LBM 1

Judul :HPLCkukenapaya??

SKENARIO : seorang apoteker yang bertanggung jawab terhadap kalibrasi alat

diindustri mendapat laporan bahwa HPLC yang digunakan mengalami masalah yakni
kromatogram tailing ataupun fronting.dia berpikir tentang prinsip kerja HPLC dengan
melihat waktu retensi senyawa yang dipengaruhi oleh kecepatan migrasi senyawa
tersebut dimana sangat bergantung pada distribusinya dalam fase diam dan fase
gerak.disamping itu agar kualitas pemisahan kromatogramnya bagus maka efisiensi dan
resolusi harus optimal.dia memeriksa parameter yang di gunakan pada masing masing
komponen HPLC telah memenuhi syarat atau ada factor factor lain yang mempengaruhi
kualitas pemisahan kromatogram.

STEP 1

1. Tailing dan fronting (cica) :

 Fronting : menujukepuncak,gariskurva yang melengkung
 Tailing :puncak(risky),garisdistribusi yang tidaksejajarataudisebutekor.
 Salah gangguandariHPLC,dimana tailing merepakanpuncak yang berekor
1,2,sedangkan fronting yaitukurva yang melengkungdenganjarak
0,8.(sutri,nasria,edwin)
2. Kromatogram (edwin) : output visual darihasilpemisahan (afif)
Hasildarikromatografiberupaangka (yusrina)

3. HPLC(nasrul) :
salahsatukromatografiuntukzatcairyangdisertaitekanantinggi(arinidancica)
Suatumetodekromatograficairkinerjatinggi yang
digunakandalammetodepemisahan yang
telahditerimadandigunakandalammenganalisasuatubahanobat.(sutri)
4. Efisiensi (sutri) : pemanfaatansesuatudalamsebaikbaiknya.(nasrul)
5. Wakturetensi(arini) : waktu yang
dibutuhkanuntukmencapaihasil.(ridwandannasrul)
6. Resolusi(edwin) : suatu parameter yang
digunakanuntukmenggambarkanhasilkromatogram.
Menunjukkansuatunilaidarihasilkromatogram.hasilpengukuranberdasarkanfisik
nya.(nasria,yusrinadanridwan)
7. Kalibrasi(yusrina) : proses perbaikanalat agar hasilpengukuran valid.(edwin)
Proses penormalanataupemastian.(alfian)
 8. Kromatografi (ridwan) : suatuprosesdimanadalam proses
tersebutterdapatfasediamdanfasegerak.(edwin)
Merupakansuatumetodepemisahan yang terdiridarifasediamdanfasegerak.(cica)

STEP 2

1. Jelaskanprinsipkerjadari HPLC?(cica)
2. Keuntungandankerugian HPLC?(risky)
3. Gangguanpada HPLC selain fronting dan tailing?(edwin)
4. Sebutkan parameter yang baik HPLCuntukmasingmasingkomponen?(afif)
5. Factor yang mempengaruhihasildaripemisahankromatogram?(alvian)
6. Bagaimanapenerapan HPLC dalamanalisissenyawacampuran?(nasria)
7. Bagaimanaaplikasi HPLC dalamkehidupanseharihari?(sutri)
8. Apakegunaandari HPLC?(yusrina)
9. Proses terjadinyagangguan fronting dan tailing?(arini)
10. Bagaimanaprosedurdari HPLC?(ridwan)
11. Sebutkankomponen yang diperlukandalam HPLC?(nasrul)
12. Ssebutkanjenisjenis HPLC?(nasria)
13. Bagaimansolusidarigangguan HPLC tersebut?

STEP 3

1. Jelaskanprinsipkerjadari HPLC?(cica)
Memisahkansuatisenyawaberdasarkankepolarannya yang
dimanaterdapatduafaseyaitufasediamdanfasegerak.(ridwan)
Pemisahanbagiandarisuatusampel yang
kemudiandilakukansuatuanalisiskuantitatifdankualitatif.danperhitungan.(nasrul
)
Fasegerakyaitusampeldaneluen yang bercampur
Fasediamyaitu silica gel yang mengandunghiodrokarbon.(alfian)
Analitdidorongdenganpompadarifasediamsampaipada detector.(edwin)
2. Keuntungandankerugian HPLC?(risky)
 Keuntungan : cepat,teknologicanggih,memilikidayapemisahan yang
tinggisertamampumemisahkanmolekuldarisuatucampura,kolom yang
sudahdigunakandapatdigunakankembali,kecepatrananalisi dank
epekaansangattinggi,dapatdilakukandengansuhukamar
 Kerugian :
mahal,seringtertinggalsisa.digunakanhanyapadaasamorganik.membutuh
kanketelitian yang tinggi,skill yang tinggi,
(nasrul,yusrina,cica,Edwin,afif)
3. Gangguanpada HPLC selain fronting dan tailing?(edwin)
  Gangguan system garisdasar : shift,noise
 Gangguanbentukpuncak :,membelah,berubahbentuk,tailingdan fronting.
(nasria)
4. Sebutkan parameter yang baik HPLC untukmasingmasingkomponen?(afif)
 Jumlah plat teori
 Faktorkapasitas
 Jaraksetara plat teori (JSPT)
 Etensiwaktu
 Kromatogram
 kolom
(riskydannasrul,ridwan)
5. Factor yang mempengaruhihasildaripemisahankromatogram?(alvian)
 Suhu,
 Konsentrasi
 Pelarut yang digunakanharussesuaidengankomponen yang
akandipisahkan
 Kolom yang memadai
 Pengatahuandasartentang HPLC
(nasria,edwin)
6. Bagaimanapenerapan HPLC dalamanalisissenyawacampuran?(nasria)
7. Bagaimanaaplikasi HPLC dalamkehidupanseharihari?(sutri)
 Digunakandalampemisahanvityanglarutdalam air
 Digunakandalamindustrifarmasiuntukmengetahuikadarsuatuobat
 Mengetahuikomponensuatusenyawa.
(arini,yusrina,dannasrul)
8. Apakegunaandari HPLC?(yusrina)
 Untukpemisahansenyawa organic maupunnonorganik
 Analisiskemurniansuatusenyawa
 Untukmemisahkanmolekulberdasarkanperbedaanafinitas
(afifdan risky)
9. BagaimanaProses terjadinyagangguan fronting dan tailing?(arini)

10. Bagaimanaprosedurdari HPLC?(ridwan)

 Siapkansampel
 Masukankedalamkromatografi
 Jalankanpompauntukmendoronganalitdarifasediamke detector
 Hasidiketahui
(edwin)
11. Sebutkankomponen yang diperlukandalam HPLC?(nasrul)
 Injector : tempatmemasukansampel
 Kolom : tempatterjadinya proses pemisahan
  Fasegerakdanfasediam
 Detector
 Pompa
 Pengolahan data
(yusrina,nasria,danridwan)
12. Ssebutkanjenisjenis HPLC?(nasria)
 Adsorbsi : menggunakanfase normal dandiam
 Penukar ion
 Pasangan ion
 Afinitas
 Terikat
 Eksklusiukuran
(arini,cica,sutri)
13. Bagaimansolusidarigangguan HPLC tersebut?
 Menganalisissuatumetode.(nasrul)

STEP 4

Konsep map

STEP 5

LI

1. Bagaimanapenerapan HPLC dalamanalisissenyawacampuran?(nasria)

2. BagaimanaProses terjadinyagangguan fronting dan tailing?(arini)
3. Bagaimansolusidarigangguan HPLC tersebut?

STEP 6

Sarching

STEP 7

1. Bagaimana penerapan HPLC dalam analisis senyawa campuran?(nasria)

Penerapan HPLC Dalam Analisis Senyawa (Obat) Dalam Campuran

HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat,
produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan
farmasi. Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika
HPLC dihubungkan dengan spektometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah
sampel sangat kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh.

1. Parasetamol

 Rumus struktur :

 Nama Kimia : 4- Hidroksiasetanilida

 Rumus Molekul : C8H9NO2
 Berat Molekul : 151,16
 Pemerian : serbuk, putih, tidak berbau, rasa sedikit pahit.
 Kelarutan : larut dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida 1
N, mudah larut dalam etanol. (Depkes RI, 1995).

Parasetamol atau N-asetil-p-aminofenol atau asetaminofen merupakan derivat para-

amino fenol yang berkhasiat sebagai analgesik-antipiretik. Asetaminofen merupakan
pengganti yang baik untuk analgesik dan antipiretik aspirin pada penderita dengan
keluhan saluran cerna dan pada mereka dengan perpanjangan waktu perdarahan yang
tidak menguntungkan. Asetaminofen merupakan analgetik dan antipiretis.

Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang
dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa
ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti
C-18 dan fasa gerak polar seperti methanol/ air. Parasetamol diabsorbsi cepat dan
sempurna melalui saluran cerna. Konsentrasi tertinggi plasma dicapai dalam waktu ½
jam dan masa paruh plasma antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh tubuh. Dalam
plasma, 25% parasetamol terikat protein plasma. Parasetamol digunakan sebagai
analgesic dan antipiretik.

Pengujian kadar parasetamol dalam obat menggunakan teknik HPLC , dalam proses
analisisnya HPLC memiliki beberapa tahapan. Diawali dengan menginjeksikan sampel
uji yaitu larutan obat yang sebelumnya telah disaring dengan membran PTFE ke dalam
kolom HPLC dengan injektor khusus / syringe yang bervolume 20 µL, penyaringan
sebelum penginjeksian ini dilakukan agar tidak terjadi penyumbatan didalam kolom
dan menghilangkan gas dari pelarutnya. Sampel didorong cepat saat melalui kolom
dengan bantuan pompa bertekanan tinggi. Di dalam kolom, komponen- komponen pada
sampel dipisahkan berdasarkan pada perbedaan kekuatan interaksi solut terhadap fasa
diamnya. Solut yang interaksinya kurang kuat akan keluar lebih lambat dari kolom
daripada solut lainnya. Komponen akan keluar dari kolom dengan kecepatan yang
berbeda dan terdeteksi oleh detektor. Detektor yang digunakan adalah detektor UV
karena parasetamol merupakan senyawa organik yang dapat menyerap sinar UV.
Pengujian ini menggunakan panjang gelombang 243 nm dengan mempertimbangkan
panjang gelombang methanol yaitu 205 nm dan air yaitu 190 nm. Teknik yang
dilakukan kali ini merupakan “reverse phase” atau fasa terbalik karena teknik ini
menggunakan pelarut polar sebagai fasa gerak sedangkan fasa diamnya menggunakan
pelarut non- polar. Penggunaan fasa gerak dan fasa diam yang berbeda kepolarannya ini
bertujuan agar sampel uji tidak bereaksi dengan fasa diamnya saat melewati kolom
HPLC. Sampel melewati kolom HPLC tentunya memiliki jangka waktu yang terukur dan
juga menjadi parameter, waktu yang dibutuhkan sampel untuk melewati kolom ini
disebut waktu retensi. Dalam pengujian parasetamol dalam obat, waktu retensi yang
terukur adalah antara 2,19 hingga 2,2. Selanjutnya hasil analisis dengan HPLC ini
menghasilkan suatu citra berupa kromatogram. Kromatogram ini merupakan grafik
antara intensitas komponen yang dibawa oleh fasa gerak terhadap waktu retensi.
Seharusnya tampilan kromatogram ini berupa grafik lurus, lancip, dan simetris. Tetapi
data yang diperoleh pada percobaan ini sedikit melebar dan tidak simetris tentunya. Ini
disebabkan antara lain oleh adanya difusi didalam kolom HPLC, difusi yang terjadi
adalah difusi longitudinal dan difusi transfer massa. Difusi longitudinal itu sendiri
disebabkan oleh penyebaran komponen yang tidak sama sedangkan difusi transfer
massa disebabkan oleh kecepatan komponen yang tidak merata. Terdapat beberapa
parameter pemisahan dalam HPLC, yaitu laju alir eluen yaitu sebesar 0,5 mL/ menit,
ketebalan stasioner kolom C-18 yaitu 15 cm, ukuran partikel analit, dan laju difusi yang
sudah disebutkan diatas. Parameter- parameter ini dapat menyebabkan kejanggalan
dalam pencitraan kromatogram seperti pelebaran pada puncak. Adanya pelebaran
puncak pada kromatogram mengindikasikan terjadinya overlapping analit yang belum
terpisahkan dalam kolom. Semakin tinggi laju difusinya maka komponen dalam sampel
akan semakin sulit dipisahkan secara efisien. Dari grafik luas area terhadap
konsentrasi (ppm) dapat dihitung kadar parasetamol dalam sampel obat. Data yang
diperoleh menunjukkan bahwa dari sampel obat sebanyak 12,5 mg diperoleh kadar
parasetamol sebesar 83,444 % sedangkan dari massa rata-rata tablet obat sebesar
738,2 mg diperoleh massa parasetamol pada tiap tablet obat sebesar 615,9836 mg.
Dapat disimpulkan bahwa kadar parasetamol dalam tablet obat adalah sebesar 615,98
mg per tabletnya.

2. Kafein

Rumus struktur :

 Nama Kimia : 1,3,7-Trimetil xantin

 Rumus Molekul : C8H10N4O2
 Berat Molekul : 194,19
 Pemerian : serbuk putih atau bentuk jarum mengkilat putih,biasanya

menggumpal, tidak berbau, rasa pahit.

 Kelarutan : Agak sukar larut dalam air, dalam etanol, mudah larut dalam

kloroform, sukar larut dalam eter.

Dalam penetapan kandungan kafein digunakan sampel berupa minuman berkafein.

HPLC yang digunakan adalh jenis HPLC Series 200 dengan detector 275 nm Perkin
Elmer, Kolom : Supelcosil LC : 18, ( 25 cm X 4,6mm, 5 μm ). Menggunakan asam asetat
70% dan methanol 30% sebagai fasa gerak. Proses pengerjaan terdiri dari 2 tahap,
yaitu tahap preparasi dan tahap injection ke HPLC.
(Putra,Effendy D. L., 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi.
Jurusan Farmasi Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera
Utara :3)

2. Bagaimana Proses terjadinya gangguan fronting dan tailing?(arini)

3. Bagaimana solusi dari gangguan HPLC tersebut?

 Migrasi dan Retensi Solut

Kecepatan migrasi solut melalui fase diam ditentukan olehperbandingan distribusinya (D), dan besarnya
D ditentukan oleh afinitasrelatif solut pada kedua fase (fase diam dan fase gerak). Dalam
kontekskromatografi, nilai D didefinisikan sebagai perbandingan konsentrasi solutdalam fase diam (Cs)
dan dalam fase gerak (Cm)
D = Cs/Cm
Jadi semakin besar nilai Dmaka migrasi solut semakin lambat, dan semakinkecil nilai D maka migrasi
solut semakin cepat. Solut akan terelusi menurutperbandingan distribusinya. Jika perbedaan
perbandingan distribusi solutcukup besar maka campuran-campuran solut akan mudah dan cepat
dipisahkan

 Puncak Asimetris
Profil konsentrasi solut yang bermigrasi akan simetris jika rasio distribusi solut (D) konstan selama di
kisaran konsentrasi keseluruhan puncak, sebagaimana ditunjukkan oleh isoterm sorpsi yang linier yang
merupakan plot konsentrasi solut dalam fase diam (Cs) terhadap konsentrasi solut dalam fase gerak
(Cm).
 meskipun demikian, kurva isoterm akan berubah menjadi 2 jenis puncak asimetris yakni
membentuk puncak yang berekor (tailing) dan adanya puncak pendahulu (fronting) jika ada perubahan
rasio distribusi solut ke arah yang lebih besar.Baik tailing maupun fronting tidak dikehendaki karena
dapat menyebabkan pemisahan kurang baik dan data retensi kurang terprodusibel.Jika keduanya
terjadi, maka pengurangan jumlah solut yang akan dilakukan kromatografi akan memperbaiki bentuk
puncak akan tetapi adanya desorpsi yang lambat masih dapat menyebabkan tailing. Adanya puncak,
yang asimetri dapat disebabkan oleh hal-hal berikut :
1. Ukuran sampel yang dianalisis terlalu besar. Jika sampel terlalu besar maka fase gerak tidak
mampu membawa solut dengan sempurna karenanya akan terjadi pengekoran atau tailing.
2. Interaksi yang kuat antara solut dengan fase diam dapat menyebabkan solut sukar terelusi
sehingga dapat menyebabkan terbentuknya puncakyang mengekor.
3. Adanya kontaminan dalam sampel yang dapat muncul terlebih dahulu sehingga menimbulkan
puncak mendahului (fronting).Untuk menentukan tingkat asimetri puncak dilakukan dengan
menghitung faktor asimetris atau disebut juga dengan tailing factor (TF) yang dinyatakan dengan rasio
antara lebar setengah tinggi puncak.

 Profil Puncak dan pelebaran Puncak

Selama pemisahan kromatografi, solut individualkan membentuk profil konsentrasi yang simetri
atau dikenal juga dengan profil Gaussian dalam arah aliran fase gerak. Profil, dikenal juga dengan puncak
atau pita, secara perlahan-lahan akan melebar dan sering juga membentuk profil yang asimetrik karena
solut-solut melanjutkan migrasinya ke fase diam. Prinsip yang mendasari alasan-alasan bentuk puncak
dan pelebaran puncak dapat diringkas sebagai berikut :
- Sorpsi dan desorpsi solut yang terus-menerus antara fase diam dan fase gerak, secara inheren akan
menghasilkan profil konsentrasi Gaussian yang akan melebar karena solut bermigrasi lebih lanjut
.- Perjalanan solut melalui partikel fase diam sedikit berbeda, sehingga menyebabkan profil
konsentrasinya melebar secara simetris. Keadaan seperti ini disebut dengan pengaruh lintasan ganda
(multiple-path effect)
- Spesies solut menyebar ke segala arah dengan difusi ketika berada didalam fase gerak. Difusi terjadi
dengan arah yang sama dan berlawanan dengan aliran fase gerak (longitudinal or axial difussion)
karenanya akan berkontribusi terjadinya pelebaran pita secara simetris
.- Sorpsi dan desorpsi, atau transfer massa antara fase diam dan fasegerak, bukanlah suatu proses yang
instan dan terkadang proses tersebut terjadi secara lambat secara kinetika. Karena fase gerak berjalan
secara terus-menerus, maka distribusi kesetimbangan solut yang sebenarnya tidak pernah terjadi. Profil
konsentrasi dalam fase diam tertinggal sedikit dibanding profil konsentrasi dalam fase gerak yang akan
mengakibatkan adanya pelebaran puncak lebih lanjut. Desorpsi yang lambat dapat juga menghasilkan
puncak yang asimetris atau condong
.- Adanya variasi rasio distribusi solut dengan total konsentrasinya jugaberperan terjadinya puncak yang
asimetris atau condong.

(Gandjar, I.G dan Rohman A. 2009.Kimia Farmasi Analisis.Yogyakarta : Pustaka Pelajar )

4. Jelaskan prinsip kerja dari HPLC?(cica)

HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari
kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah
grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini
 membuatnya lebih cepat. Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut : dengan
bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan
dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam
kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan
kekuatan interaksi antara solute-solut terhadap fasa diam.
Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari
kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa
diam maka solute-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detector
kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Seperti pada
kromatografi gas, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam
campuran. Computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan
mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.

(Day, R.A dan Underwood, A.L., 1999, Analisis Kimia Kuantitatif Edisi
Keenam, Erlangga, Jakarta.)

prinsip kerja dari HPLC adalah pemisahan absoprsi dan desorpsi yang
berulang kali dari komponen yang dipisahkan. Pada saat komponen tersebut
dibawa oleh fase gerak mengalir sepanjang kolom. Pemisahan ini terjadi karena
adanya perbedaan kecepatan migrasi dari masing-masing komponen yang
didasarkan oleh adanya perbedaan koofisien distribusi dari komponen tersebut
antara kedua fasa.

(Tim Kimia Analitik Instrumen. (2010).Penuntun Praktikum Kimia

Analitik Instrumen (KI-431).Bandung : Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI)

5. Keuntungan dan kerugian HPLC?(risky)

 Kelebihan KCKT antara lain:

 Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

 Resolusinya baik
 Mudah melaksanakannya
 Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi
 Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis
 Dapat digunakan bermacam-macam detektor
 Kolom dapat digunakan kembali
 Mudah melakukan rekoveri cuplikan
 Tekniknya tidak begitu tergantung pada keahlian operator danreprodusibilitasnya lebih baik
 Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif
 Waktu analisis umumnya singkat
 Kromatografi cair preparatif memungkinkan dalam skala besar
 Ideal untuk molekul besar dan ion

(Putra, Effendy De Lux. (2004).Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang

Farmasi. Sumatera Utara : Jurusan Farmasi FMIPA USU.)
  Kelebihan Dan Kekurangan Metode Analisis Dengan HPLC

 Kelebihan
 Kerja lebih mudah dengan automatisasi dalam prosedur analisis dan pengolahan
data
 Volume sampel kecil
 Daya pisah tinggi
 Merupakan metode analitis:

- Cepat

- Peka

- Akurat

- Tepat

- Reproducible

- JugaPreparatif

 Dapat digunakan untuk analisis sampel organic dan anorganik, bersifat volatile
dan non-volatil, stabil dan tidak stabil secara thermal.
 Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas

 Dapat dilakukan pada suhu kamar.

 Kolom dan pelarut pengembang dapat digunakan berkali-kali
 Detector HPLC dapat divariasi dan banyak jenisnya
 Waktu analisis pada umumnya singkat
 Ketepatan dan ketelitiannya yang relatif tinggi
 Mudah dioperasikan secara otomatis

 Kekurangan
 Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu
 Hanya bisa digunakan untuk asam organic
 Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient
elusi
 Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang
terbatas

(Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

Airlangga University Press. Surabaya.)

6. Gangguan pada HPLC selain fronting dan tailing?(edwin)

Gangguan yang terjadi dibedakan menjadi dua yaitu :

 . Gangguan sistem garis dasar (baseline) yang mungkin timbul antara lain :

 noise (derau),
 drift (melayang),
 spiking (berpaku),
 wander (menyimpang) dan
 shift (bergeser)

 gangguan bentuk puncak (peak shape) yang mungkin timbul yaitu :

 Puncak lebih kecil dari yang diharapkan,

 Tailing (puncak)

 Fronting (puncak mengandung),

 Puncak berubah bentuk (cigar top, round top, flat top),

 Puncak membelah (split),

 Puncak negatif.

(Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

Airlangga University Press. Surabaya.)
 7. Sebutkan parameter yang baik HPLCuntuk masing masing komponen?(afif)

Komponen-komponen atau instrumentasi dari HPLC ialah sebagai berikut :

1. Fasa gerak
.Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhibeberapa persyaratan
berikut :
1).Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akandianalisis.
2).Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yangdapat mengganggu
interpretasi kromatogram.
3).Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbata pada kolom.Biasanya
pelarut disaring dengan saringan nilon berukuran diameter 0,45µm. Pompa vakum
biasanya digunakan untuk menyaring partikel kotoransekaligus menghilangkan gas dari
pelarut karena gas dapat mengganggubase line.
4).Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun.
5).Zat cair tidak kental. Umumnya keketalan tidak melebihi 0,5 cP (centiPoise).
6).Sesuai dengan detektor.

2. Pompa

Pompa dalam HPLC berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair malalui kolom yang berisi serbuk halus.
Pompa yang dapat digunakan dalam HPLCharus memenuhi persyaratan :
1.Menghasilkan tekanan sampai 600psi.
2.Keluaran bebas pulsa
3.Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit.
4.Bahan tahan korosi.

3. Pemasukan cuplikan
Kebanyakan pemasukan cuplikan ke dalam kolom dapat menyebabkan band
broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukan harus sekecil mungkin, beberapa puluh
miroliter. Teknik pemasukan cuplikan kedalam sistem HPLC melalui injeksi srynge,
injeksi “stop -flow”, dan kran cuplikan.

4. Kolom
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada jugayang terbuat dari gelas
berdinding tebal. Kolom utma berisi fasa diam, tepat terjadinya pemisahan campuran
menjadi komponen-komponennya. Bergantung keperluannya kolom utama dapat
digunkan untuk analisis atau preparatif. Untuk keperluan preparatif, setiap komponen
yang keluar kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC
dihubungkan dengan fraction colector.

5. Detektor
Berbagai detektor untuk HPLC telah tersedia, walaupun demikiandetektor harus
memenuhi persyaratan berikut :
1.Cukup sensitif
2.Stabilitas dan ketrulangan tinggi
 3.Respon linear terhadap solut
4.Waktu respon pendek sehingga tidak bergantung alir
5.Reliabilitas tinggi dan mudah digunakan
6.Tidak merusak cuplikan.

6. Rekorder

Untuk mencetak hasil percobaan pada lembaran kertas berupa kumpulanpuncak

(kromatogram).Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai
puncak-puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram.

(Hendayana, Sumar. (2006).KIMIA PEMISAHAN Metode Kromatografi

dan Elektroforensis Modern.Bandung : PT. Remaja Rosdakarya.)

8. Factor yang mempengaruhi hasil dari pemisahan kromatogram?(alvian)

Hasil pemisahan diantaranya di pengruhi oleh pemilihan terhadap kedua
fase yang digunakan. Fase diam harus berukuran partikel seragam, bersifat inert
terhadap zat uji dan cukup aktif sehingga memungkinkan perambatan zat uji.
Adanya zat pengotor dapat menyebabkan adsorpsi tidak revisibel atau tailing
pada senyawa yang akan dipisahkan. Pemisahan yang lebih baik akan diperoleh
dengan mengolah terlebih dahulu adsorben yang satu senyawa yang dapat
 teradsorpsi kuat. Dalam pemilihan adsorben dan fase gerak, sebagai dasar dapat
digunakan adsorben yang polaritasnya sama dengan zat uji sedangkan fase
gerak polaritasnya berlawanan .

(Hendayana, Sumar. (2006).KIMIA PEMISAHAN Metode Kromatografi

dan Elektroforensis Modern.Bandung : PT. Remaja Rosdakarya.)

9. Bagaimana aplikasi HPLC dalam kehidupan sehari hari?(sutri)

Beberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan :

1) HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan
pestisida.

2) Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat
dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.

3) Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang

dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.

4) Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.

5) Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.

6) Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah

biokimia.

(Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Airlangga University
Press. Surabaya.)

HPLC juga cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak

atsiri terdiri atas campuran yang sangat rumit dan oleh karena itu HPLC berguna
untuk memisahkan campuran rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau
memisahkan golongan senyawa menjadi komponen-komponennya.
HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak, misalnya terpenoid
tinggi, segala senyawa jenis fenol, alkaloid, lipid dan gula. HPLC baik digunakan
untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spekrum UV atau spectrum sinar
tampak.
Kolom yang tersedia mempunyai banyak sekali pelat teori (lebih dari 100.000
untuk kolom 100 cm), dan kromatografi dilakukan dalam kondisi mendekati
kondisi ideal demikian rupa sehingga dapat diperoleh dalam beberapa menit dan
 ditafsirkan secara kuantitatif dengan ketepatan yang lumayan. Cuplikan dapat
dipisahkan secara preparative.

(Tim Kimia Analitik Instrumen. (2010).Penuntun Praktikum Kimia

Analitik Instrumen (KI-431).Bandung : Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI)

10. Apa kegunaan dari HPLC?(yusrina)

 Kegunaan umum HPLC adalah

 untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun
senyawa biologis ;
 analisis ketidakmurnian (impurities);
 analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile);
 penentuan molekul- molekul netral, ionic, maupun zwitter ion;
isolasi dan pemurnian senyawa;
 pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama;
 pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah sekelumit (trace
elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses
industry.

(Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Airlangga University
Press. Surabaya.)

11. Bagaimana prosedur dari HPLC?(ridwan)

PROSEDUR HPLC DALAM ANALISIS CAMPURAN ANALGESIK

Reagen/Pereaksi

 Asetonitril HPLC grade

 Air deionisasi
 Asam perklorat 69-72%
 Saline yang digunakan untuk mengencerkan larutan NaCl 0,9%

Fase gerak dibuat dengan mencampurkan 150 mikro liter asam perklorat ke dalam 67
ml air deionisasi dan kemudian ditambahkan secara perlahan-lahan 33 ml asetonitril.
Fase gerak tersebut dibebas gaskan sebelum digunakan, dan fase gerak ini akan stabil
dalam waktu 3-4 hari.

Baku Pembanding
Baku pembanding fentanil, bupivakain, klonidin, hidromorfin, morfin dan midazolam
yang diperoleh dari perusahaan farmasi. Kemurnian bahan pembanding tersebut
dianalisis dengan menggunakan dengan spektrofotometri UV dan menghitung
kadarnya.
Peralatan
Seperangkat HPLC dengan spesifikasi:

 Pompa isokratik HP 1050 yang mampu mempertahankan laju alir 1 ml/menit

 Autosampler Perkin-Elmer ISS-100 Intellige Sampling System (Perkin-Elmer
Corporation, Analytica Instruments, Norwalk, CT)

 The automatic sampler held 2- mL vials fitted with 250-1JL glass inserts
 Detektor UV
 Integrator HP3393A
 Kolom Beckman Ultrasphere ODS HPLC ( 5 IJm, 4.6 mm x 25cm, Beckman
Coulter, Inc. Fullerton, CA)

Panjang gelombang dipantau agar selalu pada kisaran 206-280 nm tergantung pada
senyawa obat yang sedang dianalisis. Dengan kondisi pengujian tersebut, maka akan
diperoleh data sebagai berikut:

Tabel I. Parameter HPLC

Nama Obat Waktu Retensi Panjang Gelombang (nm) Rentang Linieritas (mg/ml)
Morfin 3,0 280 0.02-20
Hidromorfin 3,2 280 0,02-20
Klonidin 4,5 280 0,01-1,0
Midazolam 5,5 280 0,10-2,0
Bupivakain 13,0 206 0,50-1,5
Fentanil 17,0 206 0,002-0,05
Spesimen Pengujian
Semua larutan yang diuji adalah sediaan farmasi. Sediaan parenteral yang sering
ditemui adalah larutan morfin sulfat, hidromorfin HCl dan midazolam HCl tunggal
ataupun dalam campuran dengan bupivakain atau fentanil atau campuran fentanil-
bupivakain.

Kromatogram Hidromorfin
 Kromatogram Fentanil
(A Rapid HPLC Procedure for Analysis of Analgesic Pharmaceutical Mixtures for
Quality Assurance and Drugs Diversion Testing)

12. Sebutkan komponen yang diperlukan dalam HPLC?(nasrul)

Komponen-komponen atau instrumentasi dari HPLC ialah sebagai berikut :

1. Fasa gerak
Berupa zat cair yang disebut eluen (pelarut) dalam HPLC, fasa gerak selain
bertugas membawa komponen-komponen campuran menuju detektor, juga dapat
berinteraksi dengan solut-solut.Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus
memenuhibeberapa persyaratan berikut :
1).Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akandianalisis.
2).Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yangdapat mengganggu
interpretasi kromatogram.
3).Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbata pada kolom.Biasanya
pelarut disaring dengan saringan nilon berukuran diameter 0,45µm. Pompa vakum
biasanya digunakan untuk menyaring partikel kotoransekaligus menghilangkan gas dari
pelarut karena gas dapat mengganggubase line.
4).Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun.
5).Zat cair tidak kental. Umumnya keketalan tidak melebihi 0,5 cP (centiPoise).
6).Sesuai dengan detektor.
Pemilihan zat cair sebagai fasa gerak ini merupakan hal yang kritis dalam keberhasilan
pemisahan. Seyangnya, teori interaksi fasa gerak dengansejumlah solut kurang jelas sehingga
para pakar hanya dapat memilihsekelompok pelarut. Jadi, pada akhirnya, pemilihan fasa
gerak didasarkan ataseksperimen trial-and error dengan berbagai jenis dan krom posisi
pelarut hinggadiperoleh kromatogram yang diharapkan. Dengan kata lain, fasa gerak
yang baik
memberikan faktor kapasitas k‟ pada rentang yang seesuai. Untuk cuplikandengan 2-3
komponen, sebaliknya dicari fasa gerak yang memberikan k‟ antara2-5. Sedangkan
untuk campuran multikomponen, waktu cukup untuk pemisahan semua komponen.
Biasanya beberapa pelarut atau kombinasi pelarut dapatditemukan untuk memberikan
faktor kapasitas yang cocok. Pemilihan pelarut- pelarut juga bergantung pada faktor
selektifitas (α) untuk komponen cuplikan. Gelembung udara (degassing) yang ada harus
dihilangkan dari pelarut,karena udara yang terlarut keluar melewati detektor dapat
menghasilkan banyak noise sehingga data tidak dapat digunakan.Tabel 1. Properties of HPLC mobile
phase

2. Pompa

Pompa dalam HPLC berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair malaluikolom yang berisi serbuk
halus. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLCharus memenuhi persyaratan :
1.Menghasilkan tekanan sampai 600psi.
2.Keluaran bebas pulsa
3.Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit.
4.Bahan tahan korosi.

3. Pemasukan cuplikan
Kebanyakan pemasukan cuplikan ke dalam kolom dapat menyebabkan band
broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukan harus sekecil mungkin, beberapa puluh
miroliter. Teknik pemasukan cuplikan kedalam sistem HPLC melalui injeksi srynge,
injeksi “stop -flow”, dan kran cuplikan.

4. Kolom
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada jugayang terbuat dari gelas
berdinding tebal. Kolom utma berisi fasa diam, tepat terjadinya pemisahan campuran
menjadi komponen-komponennya. Bergantung keperluannya kolom utama dapat
digunkan untuk analisis atau preparatif. Untuk keperluan preparatif, setiap komponen
yang keluar kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC
dihubungkan dengan fraction colector.

Selain kolom utama dikenal pula kolom pengaman (guard kolom).Kolom utama berisi
fasa diam dan jenisnya bervariasi bergantungkeperluan, misalnya dikenal kolom C-18, C-8,
cyanopropyl, penularan ion.Kolom jenis C-18 dan C-8 paling banyak dipakai dalam HPLC. Fasa diam
jenisterikat ini dapat dibuat dengan mereaksikan silika dengan alkilklorosilana
yangdikenal dengan reaksi silanisasi.

Fasa Diam
Dalam kromatografi cair-cair, fasa diam adalah cairan film yang dilapiskan
padamaterial kemasan yang terdiri dari partikel silica berpori 3-10 . fasa diam mungkin
sebagian akan larut dalam fasa gerak. Untuk mencegah hilangnya fasadiam ini, maka fasa diam diikat
secara kovalen pada partikel silica. Ikatan fasadiam diperoleh dengan mereaksikan partikel
silica dengan organochlorosilanedengan bentukumu Si (CH3)2 RCl dimana R adalah alkil atau
alkil yang tersubstitusi.
Untuk mencegah interaksi antara zat terlarut dengan gugus – SiOH,
silicasering direaksikan dengan Si(CH3)3Cl. Sifat dari fasa diam ditentukan oleh sifat
organosilane‟s gugus alkil. Jika R adalah gugus fungsional polar, maka fasadiam akan polar.
Contoh fasa diam polar, dimana R terdiri dari cyano (-C2H4CN), diol (-
C3H6OCH2CHOHCH2OH), atau amino (-C3H6NH2). Karenafasa diam polar, fasa bergerak
adalah nonpolar atau pelarut yang cukup polar.Kombinasi dari fasa diam polar dan fasa gerak
non polar disebut kromatografifasa normal. Dalam kromatografi fasa terbalik, sering
ditemui dalam HPLC, fasadiam non-polar dan fasa gerak polar. Fasa diam non-polar
paling umummenggunakan organochlorosilane dengan R adalah n-octyl (C8) atau n-octyldecyl
(C18) rantai hidrokarbon.
Kolom pengaman disebut juga pra-kolom karena diletakkan sebelumsisem
pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek, 5 cm dengan diameter4,6 mm dan biasanya
dipaking dengan partikel silika berukuran lebih besar dariukuran partikel kolom utama.
Kolom pengaman mempunyai dua fungsi yaituuntuk menyaring kotoran yang terbawa
dalamfasa diam dan untuk menjenuhkanfasa diam dalam rangka menghindarkan
terjadinya erosi fasa diam oleh aliranpelarut. Dengan demikian, kerusakan kolom utama
yang mahal dapatdihindarkan.

5. Detektor
Berbagai detektor untuk HPLC telah tersedia, walaupun demikiandetektor
harus memenuhi persyaratan berikut :
1.Cukup sensitif
2.Stabilitas dan ketrulangan tinggi
3.Respon linear terhadap solut
4.Waktu respon pendek sehingga tidak bergantung alir
5.Reliabilitas tinggi dan mudah digunakan
6.Tidak merusak cuplikan.

6. Rekorder

Untuk mencetak hasil percobaan pada lembaran kertas berupa

kumpulanpuncak (kromatogram).Komponen yang terelusi mengalir ke
 detektor dan dicatat sebagai puncak-puncak yang secara keseluruhan disebut
sebagai kromatogram.

(Hendayana, Sumar. (2006).KIMIA PEMISAHAN Metode Kromatografi

dan Elektroforensis Modern.Bandung : PT. Remaja Rosdakarya.)

13. Ssebutkan jenis jenis HPLC?(nasria)

1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom
dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan
fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian
sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan
alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol
pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara
kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.3)

2. Kromatografi fase terikat

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi
atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah
hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau
dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau
C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan
larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH
sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami
ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan
ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk
spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi
lebih cepat.3)

3. Kromatografi penukar ion

KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion
dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun
demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air
karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-
alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air,
retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH
fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini
disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak
untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel
ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion.
Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.2)

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan
untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus
sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase
diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih
dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul
yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati
porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam
pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase
diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat
spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap
sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada
sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari
campuran yang sangat kompleks.2

2.( Meyer, F.R., 2004, Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4th Ed.,
John Wiley & Sons, New York.)
3. (Kealey, D and Haines, P.J., 2002, Instant Notes: Analytical Chemistry, BIOS
Scientific Publishers Limited, New York.)