿Qué clase de materiales y reactivos presentan riesgo de alteración en la salud?

 ¿Cuál es el procedimiento a seguir cuando se presenta un accidente en los diferentes riesgos

Pipeta Pasteur Tubo de ensayo *Vaso de precipitación