FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

DIVISION DE ESTUDIOS SUPERIORES

UTILIZACION DE CASCARA DE NARANJA

PARA PRODUCCION DE PROTEINA
UNICELULAR

QUE COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AU

GRADO ACADEMICO DE MAESTRO EN CIENCIAS
CON ESPECIALIDAD EN MICROBIOLOGLA
INDUSTRIAL

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P R E S E N T A

MARGARITA XIOMARA CORNEJO MONTENEGRO:

MONTERREY, N. II DICIEMBRE DE 19*4

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Señor c o o r d i n a d o r de l a m a e s t r í a en c i e n c i a , la tesis ela-

borada por l a L i c e n c i a d a en B i o l o g í a M a r g a r i t a Xiomara Cor-

nejo Montenegro, intitulada

UTILIZACION DE CASCARA DE NARANJA PARA PRODUCCION DE PRO-

TEINA UNICELULAR.

Ka s i d o a c e p t a d a como r e q u i s i t o parcial para o p t a r e l grado

académico de m a e s t r o en c i e n c i a s , e s p e c i a l i d a d fcn M i c r o b i o l o -

gía Industrial.

En v i r t u d de haber c u m p l i d o I n t e g r a m e n t e con e l r e g í amento-

de t e s i s v i g e n t e y a l a vez s o l i c i t a m o s a usted la aproba-

ción final

COMITE DICTAMINADOR DE LA TESIS

SINODAL SINODAL

SINODAL

M.C. LUIS GALAN WUNG

VoBo

WJT. ÑéA E. V l L L A f t f t E A L
eJMé-ft ¿JE G .
 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

DIVISION DE ESTUDIOS SUPERIORES

UTILIZACION DE CASCARA DE NARANJA PARA PRODUCCION DE*

PROTEINA UNICELULAR

TESIS

QUE COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL GRADO ACADE-

MICO DE MAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN MICRO

BIOLOGIA INDUSTRIAL PRESENTA

MARGARITA XIOMARA CORNEJO MONTENEGRO

MONTERREY N . L . DICIEMBRE 1984

 RESUMEN

Se hace un a n á l i s i s de l a s características nutricionales

de l a c i s c a r a de n a r a n j a , para c o n s i d e r a r l o s como parte-

de un medio de c u l t i v o que u t i l i z a d o en un proceso fer-

mentativo proporcione un p r o d u c t o con una nayor cantidad

de p r o t e l n a . En e s t e p r o c e s o de f e r m e n t a c i ó n se utili-

zaron cepas de P e n i c i l 1 ium ¿ p . y un A s p e r g i l l u s s_p., am-

bos a i s l a d o s de m a t e r i a l e s pectfnicos. El uso de éstos

en medio de c u l t i v o con c á s c a r a de n a r a n j a , conduce a l a

o b t e n c i ó n de un p r o d u c t o con un 20% de i n c r e m e n t o en el

c o n t e n i d o de p r o t e í n a s respecto al m a t e r i a l s i n fermentar.

También se d e t e r m i n a n e x p e r i m e n t a l m e n t e los parámetros -

Óptimos de f e r m e n t a c i ó n , como pH y r e l a c i ó n sólido-liquido.

 INDICE GENERAL

pàgina

A.- Introducción 1

B.- Materiales y Métodos 5

I.- A i s l a m i e n t o y s e l e c c i ó n de m i c r o o r g a n i s m o s 5

II.- Identificación de l o s M i c r o o r g a n i s m o s 7

III.- Identificación de m i c r o o r g a n i s m o s pecti-

nolíticos 7

IV.- Material de desecho i n d u s t r i a l utilizado - *

como s u s t r a t o 8

V.- Composición del medio de c u l t i v o 8

VI.- Proceso de e s t e r i l i z a c i ó n 10

VII.- Método de i n o c u l a c i ó n 10

VIII.- Proceso de f e r m e n t a c i ó n 11

IX.- Métodos de a n á l i s i s 11

C.- Resultados y observaciones 13

D.- Conclusiones 17

E.- Referencias bibliográficas 19

F.- A p é n d i c e de t a b l a s 21
>

G.- A p é n d i c e de g r á f i c a s 31

H.- Biografía de l a a u t o r a 35
 INDICE DE TABLAS

Página

I.- Composición q u í m i c a de la cascara de n a r a n j a 22

ti.- Parámetros u t i l i z a d o s para l a s e l e c c i ó n de mi.

croorganismos en a g a r c á s c a r a de n a r a n j a 23

I I I . - Observación macroscópica del P e n i c i l l i u B sp. -

en e l medio de e s p o r u l a c i ó n de Czapeck. 24

IV.- Observación macroscópica del A s p e r g i l l u s sp.

en e l medio de e s p o r u l a c i ó n de Czapeck. 25

V.- Constituyentes químicos de l a c á s c a r a de naran.

ja 26

VI.- Composición q u í m i c a d e l medio de c u l t i v o 27

V I I . - Composición de compuestos carbonados y nitroge

nados de l a c á s c a r a de n a r a n j a seca 28

VIII.- Características microscópicas del Aspergi11uS . 29

IX.- Características microscópicas del P e n i c i l 1.1 un s p . 30

 INDICE DE GRAFICAS

Efecto del |>H d e l medio de c u l t i v o sobre la

p r o d u c c i ó n de proteina

Curva de p r o d u c c i ó n de p r o t e f n a en f u n c i ó n

del tiempo

Variantes en e l proceso
 A.- INTRODUCCION

A la b i o t e c n o l o g í a m i c r o b i a n a , se l e d e s c r i b e como l a Ceni-

cienta tecnológica de n u e s t r o s días con su gran p o t e n c i a l -

para a l t e r a r la f i s o n o m í a de Ta i n d u s t r i a de n u e s t r a época

que r e d u n d a r í a en b e n e f i c i o de la sociedad.

Los a n t e c e d e n t e s a c e r c a de l a u t i l i z a c i ó n de l o s microorga-

nismos como agentes de b i o s í n t e s i s aplicables a la alimenta-

c i ó n animal o humana, emergen de l o s e s t u d i o s de D e l b r u c k , -

Hayduck y Wohl, l l e v a d o s a e f e c t o en e l Instituto de Fermen-

taciones de B e r l í n , d u r a n t e l o s años de l a Primera Guerra -

Mundial ( 1 ). Al hablar de e s t o s a n t e c e d e n t e s que se re-

montan a l a época de G u e r r a , es r i g u r o s o considerar las r a i -

ces c i e n t í f i c a s de l a b i o t e c n o l o g í a que t u v o Tugar en e l s i -

g l o X I X , cuando L o u i s Pasteur e s t a b l e c i ó los orígenes micro-

b i anos y l a d i f e r e n c i a e n t r e f e r m e n t a d ón y putref acción-

{ 2 ). Las c o n t r i b u c i o n e s de Koch, J e n n e r , Fleming y otros

investigadores f o r m a r o n l a base de d i v e r s o s procesos micro-

biológicos que han c o n t r i b u i d o al d e s a r r o l l o y progreso del

hombre.

Entre las especialidades de l a B i o t e c n o l o g í a se puede -

considerar que en l a ú l t i m a d é c a d a , ha s u r g i d o un renovado

i n t e r é s en l o s procesos de b i o s í n t e s i s p r o t e i c a por micro-

organismos; denominada p r o t e i n a unicelular, este término

se u t i l i z a g e n é r i c a m e n t e para a p l i c a r l o a l c o n c e n t r a d o pro-

teico p r o c e d e n t e de m i c r o o r g a n i s m o s unicelulares como son:

Bacterias, algas, hongos y levaduras.

En l o s países industrializados y en v í a s de d e s a r r o l l o exis-

t e n materiales subproductos n a t u r a l es , que pueden s e r útiles

como complemento de l a d i e t a a n i m a l . Estos subproductos,, con-

su c o n t e n i d o residual de m a t e r i a l e s asimilables y fermete-

*

ci bles ( polímeros carbonados ) son ú t i l i z a d o s como f u e n t e

de c a r b o n o , empleando m i c r o o r g a n i s m o s como agentes de bio-

síntesis. Es e v i d e n t e que l a t e c n o l o g í a m i c r o b i a n a pueda

proveer algunas de l a s s o l u c i o n e s a l o s problemas d e l cre-

c i miento poblacional como son: La r e u t i 1 i z a c i ó n de aguas

( residuales, industriales, municipales ), p r o d u c c i ó n de -

bioenergía, alimentación, control de i n s e c t o s y producción

de p r o t e i n a unicelular.

Entre los m a t e r i a l e s de desecho que son comunmente em-

pleados corno s u s t r a t o para p r o d u c i r proteína unicelular en-

contramos a l g u n o s industriales; como l a s mezclas de a z ú c a r ,

bagazo de c a ñ a , r e s i d u o s de papel y e l s u e r o de l e c h e . Al-

gunos r e s i d u o s agrícolas como f r u t a s tropicales, cascari-

lla de c e r e a l e s y plantas desérticas, y se i n c l u y e n también

algunas fracciones de p e t r ó l e o coso Tas q u e r o s i n a s y el ga-

solpo ( 1

Los desechos v e g e t a l e s , resultan relativamente abundan-

tes y b a r a t o s , e n t r e estos tenemos l a cSscara de n a r a n j a » -

que es u t i l i z a d a g e n e r a l m e n t e como a l i m e n t o para aves y ga-

nado, s i e n d o una f u e n t e p o t e n c í a luiente s i g n i f i c a t i v a en el

contenido de p r o t e T n a de o r i g e n u n i c e l u l a r si es sometida a

un proceso f e r m e n t a t i v o , ya que l a c á s c a r a de n a r a n j a con-

t i e n e una c a n t i d a d de c a r b o h i d r a t o s , que l a hace atractiva

como s u s t r a t o . Al hablar de cSscara de n a r a n j a , se hace r e -

*

ferencia a todo el desecho s o b r a n t e en el procesamiento del

j u g o con p r e v i a e x t r a c c i ó n de l o s a c e f t e s e s e n c i a l e s que por

sus c a r a c t e r í s t i c a s pueden a c t u a r como bactericidas.

La c o m p o s i c i ó n q u í m i c a de l a cSscara de n a r a n j a , no se

ha e s t u d i a d o con d e t e n i m i e n t o , s i n embargo, se conocen en -

forma g e n e r a l los constituyentes de cada uno de sus tejidos.

En el Flavedo o E d i c a r p o encontramos pigmentos c.aro.t,eno-

ides, vitaminas y aceites esenciales. En e l Albedo o Meso-

carpo e s t á n presentes celulosa, carbohidratos s o l u b l e s , pro-

topectina, peet i na, a m i n o á c i d o s y v i t a m i n a s y en l o s segmen-

t o s que cubren l o s sacos de j u g o se ponen en e v i d e n c i a ce-

lulosa, pectina, azúcares, aminoácidos y m i n e r a l e s ( 3.).

En l o s procesos b i o t e c n o l ó g i c o s generalmente se involucra

la presencia de enzimas e x t r a c e l u l a r e s que h i d r o l i z a n ' los

polímeros carbonados de a l t o peso m o l e c u l a r , y en e l caso

del m a t e r i a l que en é s t e nos ocupa, l a s p e c t i n a s a s son de

gran i m p o r t a n c i a . Tales enzimas se f o r m a n . ¿ e b i d o a l a ac-

ción aislada o en c o n j u n t o de una s e r i e de enzimas como las

pectinesterasas, producidas por algunos géneros de C l o s t r i -

d i um^Pseudomonas y a l g u n o s hongos como e l F u s a r i um, Penici-

11 i um y A s p e r g i l l u s , l a s p o l i g a l a c t u r o nasas p r o d u c i d a s por -

hongos y l e v a d u r a s , las poligalacturonato-1iasas producidas

por a l g u n o s b a c i l l u s , Aeromonas, Xantomonas, Erwi n í a s y las

p o l i m e t i 1 g a l a c t u r o n a t o - 1 i asa p r o d u c i d a s generalmente por

hongos ( 4 ).

Esta i n v e s t i g a c i ó n e s t á encaminada a d e t e r m i n a r el va-

lor potencial de l a c á s c a r a de n a r a n j a como f u e n t e de mate-

riales que por b i o t r a n s f o r m a c i ó n generen p r o t e l n a unicelu-

l a r , y de e v i d e n c i a r la actividad pectinolítica de una cepa

de A s p e r g i 11 us s p . y o t r a de P e n i c i 11 ioim sp. aisladas de ma-

teriales pécticos.
 B.- MATERIALES Y METODOS

I.- A i s l a m i e n t o y S e l e c c i ó n de M i c r o o r g a n i s m o s :

El aislamiento de l o s m i c r o o r g a n i s m o s se l l e v ó a cabo -

en una r e l a c i ó n de 1 0 : 5 v / v . Para n a r a n j a s infectadas y -

tejidos infectados se tomó de l a m u e s t r a con h i s o p o estéril,

diluyéndolo en agua e s t é r i l . Para a i s l a r cepas con p a s i b l e

actividad p e c t i n o l T t i c a y c a p a c i d a d de a s i m i l a r l o s produc-

t o s de h i d r ó l i s i s , se e s c o g i ó á r e a s e s p e c í f i c a s como s u e l o s ,

naranjas infectadas y tejidos infectados. Para determinar

l a s e l e c c i ó n de l o s m i c r o o r g a n i smos que se emplearon en e s t a

investigación, é s t o s se i n o c u l a r o n en un medio de cultivo,

que c o n t e n í a cascara de naranja como f u e n t e de e n e r g í a t

b l a No. I ). En l a t a b l a No. I I , se d e s c r i b e e l criterio -

utilizado en l a s e l e c c i ó n de e s t o s microorganismos.

El c r e c i m i e n t o de l o s m i c r o o r g a n i s m o s se observó por un

tiempo máximo de 72 h o r a s , s i n embargo, a l g u n a s de "las cepas;

en 24 h o r a s crecieron profusamente, en agar c á s c a r a de na-

ranja, a una t e m p e r a t u r a de 28°C.

Conjuntamente con e s t e método de c r e c i m i e n t o . s e observó

el d e s a r r o l i o de l a s cepas en un medio n u t r i t i vo liquido-

similar al anterior, donde se colocaron porciones unifor-

mes de t r e s cms. de l a cáscara ( 8% p / v ) , y se mantuvo en

agitación por ocho días en m a t r a c e s de 250 m i . , c o n 100 mis.

de m u e s t r a a 28°C; a l c u a r t o d í a de a g i t a c i ó n a 200 r.p.m.,

disminuyó la p o r c i ó n de l a c á s c a r a con f o r m a c i ó n de micelios.

Se h i c i e r o n pruebas para l a d e t e r m i n a c i ó n de p r o t e i n a encon-

t r á n d o s e una c a n t i d a d s i g n i f i c a t i v a en una de l a s cepas in-

vestigadas .

Se a i s l a r o n un t o t a l de 15 c e p a s , de é s t a s , se e s c o g i e -

ron dos que se e v a l u a r o n de a c u e r d o a su d i s p o s i c i ó n de ere»

cimiento, c a n t i d a d de p r o t e i n a presente p o s t e r i o r al proce-

so f e r m e n t a t i v o . En l a s cepas t r a b a j a d a s predominaron las

de a s p e c t o de hongos y levaduras.

Los dos m i c r o o r g a n i s m o s seleccionados, posiblemente de

l o s géneros A s p e r g i l l u s sp. y P e n i c i l l l u m sp., se emplearon

unidos en e l proceso c o n s i d e r a n d o que el m i c r o o r g a n i s m o con

características pectinolíticas conduciría a la biodegrada-

c i ó n de l a pectina con l a p o s t e r i o r utilización de l o s pro-

ductos c a t a b o l i z a d o s por ambos.

Para comprobar s i los microorganismos, uno a i s l a d o del

suelo y o t r o de n a r a n j a s infectadas, podrían t r a b a j a r armo-

ni o s a m e n t e , se h i c i e r o n c r e c e r en agar c á s c a r a de n a r a n j a -

durante 24 h o r a s a 28°C s i n o b s e r v a r inhibición.

II.- Identificación de l o s Microorganismos.

Para l a identificación de l a s cepas se l l e g ó hasta el -

género s i n a b a r c a r l a e s p e c i e , se empleó p a r a v s u identifica-

c i ó n l o s métodos c l á s i c o s con l o s que se c u e n t a : Observa-

ción macroscópica, observación microscópica y preparación -

con a z u l de l a c t o f e n o l . Para l a o b s e r v a c i ó n m a c r o s c ó p i c a --

se hace r e f e r e n c i a a l a s t a b l a s No. III y IV ( 5 ),

III.- Identificación de Microorganismos Pectinaliticos:

El medio se preparó de acuerdo a l a l i t e r a t u r a citada y

una vez que se e s t e r i l i z ó se a j u s t ó el pH a 7 , se observó

el crecimiento de l a s cepas y a l a s 48 horas se l e agregó a

la placa p e t r i l , acetil bromuro de amonia conocida como Ce-

t a v l o n TM. El C e t a v l o n TM es un agente o p a c o ; e l diámetro -

de l a zona c l a r a g e n e r a l m e n t e se r e l a c i o n a con el microorga-

nismo que . p o t e n c i a l m e n t e descompone l a p e c t i n a ( 6 y 7 ).

El promedio de l a zona de p r e c i p i t a d o f u e de 0 . 5 cms. Este

método de i d e n t i f i c a c i ó n se u t i l i z ó con c i n c o microorganis-

mos que i n c l u í a n e l As p e r g i 1 1 u s s p . y Peni c i T1 i um s p . La

1 i tera tura c i e n t í f i c a comenta que e l C e t a v l o n se d e j a de 20

a 30 m i n u t o s , sin embargo, en l a investigación que se re-

alizó se e n c o n t r ó que v a r i a b a el t i e m p o de incubación con

rangos que o s c i l a b a n de 45 m i n u t o s a 1 hora. El Cetavlon

TM se probó a d i v e r s a s concentraciones encontrándose que en

A
la s o l u c i ó n o r i g i n a l era como actuaba satisfactoriamente (6, 7).
IV.- Material de Desecho I n d u s t r i a l Utilizado COBO Sustrato:

La c á s c a r a de n a r a n j a p r o c e s a d a , f u e eí s u s t r a t o emplea-

do en l a investigación, se p u l v e r i z ó en l a licuadora Osteri-

zer a cinco minutos en baja r e v o l u c i ó n y c i n c o en a l t a ; para

obtener partículas u n i f o r m e s se l l e v ó a cabo l a tanlzación.

La muestra p u l v e r i z a d a se probó a c o n c e n t r a c i o n e s de 2 5 , 30,

3 5 , 40 y 45% p / v e n c o n t r á n d o s e que l o s m e j o r e s resultados -

se o b t e n í a n a 202 p / v .

V.- C o m p o s i c i ó n del Medio de Cultivo:

Se a c e p t a en t é r m i n o s generales que el medio de f e r m e n -

t a c i ó n se d e s a r r o l l a con una mezcla de a r t e y c i e n c i a . Las

bases c i e n t í f i c a s se a f i a n z a n en el c o n c e p t o de l a s bases -

bioquímicas de l o s m i c r o o r g a n i s m o s , e n c o n t r á n d o s e que son -

generales a un buen número de e s p e c i e s . El a r t e se r e q u i e -

re cuando se desconocen l o s detalles específicos del micro-

organismo en estudio.

Para e l a b o r a r la parte c i e n t í f i c a de un medio de culti-

v o , es n e c e s a r i o tomar en c u e n t a :

Ì).- La c o m p o s i c i ó n q u í m i c a del sustrato a utilizar

11).- Necesidades nutricionales de l o s o r g a n i smos

i i i ). - Estudio de l o s compuestos empleados como f a c t o r e s -

importantes para e s t i m u l a r la acción c a t a b ò l i c a . Estos fac-

tores son f u n d a m e n t a l e s ya que t i e n e n influencia significa-

 Q

t i v a sobre el s i stema b i o q u í m i c o del proceso.

La c i s c a r a de n a r a n j a posee compuestos q u í m i c o s que se

requieren para l a f e r m e n t a c i ó n , según puede o b s e r v a r s e en -

l a T a b l a No. V, l o que se tomó en cuenta para l a e l a b o r a c i ó n

del medio de c u l t i v o . En l a Tabla No. VI se observa la

c o n c e n t r a c i ó n de carbono que es i m p o r t a n t e tomando en cuen-

t a que e n t r e l o s aportadores principales de e s t o s carbonos

esta la f i b r a cruda compuesta de: celulosa, p e n t o s a n a s , he-

micelulosas, etc. En l a l i t e r a t u r a científica se pueden es-

tudiar las d i s t i n t a s c o n c e n t r a c i ó n es de l a f i b r a cruda pre-

s e n t e en mayor o menor c a n t i d a d en l o s p r o d u c t o s vegetales.

En l a t a b l a No. V I I se o b s e r v a que en l a c a s c a r a de n a r a n j a

es de un 30£. Es i m p o r t a n t e señalar la p r e s e n c i a de otros

compuestos, que pueden s e r v i r como f u e n t e de e n e r g í a como -

son: Almidón, pectina, etc.

La f u e n t e de n i t r ó g e n o utilizada fue f o s f a t o de amonia

sirviendo el fosfato en el proceso como e s t a b i l i z a d o r del -

pH. Hay c i e r t o s elementos que son e s e n c i a l e s para e l c r e c i -

m i e n t o de l o s hongos como s o n : cobre, magnesio, calcio,

z i n c , y t a m b i é n como a c t i v a d o r e s de l a s enzimas necesarias

en e l m e t a b o l i s m o d e l proceso. En l a T a b l a No. V se c o n s i -

dera l o s puntos de e s t e medio ú t i l i z a d o en l a investigación.

En l a s o l u c i ó n con t r a z a s de e l ementos, el cloruro de -

c a l c i o se d i s o l v i ó a p a r t e ya que presentaba d i f i c u l t a d en -

su c l a r i f i c a c i ó n ; el c l o r u r o de Zinc se a c i d i f i c ó para que

no p r e c i p i t a r a el r e s t o de l a s o l u c i ó n . La p r e s e n c i a de ex-

t r a c t o de l e v a d u r a en e l medio fue para p r o > e e r a l o s orga-

nismos de f u e n t e s de v i t a m i n a s y aminoácidos , porque aunque

se conoce l a e x i s t e n c i a de e s t o s compuestos en l o s tejidos

de l a c a s c a r a no se c o n t ó con un dato e x a c t o a l respecto.

VI.- Proceso de Esterilización:

La e s t e r i l i z a c i ó n se probó a d i v e r s a s p r e s i ó n es y tem-

peraturas debido a l a resequedad que se observaba e n * l a s -

2
muestras inclusive a 0 . 7 0 3 Kg/cm y 110°C d u r a n t e 15 línn.,

e n c o n t r á n d o s e que no había a l t e r a c i ó n en el medio cuando la

o

esterilización de l l e v a b a a e f e c t o a 0 . 5 6 3 kg/cm de presión

a 114°C por 45 m i n u t o s . Para p r o b a r l a e f e c t i v i d a d d e l mé-

t o d o de e s t e r i l i z a c i ó n utilizada» todos l o s matraces e s t e r i -

lizados se d e j a r o n a t e m p e r a t u r a de 28 y 37®C d u r a n t e 10 -

d í a s y en ninguno de l o s casos se o b s e r v ó crecimiento.

VII.- Método de Inoculación:

Para e l i m i n a r o disminuir l a f a s e de l a t e n c i a requerida

para l a g e r m i n a c i ó n de e s p o r a s , se c o l o c ó s u s p e n s i ó n de ca-

da una de l a s cepas en un matraz de 250 m i . con 100 m i . de

muestra empleada en l a investigación, sustituyendo 1 a^ cSs-

cara de n a r a n j a por g l u c o s a como f u e n t e de c a r b o n o , ( 8 ).

Se c o l o c ó en a g i t a c i ó n por 24 horas a 200 r . p . m . a 28°C, -

para l e e r en e l e s p e c t r o f o t ó m e t r o Beckman J ú n i o r II a -

500 nm empleándose una t u r b i d é z e q u i v a l e n t e a 66% de t r a n s -

mitancia. De e s t a m u e s t r a se tomó 5 m i , respectivamente -

para e l proceso de f e r m e n t a c i ó n .

VIII.- Proceso de Fermentación:

En m a t r a c e s de 250 m i , con 100 m i . de s o l u c i ó n a una

temperatura de 28°C y a g i t a c i ó n a 250 r . p . m . se diÓ inicio

al cultivo sumergido. El tiempo de f e r m e n t a c i ó n f u e de -

s e i s d í a s a pH 6, s i n o b s e r v a r s e d i s m i n u c i ó n en e l volumen
*

d e l medio y l e v e s v a r i a c i o n e s en l a t e m p e r a t u r a . No se ob-

s e r v a r o n cambios f í s i c o s visibles, la v a r i a c i ó n del pH se

comprobó a l tercer d í a cuando b a j ó a 5 , a g r e g á n d o l e una so-

l u c i ó n de f o s f a t o s para m a n t e n e r l o en e l pH ó p t i m o .

IX.- Métodos de Análisis:

A.- D e t e r m i n a c i ó n de P e c t i n a Total:

La muestra se t r a b a j ó a una d i l u c i ó n de 1 : 3 5 , a 10 m l . -

de l a muestra se l e agregó 1 m i . de l a s o l u c i ó n de hidróxi-

do de sodio al 102 para s o l u b i l i z a r los compuestos pécticos

como p e c t a t o de s o d i o . A los 15 m i n u t o s se f i l t r a b a la so-

lución, se agregó el ácido c l o r h í d r i c o , y posteriormente se

empleó c a l o r . La c u r v a de c a l i b r a c i ó n se t r a b a j ó con p e c t i -

na grado 1 , con una s o l u c i ó n p a t r ó n de l g . x 1000 m i . ( 9 ).

B.- Análisis de Carbohidratos:

Las m u e s t r a s se t r a t a r o n por el metodo de Fenol para la

determinación cuantitativa de c a r b o h i d r a t o s ( 10 ).

C.- Determi n a c i ó n de Proteína:

En l a d e t e r m i n a c i ó n de p r o t e í n a se t r a b a j ó con l a modi-

ficación de B i u r e t llamada de Robinson-Hodgen, haciendo las

e x t r a c e iones con h i d r ó x i d o de s o d i o 1 . 0 N ( 10 ).

Para l a identificación de l o s carbohidratos presentes -

en e l proceso de f e r m e n t a c i ó n se u t i l i z ó cromatografía de -

papel por e l método d e s c e n d e n t e , empleándose para el reve-

l a d o una s o l u c i ó n p - a n i s i d i n a 0 . 1 M y ácido f t à l i c o 0.1 M -

en e t a n o l al 96% ( 11 y 12 } .

El p r o c e s o de secado se r e a l i z ó en una e s t u f a de vacío

a -0.84 Kg/cm 2 a 80°C, por 48 Hs.

 C.- RESULTADOS

Los m i c r o o r g a n i s m o s utilizados, cuyas c a r a c t e r í s t i c a s -

se mencionan en l a s tablas V I I I y IX, fueron seleccionados

de acuerdo a su c a p a c i d a d de c r e c i m i e n t o s sobre el a g a r cás-

cara de n a r a n j a , considerándose que había 15 cepas distin-

t a s de l a s cuales s o l o dos se e s c o g i e r o n de acuerdo a l o s -

p a r á m e t r o s mencionados en l a T a b l a I I y l a comprobación en

el medio de f e r m e n t a c i ó n de l a p r e s e n c i a de p r o t e í n a unice-

lular en c a n t i d a d aceptable.

La cepa de A s p e r g i l l u s sp. y P e n i c i l l i u m sp. conducen a

una buena a s i m i l a c i ó n de c a r b o h i d r a t o s , principalmente de -

la glucosa, e v i d e n c i a n do su c a p a c i d a d para biotransformar

sustratos carbonados en p r o t e í n a s . La cepa de A s p e r g i l l u s

sp. m a n i f i e s t a características p e c t i n o l í t i cas significati-

vas, s i tomamos en cuenta que ambos m i c r o o r g a n i s m o s se ino-

c u l a r o n en un medio c o n t e n i e n d o pectina como ú n i c a f u e n t e -

de c a r b o n o . El A s p e r g í 11 us s_p. c r e c i ó en forma de esfe-

rillas, no a s í el Peni c i 1 1 i um que no p r e s e n t ó crecimiento

por l o s tres días en que se mantuvo en a g i t a c i ó n 200 r.p.m.

a 20°C.
 Adicional a e s t a etapa en e l proceso de f e r m e n t a c i ó n se

tiene la fase del oxigeno s o l u b i l i z a d o por d i f u s i ó n simple-

de a i r e durante la a g i t a c i ó n , en l a que no se empleó ningún

control adicional debido a la l i m i t a c i ó n de.4os instrumentos

u t i 1 izados.

Esta a g i t a c i ó n se l l e v ó acabo a 250 r . p . m . para proveer

h a s t a donde se pudiera la oxigenación del proceso.

La t e m p e r a t u r a f u e mantenida a 28°C ya que se comprobó-

que t r a b a j a b a s a t i s f a c t o r i a m e n t e a la vez que simplificaría

el proceso de escalamiento.

En l o s e x p e r i m e n t o s realizados para d e m o s t r a r la a c t i v i -

dad p e c t i n o l í t i c a se e n c o n t r a r o n halos de p r e c i p i t a d o con

promedio de 0 . 5 cm en e l caso del A s p e r g i 1 Tus s p . , lo cual

pone en e v i d e n c i a que e s t a cepa t i e n e cualidades excelentes

para s e r usada t a n t o como b i o d e g r a d a d o r de l o s polímeros

c a r b o n a d o s , a s i como de b i o t r a n s f o r m a d o r de 1 os p r o d u c t o s -

de h i d r ó l i s i s en proteína.

La u t i l i z a c i ó n de 2 cepas m i c r o b i a n a s , una de e l l a s con

c a p a c i d a d de h i d r o l i z a r polímeros carbonados p r e s e n t e s en e l

sustrato ( pectina ) y l a buena c a p a c i d a d de ambas para a s i -

milar l o s p r o d u c t o s de h i d r ó l i s i s aumenta l a p o s i b i l i d a d de

obtener cantidades apreciables de p r o t e í n a unicelular.

Las pruebas r e a l i z a d a s para d e t e r m i n a r l a r e l a c i ó n sólido-

liquido ó p t i m a para l a p r o d u c c i ó n de p r o t e l p a , d i e r o n como

r e s u l t a d o que s i la c á s c a r a de n a r a n j a se a d i c i o n a a l 20%

p/v, l a s mayores c o n c e n t r a c i o n e s de p r o t e l n a * f u e r o n obteni-

das, las o t r a s c a n t i d a d e s , probadas m o s t r a r o n problemas de

esterilización ya que l a muestra al s a l i r del autoclave se

mostraba p a s t o s a , y se h a c i a d i f í c i l l a a g i t a c i ó n y en con-

s e c u e n c i a se p r e s e n t a b a una a e r e a c i ó n d e f i c i e n t e » Cabe a-

clarar a q u í que en e s t o s casos l a e s p o r u l a c i Ó n se presentó

más tempranamente.

En l a gráfica No. 1 se muestran l o s r e s u l t a d o s de p r o -

teína unicelular obtenidas haciendo v a r i a c i o n e s eji e l pH -

del medio de f e r m e n t a c i ó n , en l a mencionada g r á f i c a puede

n o t a r s e que l o s m e j o r e s r e n d i m i e n t o s de p r o d u c c i ó n de p r o -

teína fueron obtenidos en un rango de pH que va de 5 a 7 -

con un máximo o b s e r v a b l e a pH 6. Esto nos da una idea clara

respecto a que l a s enzítnas i n v o l u c r a d a s en e l proceso tie-

nen su máxima a c t i v i d a d a pH 1 i g e r a m e n t e ácidas.

En l a s gráficas 2 y 3 , se puede o b s e r v a r la curva de

i n c r e m e n t o de p r o t e i n a unicelular en f u n c i ó n del tiempo de

fermentación, detectándose un máximo de p r o d u c c i ó n a l 5o -

día de i n c u b a c i ó n a 28°C. En l a f i g u r a 3 puede t a m b i é n ob-

s e r v a r s e que el máximo de p r o d u c c i ó n de p r o t e í n a coincide

con una c l a r a d i s m i n u c i ó n en l a v e l o c i d a d de a s i m i l a c i ó n -

de c a r b o h i d r a t o s , mientras que e l pH se m a n t i e n e constante

durante todo el p r o c e s o . La c u r v a de proteína soluble pre-

s e n t a un i n c r e m e n t o c o n s i d e r a b l e entre el p r i m e r o y segundo

d í a de f e r m e n t a c i ó n » l o cual I n d i c a que l a mayor producción

de p e c t i n a s a s o c u r r e en ese l a p s o de tiempo,-' manteniéndose

con l i g e r o i n c r e m e n t o en l o s d í a s posteriores.

En e l análisis cromatográfico del c a l d o de f e r m e n t a c i ó n

al 5° día de i n c u b a c i ó n se d e t e c t ó que l a g l u c o s a había si-

do consumida c a s i en so t o t a l i d a d , m i e n t r á s que o t r o s car-

bohidratos se p r e s e n t a r o n en e l análisis como por e j e m p l o -

ácido g a l a c t u r ó n i c o , ramnosa, a r a b i n o s a y g a l a c t o s a . La li-

teratura científica menciona que l a p e c t i n a en su hiSróli-

sis t o t a l , rinde ácido péctico (ácido poli galacturónico) en

el cual hay un grupo c a r b o x i l o por cada r e s i d u o de á c i d o -r

galacturónico, por l o cual l a p r e s e n c i a de á c i d o galacturó-

nico confirma l a p r e s e n c i a de una a c t i v i d a d pectinolítica -

en el medio de fermentación.
 D. - DISCUSION Y CONCLUSIONES

Las dos cepas del pro ceso conducen a un i ncremento im-

p o r t a n t e de l a proteína u n i c e l u l a r , que puede considerarse-

posteriormente en procesos con una c o n c e n t r a c i ó n mayor de

sustrato, tomando en cuenta l a s c a r a c t e r í s t i c a s pectinolíti-

cas de uno de l o s dos m i c r o o r g a n i s m o s que p o d r í a n l l e v a r a

*

la h i d r ó l i s i s total de l a p e c t i n a o de o t r o p o l í m e r o presen-

t e en e l sustrato sólido.

La a d i c i ó n de g l u c o s a en e l proceso p o d r í a l l e v a r n o s a

datos i n t e r e s a n t e s , ya que f u e l a de mayor a s i m i l a c i ó n , si

consideramos que hay una c a n t i d a d de g a l a c t o s a p r e s e n t e en

el cromato grama a l f i n a l de la 6 i o t r a n s f o r m a c i ó n , s i n embar-

go , l o s mi c r o o r g a n i s m o s ú t i l i z a dos t i e n e n c a p a c i d a d de c r e -

cer a s i m i l a n d o galactosa como f u e n t e de c a r b o n o .

En l o s m a t r a c e s inoculados en l a i n v e s t i g a c i ó n se obser-

varon r e s i d u o s del sustrato ( como p u n t o s o s c u r o s ) que no-

fueron biodegradados que pueden p e r t e n e c e r a la c e l u l o s a re-

sidual, lignina o hemicelulosa.

La t é c n i c a de e v a p o r a c i ó n parece recomendable en alter-

n a t i v a a una f i l t r a c i ó n para r e c u p e r a r la proteína desuelta

en el s o b r e n a d a n t e ya que como se o b s e r v a en la gráfica No. 3

es de i m p o r t a n c i a en e l proceso.

El p r o d u c t o procesado se o b t i e n e con buena t e x t u r a y -

olor penetrante pero a g r a d a b l e con un p o r c e n t a j e de protel-

na de aproximadamente el 30% en base s e c a , s i n l l e g a r a de-

t e r m i n a r s e su d i s p o n i b i l i d a d como a l i m e n t o b a l a n c e a d o , e l -

c o n t e n i d o de l a c á s c a r a s i n su b l o t r a n s f o r m a c i ó n se emplea

como a l i m e n t o para aves jr ganado vacuno.

No se r e a l i z ó un e s t u d i o de l a s d i v e r s a s temperaturas -

que p o d r í a n o p t i m i z a r e l s i s t e m a , s i n embargo, considerando

que l o s hongos t r a b a j a n a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e y en un p r o -

ceso b i o t e c n o l ó g i c o l o que se a s p i r a es r e d u c i r los gastos

de o p e r a c i ó n y o p t i m i z a r las fases de l a biotransformación

adecuadamente a l a s necesidades.
 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Third Edition. 14 { 1967 ).

APENDICE DE TABLAS
 TABLA No. I

Composición Química de Agar Cascara de Na-

r a n j a para s e l e c c i ó n de m i c r o o r g a n i s m o s - -
peci n o l 1 t i eos.

Cascara de N a r a n j a B% p/v

F o s f a t o de P o t a s i o Monobásico 0.2 g/1

Fosfato de P o t a s i o Dibàsico 0.2

Cloruro de Sodio 0.1

Sulfato de Magnesio 0.1

Cloruro de Ca1 c i o 0.1

Extracto de Levadura 0.3

Agar 3%
Parámetros utilizados para l a S e l e c c i ó n de

Microorganismos en Agar Cáscara de N a r a n j a

a).- Tfempo de crecimiento

b).- O b s e r v a c i ó n m a c r o s c ó p i c a de l a ce-

pa ( Abundancia en c r e c i m i e n t o so-

bre l a s u p e r f i c i e ).

c}.- Area de crecimiento.

( T o t a l , mediana, p a r c i a l )
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 Constituyentes Químicos de l a Cáscara de

Naranja.

% en Peso seco

M a t e r i a seca 80%

Ceni zas 2.91%

Ca1 c i ó 0.64%

Magnesio 0.11%

Potasio 0.46%

Sodi o 0.02%

Sulfato 0.23%

Fosfato 0.19%

Carotenos 265 j j g / g

V i t a m i n a Complejo B Trazas.

Rockland, L.t The Orange Ed. S i n c l a i r , w

The U n i v e r s i t y of C a l i f o r n i a , Division of -
Agricultural Science ( 1961 ) .
 Composición Química del Medio de C u l t i v o

( 14 ).

Cáscara de N a r a n j a 20 g/1

F o s f a t o de Amonia 2

F o s f a t o de P o t a s i o Monobásico 0.5

F o s f a t o de P o t a s i o Dibásico 0.5

Solución con Trazas de Elementos

S u l f a t o de Magnesio 100 g/1

Cloruro de Sodio 20

C l o r u r o de C a l c i o 2

S u l f a t o de Manganeso 5

C1oruro de H i e r r o 0.5

S u l f a t o de Cobre 0.05

Cloruro de Z i n c 0.005

Extracto de levadura 0.5

 TABLA No, VII

Composición de Conpuestos Carbonados y -

Nitrogenados con l a Cáscara de Naranja -

Fibra cruda 30«

Azucares reductores 8.5X

Pectinas (. como P e c t a t o de «

Calcio ) 8.0

Nitrógeno total 5.9X

 TABLA No. VIII

Características Microscópicas de Aspe_rgi 1 -

Tus SP. ( 5 , 15 ).

ConidiÓforos no septados

Conidios alargados en cadenas

S e p a r a c i ó n de l o s c o n i d o s en

la vesícula

S m i t h , G., í n t r d u c c i ó n a la Micologia I n -
dustrial pp- 171 E d i t o r i a l A c r i b i a , M é x i c o .
 TABLA Ho. IX

C a r a c t e r í s t i c a s Microscópicas de Peni c i 4 -

1ium sp. ( 5 , 15 ).

Conidióforo septado

Cadena de c o n i d i o s unidos al ester-

i gma

S i n s e p a r a c i ó n de i o s c o n i d i o s en l a

veslcula

Smith, G., Introducción a la micologia In-

d u s t r i a l pp. 171 E d i t o r i a l A c r i b i a , M é x i c o .
APENDICE DE GRAFICAS
 T I E M P O ( DIAS)

• PH « 6
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GRAFICA 1 . Ffprtn Hel iiü H»1 nmHin rie rultívft (/\Kre 1a nrn.
 Tiempo (días)

O - C O N C E N T R A C I O N DE PROTEINA UNICELULAR EN MG/flf.

DE MUESTRA SECA.

GRAFICA 2 Curva de p r o d u c c i ó n de p r o t e T n a en f u n c i ó n del

tiempo.
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100 —

O- CONCENTRACION DE PROTEINA UNICELULAR

O - CONCENTRACION DE CARBOHIDRATOS (SOBRENADANTE)

A — CONCENTRACION DE PROTEINA SOLUBLE

*— CONTROL DE PH

TA• 1 - Var1nn + AC cn A 1
 H,- BIOGRAFIA DE LA AUTORA

La a u t o r a , originarla de Panamá, RepübTíca de Panamá,

nació el 4 de mayo de 1 9 4 5 , es h i j a de C r i s p i n C o r n e j o He-

neses y de I l u m i n a d a Montenegro de C o r n e j o , m a t r i m o n i o for-

mado por dos hermanos más; Rolando Anel y M a r c e l a J u d i t h ,

la Instrucción p r i m a r i a f u e r e c i b i d a en e l Colegio Interna-

•

cional de M a r í a Inmaculada, los estudios secundarios fueron

realizados en e l C o l e g i o antes m e n c i o n a d o , de l a c a p i t a l , -

Panamá. De a 11f pasó a l a U n i v e r s i d a d de Panamá, para cur-

sar l a L i c e n c i a t u r a en B i o l o g í a con e s p e c i a l i d a d en Tecnolo-

gía Médica. Al recibir el T i t u l o , inició l a d o c e n c i a en l a

U n i v e r s i d a d de Panamá h a s t a e l afio 1979, que v i n o a Monte-

rrey, a iniciar estudios de M a e s t r í a en M i c r o b i o l o g í a Indus-

trial, en l a F a c u l t a d de C i e n c i a s Q u í m i c a s , de l a Universi-

dad Autónoma de Nuevo León, f i n a l i z a n d o en mayo de 1 9 8 2 .

Actualmente t r a b a j a de P r o f e s o r Temporal en l a Escuela de -

Biología, U n i v e r s i d a d de Panamá, en el área de Microbiología.