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Carbohidratos: análisis cualitativo

Tipo de práctica: Duración: Indicaciones de peligro:

Grupal (2
4 horas
personas)

OBJETIVOS
 Diferenciar las sustancias que contienen carbohidratos simples por medio de reacciones
químicas.
 Identificar monosacáridos, disacáridos y polisacáridos a través de pruebas cualitativas
 Identificar la presencia de azúcares reductores en una muestra biológica
Conceptos relacionados: Carbohidrato, azúcares reductores, almidón.

FUNDAMENTO TEÓRICO
Los carbohidratos son los compuestos orgánicos más abundantes de la biosfera. La mayoría
pueden ser representados con la fórmula general C n(H2O)n, por lo que se les conoce cono
hidratos de carbono. Gran parte de sus funciones biológicas dependen de su estructura química
tan particular y versátil. Ellos son componentes fundamentales de muchos alimentos y su
degradación durante el proceso de digestión genera la energía necesaria para las funciones
vitales del organismo. Cuando se encuentran combinados con otras biomoléculas, dan origen a
moléculas más complejas cuyas funciones pueden ser estructurales o de soporte celular y
tisular, de comunicación entre células, de reconocimiento o de señalización. Químicamente se
definen como polihidroxialdehídos o polihidroxiacetonas cíclicas o sustancias que luego de
hidrolizarse dan origen a los mismos. Un carbohidrato que no puede ser hidrolizado en uno más
simple es llamado monosacárido. En general, los carbohidratos pueden agruparse en cuatro
grandes grupos:

a. Monosacáridos:

Pentosas: Xilosa (madera), D-ribosa y D-desoxiribosa (ácidos nucleicos), y arabinosa (gomas,

mucílagos y pectinas que normalmente ingerimos en mermeladas y dulces)

Hexosas (son 24 pero, solamente 4 tienen rancia biológica):

D-glucosa presente en los frutos maduros y en todas las células.
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D-manosa siempre aparece combinada, nunca libre.
D-galactosa asociada con lípidos complejos, puede ser convertida en glucosa en el hígado.
D-fructosa se encuentra en la miel y en los jugos de frutas. Tiene un sabor muy dulce.

b. Disacáridos:

Maltosa, lactosa y sacarosa. Maltosa presente en la malta o cebada germinada y es muy soluble
en agua. Lactosa: Es el azúcar de la leche y es poco soluble en agua. Sacarosa: Es el azúcar de
mesa, se obtiene de la caña de azúcar y de la remolacha, y es muy soluble en agua.

c. Oligosacáridos:

Trisacáridos: la rafinosa se encuentra en las legumbres. Tetrasacáridos: estaquiosa, el más

estudiado, se encuentra en las semillas de soya.

d. Polisacáridos:

 Almidón: está constituido por dos polímeros de D-glucosa, uno lineal “la amilosa” y el otro
ramificado, “la amilopectina”. La amilosa es un polímero lineal formado por 250-300 unidades
de α-D-glucopiranosa, unidas exclusivamente por enlaces α (1→4). La amilosa se disuelve
fácilmente en agua adquiriendo una estructura secundaria característica, de forma helicoidal,
en la que cada vuelta de la hélice tiene 6 unidades de glucosa. La amilopectina es un
polímero ramificado compuesto por unas 1000 unidades de α-D-glucopiranosa. Además de
las uniones α (1→4) contiene uniones α (1→6). Las uniones α (1→6) están regularmente
espaciadas (cada 25-30 residuos de glucosa), y son los puntos por donde se ramifica la
estructura. Cada rama contiene únicamente uniones α (1→4).

 Glucógeno: es un polímero de moléculas de D-Glucosa unidas por enlaces α (1→4) y α

(1→6), presente en el hígado y en los músculos. Es un polisacárido de reserva de las células
animales y ayuda a controlar los cambios de presión osmótica que la glucosa libre podría
ocasionar en la célula.

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 Celulosa: Es el principal componente de la pared celular de los vegetales. Se puede
considerar como la molécula orgánica más abundante en la Naturaleza. Es un polímero lineal
de varios miles de moléculas de glucosa unidas por enlaces  (1→4).

 Inulina: Aparece en los tubérculos de dalia, ajos y cebollas. Liquenina: presente en los
musgos y líquenes.

 Mucopolisacáridos: Cumplen función de sostén, nutrición y comunicación intercelular.

Algunos azúcares tienen la propiedad de oxidarse en presencia de agentes oxidantes suaves

como el ion Fe3+ o Cu2+. Esta característica radica en la presencia de un grupo carbonilo libre, el
cual es oxidado y genera un grupo carboxilo. Por lo tanto, aquellos azúcares con un grupo
carbonilo libre son llamados azúcares reductores y aquellos en los que el grupo carbonilo se
encuentra combinado en unión glicosídica se conocen como azúcares no reductores. Existen
varias reacciones químicas que permiten identificar si una muestra presenta azucares reductores
o no. Algunas de ellas son, la prueba de Benedict, Fehling, Tollens. Por otra parte, la prueba de
yodo es utilizada para identificar la presencia de polisacáridos como el almidón.

Pruebas cualitativas para el reconocimiento de carbohidratos

 Ensayo de Molisch

Este es un ensayo general para reconocimiento de carbohidratos. Consiste en hidrolizar los

polisacáridos y disacáridos con ácido sulfúrico concentrado hasta la formación de monosacáridos
y se convierten en derivados de furfural o 5-hidroximetil furfural los cuales reaccionan con alfa-
naftol formando un color púrpura-violeta.

 Prueba de Benedict

Esta prueba se basa precisamente en la reacción o no de un azúcar con el ion Cu 2+. El reactivo
de Benedict contiene soluciones de carbonato de sodio, sulfato de cobre, y citrato de sodio. El
Na2CO3 confiere a la solución un pH alcalino necesario para que la reacción pueda llevarse a
cabo. El citrato de sodio mantiene al ion Cu 2+ en solución ya tiene la propiedad de formar
complejos coloreados poco ionizados con algunos de los metales pesados. Con el cobre produce

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un complejo de color azul. Si se le agrega al reactivo una solución de azúcar reductor y se
calienta hasta llevar la mezcla a ebullición, el azúcar en solución alcalina a elevadas
temperaturas se convertirá en D-gluconato y su ene-diol, los cuales con sus electrones
expuestos, reaccionarán con el Cu2+. Se obtiene entonces un azúcar oxidado y dos iones Cu +.
Posteriormente el Cu+ producido reacciona con los iones OH- presentes en la solución para
formar el hidróxido de cobre, como se muestra a continuación:

Esquema 1. Reacción de la prueba de Benedict.

La aparición de un precipitado amarillo, anaranjado, o rojo ladrillo evidencia la presencia de un

azúcar reductor.
 Prueba de Barfoed

La prueba de Barfoed es un ensayo químico utilizado para identificar azúcares reductores y para
diferenciar monosacáridos de disacáridos mediante el tiempo de aparición del precipitado rojo
ladrillo (Cu2O).
Tiempo de reacción: 0 - 5 min → Azúcar Monosacárido
Tiempo de reacción: 5 - 30 min → Azúcar Disacárido

Se basa en la reducción del cobre II (en forma de acetato) a cobre I (en forma de óxido). La
reacción correspondiente a la prueba de Barfoed para obtener un resultado positivo es:

RCOH + 2Cu+2 + 2H2O → RCOOH + Cu2O↓ + 4H+

El reactivo de Barfoed se compone de una solución de 0.33 M de acetato de cobre neutro en una
solución al 1% de ácido acético. No es recomendable guardar el reactivo, sino prepararlo
previamente a su uso.
 Prueba de yodo para almidón

El polisacárido almidón está constituido de dos polímeros, amilosa y amilopeptina. La amilosa

está constituida de largas cadenas lineales de glucosa unidas en enlace glicosídico alfa 1,4

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(figura 1). Estas cadenas no poseen un tamaño determinado sino que pueden variar desde unos
miles de unidades de glucosa hasta un millón. Por otro lado, la amilopeptina posee, al igual que
la amilosa, cadenas lineales de glucosa unidas en enlace alfa 1,4 pero además, posee una gran
cantidad de ramificaciones, las cuales se presentan cada 24 a 30 residuos de glucosa y en enlace
glicosídico alfa 1,6.

El almidón es la molécula de reserva energética en las plantas por excelencia. Debido a que
muchos organismos superiores poseen las enzimas necesarias para su degradación, este
polímero puede ser convertido durante el proceso de digestión en diferentes intermediarios
metabólicos que generan energía. El glucógeno a su vez es la contraparte del almidón en el
reino animal, con la diferencia de que esta molécula posee una mayor cantidad de ramificaciones
que el almidón y es más compacta. La conformación de los enlaces alfa 1,4 presentes en estas
moléculas causa que estos polímeros asuman una estructura helicoidal muy estrecha. La prueba
del almidón es una prueba muy sencilla pero que todavía se utiliza para determinar la presencia
de almidón en algunos alimentos. La prueba se basa en una reacción física y no química, en la
cual el almidón reacciona con el yodo para formar un complejo de color azul intenso. Bajo las
mismas condiciones, el glucógeno da una coloración café.

Figura 1. Estructura química del almidón.

 Hidrólisis del almidón

Esta prueba tiene como objetivo demostrar que efectivamente los polisacáridos como el almidón
están compuestos de monosacáridos unidos por enlaces glicosídicos. El almidón está constituido

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de un solo monosacárido, la glucosa. Las propiedades del almidón son diferentes a las de la
glucosa como se evidenciará mediante la hidrólisis del almidón para generar glucosa. La
hidrólisis del almidón puede ser enzimática (utilizando la enzima alfa-amilasa) o química
(mediante hidrólisis con ácidos diluídos como HCl) y, el proceso de hidrólisis puede evidenciarse
fácilmente con dos pruebas:

a) Desaparición del color azul característico de la prueba del yodo.

b) Aparición de glucosa, un azúcar reductor. La aparición de glucosa puede evidenciarse
mediante la prueba de Benedict.

MATERIALES Y REACTIVOS
Materiales
Micropipetas 100, 1000 µL
Tubos de ensayo (16 unidades)
Gradilla para tubos de ensayo
Vaso de precipitados 20, 50 mL
Embudo
Gasa o algodón
Espectrofotómetro
Reactivos
Ácido sulfúrico concentrado
Alfa-naftol al 10% en etanol
Ácido acético al 25%
Reactivo de Barfoed
Reactivo de Benedict
Lugol (yodo al 1% y yoduro de potasio al 2%)
Agua potable (sin gas)
Carbón activado
Hielo

Soluciones al 1% p/v de cada uno de los

siguientes carbohidratos: Glucosa, fructosa,
sacarosa, maltosa, ribosa, Almidón,
carboximetilcelulosa.
PROCEDIMIENTO
1. Preparación de la muestra para los análisis:

a) Miel de abeja: disuelva 5.0 g de miel de abeja en 50 mL de agua destilada. De ser necesario,
caliente la solución en un baño de agua a 50°C con agitación constante.
b) Leche: Deposite los 50 mL de leche en un Beaker de 150 mL y adicione ácido acético al 25%
hasta observar precipitado (el pH debe estar cercano a 4.7). Centrifugar a 3000 rpm durante
5 minutos y retire el sobrenadante del precipitado. Utilice el sobrenadante para las pruebas
cualitativas.

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c) Suero sanguíneo: Almacene 50 mL de sangre en el refrigerador durante una hora.
Posteriormente, centrifugar a 5000 rpm durante 10 minutos y desechar el precipitado. Utilice
el sobrenadante (suero sanguíneo) para las pruebas químicas.
d) Jugo/bebida: Si la muestra es una solución transparente, puede utilizarse directamente para
las pruebas químicas. De lo contrario, a 50 mL de la muestra (jugo/bebida) adicione 1 g de
carbón activado, agitar y dejar reposar durante 15 minutos. Posteriormente, centrifugue la
muestra a 5000 rpm durante 10 minutos. Si en el sobrenadante persiste el color de la
solución original, repita el procedimiento anterior. Utilice el sobrenadante para las pruebas
químicas.

Para cada muestra, almacene en un recipiente adecuado y en el refrigerador, 10 mL de cada

muestra para ser utilizada la práctica siguiente “Carbohidratos: análisis cuantitativo”.

2. Reconocimiento cualitativo de carbohidratos:

Para cada prueba, utilice las soluciones de carbohidratos relacionadas en la siguiente tabla
(marcadas con X) y realice las observaciones para cada caso.

Prueba
Carbohidrato
Molisch Benedict Barfoed Bial Lugol
Arabinosa X X X
Glucosa X X X X
Fructosa X X
Sacarosa X X X
Maltosa X X X X
Almidón X X X X
Celulosa X
Muestra biológica X X X X X

 Ensayo de Molisch

En un tubo de ensayo, adicione 1 mL de la solución de carbohidrato (relacionados en la tabla a

continuación). Posteriormente, mezcle con 0.2 mL de alfa-naftol. Adicione 1 mL de ácido
sulfúrico concentrado (lentamente por las paredes del tubo de ensayo). NO MEZCLAR LA

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SOLUCIÓN RESULTANTE. La formación de un anillo violeta en la interfase es prueba positiva
para carbohidratos.

 Prueba de Benedict
En un tubo de ensayo adicione 1.0 mL de la solución de carbohidrato (ver tabla) con 0.5 mL de
reactivo de Benedict. Mezcle bien y caliente a baño María. La formación de un precipitado
amarillo o rojizo es prueba positiva para azúcares Reductores.

 Ensayo de Barfoed
En un tubo de ensayo mezcle 1.0 mL de la solución de carbohidrato con 0.5 mL del reactivo de
Barfoed. Caliente a baño María hasta ebullición. La formación de un precipitado rojo entre 5-7
minutos es prueba positiva para Monosacáridos reductores. Si el precipitado rojo aparece entre
10-15 minutos, es prueba positiva para Disacáridos reductores.

 Ensayo de Bial.
Mezcle en un tubo de ensayo 1.0 mL de la solución de carbohidrato con 1.0 mL del reactivo de
Bial. Caliente en baño María. La formación de una coloración verdosa es prueba positiva para
Pentosas.

 Prueba de Lugol
En un tubo de ensayo, mezcle 1.0 mL de la solución de carbohidrato con 0.3 mL de Lugol. La
formación de un color azul-violeta es prueba positiva para almidón.

3. Diferenciación cualitativa de los homopolisacáridos: Celulosa y Almidón

 Observe el aspecto físico de la celulosa (o carboxicelulosa) y del almidón. Registre sus
observaciones.

 Determine la solubilidad en agua caliente. Adicione 1.0 mL de celulosa en un tubo de ensayo,

colóquelo en baño de agua hirviendo durante 5 minutos, agítelo y realice observaciones.
Repita el mismo procedimiento utilizando 1.0 mL de almidón. Compare resultados.

 Determine los productos de hidrólisis enzimática de celulosa y almidón con α-amilasa salival.

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 Para ello, ponga en su boca 20 mL de agua potable (de cualquier marca comercial, sin gas) y
manténgala durante 5 minutos moviendo la lengua. Trasvase la solución resultante a un
Beaker y luego filtre a través de una capa de algodón o gasa. Utilice el filtrado como
“extracto enzimático” para la hidrólisis de polisacáridos. En tubos de ensayo, mezcle las
soluciones de polisacáridos según la tabla a continuación:

Tubo
Polisacárido
1 2 3 4
Celulosa 2.0 mL - 2.0 mL -
Almidón - 2.0 mL - 2.0 mL
Extracto enzimático 2.0 mL 2.0 mL - -
Agua - - 2.0 mL 2.0 mL

Deje reaccionar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Teniendo en cuenta las pruebas
de reconocimiento de carbohidratos utilizadas en la práctica, seleccione dos de ellas que le
permitan identificar si los polisacáridos fueron hidrolizados a sus correspondientes
monómeros. Para ello, divida el volumen de cada tubo en dos porciones iguales y realice las
pruebas seleccionadas (utilice los tubos 3 y 4 como blancos de referencia).
 Disposición final de los residuos generados en la práctica. Todos deben ser
depositados en el recipiente indicado para tal fin.

CUESTIONARIO PREVIO AL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

1. Consulte y escriba las reacciones químicas entre glucosa, sacarosa, almidón (amilosa y
amilopectina) y celulosa con los indicadores que empleará para su detección cualitativa
(sección experimental).
2. Responda las siguientes preguntas:
a. ¿Por qué es necesario el citrato de sodio en el reactivo de Benedict?
b. ¿Qué enlaces hidroliza la enzima α-amilasa? Consulte el mecanismo catalítico de α-
amilasa.
c. ¿Qué enlaces hidroliza el ácido clorhídrico cuando se utiliza para hidrolizar el almidón?
3. Escriba las fórmulas estructurales en proyección FISHER y de HAWORTH de los
monosacáridos y disacáridos utilizados en la práctica de laboratorio.

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4. ¿Qué importancia biológica tiene cada uno de los carbohidratos que se utilizarán en la
práctica de laboratorio?

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1) UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ; DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA. Bioquímica: aulas

práticas. 6. ed. Curitiba: Ed. Da UFPR, 2001. 178 p.
2) Nelson, D.L., Cox, M. M. Lehninger Principios de Bioquímica. Ediciones Omega. Capítulo 3
(2006).
Miller, MB. DNA technology in schools: a straightforward approach. Biotechnology education, v.
4, 1993. Págs: 15-21.

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