Materiales:

 Botella plástica o de vidrio de boca ancha (pueden ser frascos de mayonesa o salsas grandes). El
material tiene que ser completamente transparente para visualizar todos los fenómenos.
 Lodo negro (provenientes de una Planta de Tratamiento de Aguas Residuales).
 Agua de charca, estancada de varios días o de lago.
 Papel periódico picado, materia orgánica, hojas secas de árboles.
 Plástico de Vinipel o bolsa plástica transparente.
 Puntilla de hierro o hierro rallado.
Procedimiento:
 En un frasco de vidrio transparente se colocó en su fondo una mezcla de lodo recolectada de la PTAR sur
occidente del Municipio de Cajibío, junto con las hojas secas, material orgánico y el papel periódico
picado, compactando el lodo evitando que se hicieran burbujas se mezcló homogéneamente y
posteriormente se agregó una puntilla de hierro, dejando una capa compacta de lodo de 10 cm de
espesor.
REGISTRO DE RESULTADOS DE LA COLUMNA WINOGRADSKY EN UN PERIODO DE 5 SEMANAS
(31 DE MARZO AL 27 DE ABRIL DE 2019)

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Respuesta a preguntas orientadoras de la práctica
 Por qué se forman manchas negras en el lodo?
 La aspersión de manchas negras en el lodo indica la presencia de bacterias anaeróbicas y fermentación
de tipo gran positivo y probablemente la presencia de Clostridium (bacterias anaeróbicas). Se trata de
estructuras biológicas genéticamente iguales a su antecesor vegetativo, metabólicamente inactivos y
altamente resistentes a condiciones medioambientales adversas (Temperatura, humedad, radiaciones
UV, agentes químicos).
 ¿Por qué la parte superior de la columna es verde?
 Esta coloración indica la presencia de micro algas, siendo una zona anaeróbica superior donde
predominan las bacterias fotosintéticas anaeróbicas lo cual genera una banda de color verde.
 ¿Cuál es la fase anaeróbica de la columna
 E la zona más profunda, correspondiente a la que se toma la coloración oscura, en donde aparecen
microrganismos capaces de realizar respiración anaeróbica y fermentación
 ¿Cuál es la fase aeróbica de la columna
 Es la parte superior (zona expuesta), cianobacterias mantienen aerobia esta zona, aparecen algas.
 ¿Cuál es la fase microaerofílica de la columna?
 Corresponde a la transición de la fase media a la fase superior de la mezcla, en ella se encuentra
bacterias oxidadoras de azufre aerobias (Beggiatoa, Thiobacillus, Thiothrix)
 ¿A qué se debe el olor a “huevo podrido” en dichos sistemas?
 Se debe a la presencia de bacterias verdes del azufre como Chorobium, bacterias reductoras de sulfato
(Desulfovibrio), bacterias fermentadoras de celulosa (Clostridium), bacterias metanogeneticas y
Quimiolitotrofos del azufre. utilizan el CO2 como fuente principal de carbono, pero a diferencia de
ellos, no utilizan la luz como fuente de energía sino que la obtienen por oxidación de compuestos
inorgánicos reducidos.
 ¿Qué aplicabilidad tiene el experimento o que le permite entender dentro del ejercicio de la
ingeniería ambiental?
 La aplicabilidad que deja el experimento se basa en de una planta de tratamiento de aguas residuales
donde se pueden identificar las diferentes fases y vida de los microorganismos descomponedores de la
materia, por lo tanto el ejercicio da conocimientos, para implementaros en la vida profesional
destacando las diversas acciones que se emplean dentro del ámbito de una planta de tratamiento de
aguas residuales, además es un excelente practica para comprobar como se establece un ecosistema
microbiano.
Qué es una bacteria Gram positiva?

Las bacterias son organismos procariotas unicelulares muy pequeños. Su tamaño suele estar por debajo de los 5 μm, aunque hay
excepciones como Thiomargarita namibiensis, que con sus 750 μm es la bacteria más grande conocida. A diferencia de las células
eucariotas (hongos, animales, plantas), las bacterias no presentan núcleo ni ningún otro oganelo celular con membrana, pero
presentan pared celular. En función de la estructura de la pared celular, las bacterias se pueden clasificar en dos grandes grupos: las
bacterias Gram positivas (o grampositivas) y las bacterias Gram negativas (o gramnegativas). La tinción de Gram es una técnica de
tinción para observación al microscopio desarrollada por Hans Christian Gram en 1884. Las bacterias Gram negativas se tiñen de fucsia
o rosa y las bacterias Gram positivas se observan de color morado o azul. Es muy importante entender que la clasificación en bacterias
grampositivas y gramnegativas es una clasificación en función de la respuesta de las bacterias a una técnica de tinción con unos
determinados colorantes y que no se corresponde con grupos taxonómicos ni relaciones filogenéticas entre especies bacterianas. A
continuación veremos como es la estructura de la pared celular de las bacterias Gram positivas y posteriormente repasaremos en que
consiste la tinción de Gram y el por qué unas bacterias dan positivo y quedan teñidas de azul-morado y otras dan negativo y quedan
teñidas de rosa – fucsia.

Pared celular de bacterias Gram positivas

La diferencia más importante entre bacterias Gram positivas y Gram negativas es la composición y estructura de la pared celular. En
ambas, la pared celular consta de la membrana citoplasmática o membrana celular que rodea al espacio interno de la célula. Luego
hay una capa de peptidoglicano, y entra la membrana y el peptidoglucano un pequeño espacio llamado espacio periplasmático o
periplasma. En las bacterias gram positivas, la capa de peptidoglucano es gruesa, mientras que en las bacterias gram negativas la
capa de peptidoglicano es mucho más fina y está rodeada de otra membrana más, la membrana externa. Dicho de otro modo, las
bacterias gram positivas no tienen membrana externa y cuentan con una capa de peptidoglicano mucho más gruesa que las bacterias
ram negativas.

Esquema básico de la estructura de la pared celular en gram positivas y en gram negativas

Membrana citoplasmática
La membrana citoplasmática es una membrana lipídica que rodea al contenido o citoplasma celular. La estructura a grandes rasgos
es similar a la estructura de la membrana citoplasmática de eucariotas: una bicapa lipídica con otras moléculas intercaladas con
funciones concretas, sobre todo proteínas y otros lípidos de membrana.

Pared celular de bacterias Gram positivas

La diferencia más importante entre bacterias Gram positivas y Gram negativas es la composición y estructura de la pared celular. En
ambas, la pared celular consta de la membrana citoplasmática o membrana celular que rodea al espacio interno de la célula. Luego
hay una capa de peptidoglicano, y entra la membrana y el peptidoglucano un pequeño espacio llamado espacio periplasmático o
periplasma. En las bacterias gram positivas, la capa de peptidoglucano es gruesa, mientras que en las bacterias gram negativas la
capa de peptidoglicano es mucho más fina y está rodeada de otra membrana más, la membrana externa. Dicho de otro modo, las
bacterias gram positivas no tienen membrana externa y cuentan con una capa de peptidoglicano mucho más gruesa que las bacterias
ram negativas. La membrana citoplasmática está presente tanto en gram negativas como en gram positivas sin mucha diferencia entre
ellas.

Periplasma
Rodeando a la membrana citoplasmática se encuentra una gruesa capa de peptidoglicano, pero entre ambas hay un pequeño espacio
conocido como periplasma o espacio periplasmático. El espacio periplasmático de las bacterias Gram positivas es mucho más
pequeño que el de Gram negativas. De hecho, es tan pequeño que se ha pensado durante mucho que no tenían, pero a través de
observaciones con criomicroscopía electrónica se pudo comprobar que, aunque muy pequeño, las bacterias grampositivas sí que tienen
espacio periplasmático.

Capa de peptidoglicano
El peptidoglicano, o mureína, es una sustancia polimérica compuesta por cadenas de glúcidos y aminoácidos. La capa de
peptidoglicano se ancla a la membrana citoplasmática, dejando entre ellas el espacio periplasmático. La capa de peptidoglicano tiene
una función estructural muy importante. Mantiene la forma de la célula, le aporta resistencia y contrarresta la presión osmótica del
citoplasma evitando que la célula reviente. El peptidoglicano también interviene en la fisión binaria durante las fases de división y
multiplicación bacteriana. La capa de peptidoglicano está presente en grampositivas y en gramnegativas, pero en las grampositivas es
mucho más gruesa y es la capa más externa de la pared celular. En las gramnegativas la capa de peptidoglicano es mucho más delgada y
está rodeada por una segunda membrana lipídica, la membrana externa. En la capa de peptidoglicano de las Gram positivas se puede
encontrar ácidos teicoicos y ácidos lipoteicoicos, sustancias que no están presentes en las Gram negativas. La parte lipídica de las
moléculas de ácido lipoteicoico sirve de anclaje del peptidoglicano en la membrana celular. Como no tienen membrana externa, las
bacterias grampositivas no presentan lípido A ni antígeno O, característicos de la membrana externa de gramnegativas.

También, como las grampositivas solo tienen una membrana, los flagelos (en las bacterias que tengan) se unen a la célula mediante un
sistema de dos anillos, en comparación con los cuatros anillos que aparecen en los flagelos de las gramnegativas, dos por cada
membrana. En algunas bacterias hay una capa más sobre el peptidoglicano que se conoce como capa S. La capa S está formada por
una estructura cristalina de proteínas y glicoproteínas. También puede aparecer en gramnegativas, en este caso apoyada en la
membrana externa y no en la capa de peptidoglicano.

En resumen, las bacterias Gram positivas tendrían una pared celular con esta estructura, de dentro hacia fuera:

1. Membrana citoplasmática
2. Periplasma (muy delgado)
3. Peptidoglicano (muy gruesa, con ácidos teicoicos y lipoteicoicos)
4. Capa S (en algunas bacterias)

Mientras que las Gram negativas tendrían esta estructura:

1. Membrana interna
2. Periplasma
3. Peptidoglicano (muy delgado, sin ácidos teicoicos)
4. Periplasma
5. Membrana externa (lípido A, antígeno O)
6. Capa S (en algunas bacterias)

Comparación de la pared celular de bacterias Gram positivas y Gram negativas

¿Qué es la tinción de Gram y por qué las Gram positivas se tiñen de azul – violeta?
La tinción de Gram es una técnica de coloración de las células bacterianas para aumentar su contraste y que se puedan visualizar al
microscopio óptico. De forma esquemática, consiste en estos pasos:

1. Se aplica una solución de cristal violeta que tiñe a todas las bacterias, tanto Gram positivas como Gram negativas.
2. Se aplica una mezcla de yodo y lugol para fijar el cristal violeta.
3. Se aplica una mezcla de alcohol y acetona para disolver el cristal violeta no fijado. El cristal violeta se elimina de las bacterias
en las que el colorante no se haya fijado.
4. Las bacterias en las que el cristal violeta permanece sin disolver se ven azules o moradas y se llaman Gram positivas. Han
fijado el colorante cristal violeta.
5. Para que las otras bacterias en las que el cristal violeta se ha disuelto también se puedan ver al microscopio se aplica otro
colorante, la safranina o fucsina. Estas otras bacterias se verán rosas y se llaman Gram negativas. No han fijado el cristal
violeta.

El mecanismo por el que las bacterias Gram positivas retienen el cristal violeta es que el colorante queda fijado al peptidoglicano,
mucho más abundante en estas bacterias. De todas formas, hay que tener muy claro que la tinción de Gram puede dar falsos positivos y
falsos negativos con cierta facilidad; por ejemplo, si se aplica más disolvente de la cuenta o durante un tiempo demasiado largo, todas
las bacterias perderían el cristal violeta. Además, hay bacterias cuya respuesta a la tinción de Gram no se corresponde con la
estructura real de su pared celular. Por ejemplo, existen bacterias Gram positivas con capas de peptidoglicano más delgadas de lo
habitual y dan negativo en la tinción de Gram. Incluso existen bacterias, aunque excepcionales, que no tienen pared celular, no tienen
peptidoglicano y también dan negativo en la tinción de Gram. Por ejemplo, los micoplasmas. Por este y otros motivos, la tinción de
Gram sigue siendo muy utilizada como método de aproximación diferencial, por ejemplo en identificación de patógenos, pero no se
considera una clasificación taxonómicamente relevante ni se corresponde con grupos evolutivos de las bacterias. Como términos más
exactos para aludir a la estructura de la pared celular bacteriana se pueden utilizar monoderma y diderma, según la bacteria tenga una
o dos membranas lipídicas. Estos términos fueron propuestos por Radhey S. Gupta en el año 2000.

Patogenia
Entre las bacterias Gram positivas hay géneros que son patógenos típicos y habituales para el ser humano. Entre ellos:

 Cocos (forma redondeada): Streptococcus, Staphylococcus.

 Bacilos (forma de alargada, como de barra): Corynebacterium, Listeria, Bacillus, Clostridium.

¿Qué es una bacteria Gram negativa?

En microbiología, las bacterias se pueden clasificar en dos grandes grupos según la estructura de la pared celular: las bacterias Gram
positivas y las bacterias Gram negativas. Las diferencias en la pared celular entre ambos tipos generan una respuesta diferente al
someterse a la conocida como tinción de Gram. Las bacterias Gram negativas aparecen teñidas de rosa – fucsia y las bacterias Gram
positivas de azul – morado. Pero como veremos, la tinción de Gram no es un método del todo fiable para la clasificación bacteriana.

Estructura de la pared celular de bacterias Gram negativas

La característica clave que diferencia una bacteria Gram negativa de una bacteria Gram positiva es la composición y estructura de la
pared celular. La pared celular de las bacterias Gram negativas está formada por dos membranas lipídicas, una interna
(citoplasmática) y otra externa, con un espacio entre ellas denominado espacio periplasmático en el que se dispone una capa de
una sustancia llamada peptidoglicano. Las Gram positivas no cuentan con membrana externa y la capa de peptidoglicano es
generalmente mucho más gruesa.

Membrana citoplasmática
La membrana citoplasmática, o membrana celular, es la membrana que rodea el medio interno de la célula bacteriana (citoplasma).
Es similar a cualquier otra membrana celular existente en la naturaleza y consiste en una bicapa lipídica con diversas proteínas y lípidos
que ejercen funciones específicas.

Espacio periplasmático y capa de peptidoglicano

El espacio entre la membrana citoplasmática y la membrana externa se denomina espacio periplasmático. En este espacio se encuentra
una sustancia característica de las bacterias, tanto Gram positivas como Gram negativas, llamada peptidoglicano (o mureína). En el
espacio periplasmático también se pueden encontrar enzimasimportantes para la nutrición de la bacteria. El peptidoglicano es
un polímero de glúcidos y aminoácidos que forma una capa con un papel estructural muy importante en la pared celular de la bacteria
al dar fuerza y contrarrestar la presión osmótica del citoplasma. También participa en la fisión binaria durante la reproducción
bacteriana. En general, la capa de peptidoglicano es más delgada en bacterias Gram negativas que en Gram positivas.
Membrana externa
La membrana externa de las bacterias Gram negativas es una bicapa lipídica de estructura similar a la membrana citoplasmática. En esta
membrana se pueden encontrar diversas proteínas; una de las más características son las porinas, unas proteínas que forman canales
por los que pueden pasar determinadas sustancias y que no se encuentran en la membrana citoplasmática. Otra estructura
característica de la membrana externa son los lipopolisacáridos. En cada lipopolisacárido bacteriano se pueden diferenciar tres
regiones: el lípido A anclado en la parte externa de la membrana (actúa como endotoxina), una estructura polisacaroídica
central conocida como núcleo o core y el polisacárido O, más conocido como antígeno O. Algunas bacterias Gram negativas
presentan una capa S (estructura cristalina de proteínas y glicoproteínas) apoyada sobre la membrana externa (en las Gram positivas, si
aparece, se sitúa sobre la membrana citoplasmática). Otra diferencia es que si las bacterias Gram negativas presentan flagelos, estos
tienen cuatro anillos de apoyo, dos por cada membrana, en lugar de dos como las Gram positivas.

La tinción de Gram
La tinción de Gram fue desarrollada por Hans Christian Gram en 1884 y consiste es una mezcla de sustancias coloreadas que se aplica
sobre una muestra bacteriana. Primero se aplica una solución de cristal violeta, un colorante que tiñe todas las células bacterianas,
tanto Gram negativas como Gram positivas, y da una coloración azul – morada a las bacterias. Posteriormente se aplica una mezcla
yodo y lugol que fija el cristal violeta. Después se lava la muestra con una mezcla de alcohol y acetona que es capaz de disolver el cristal
violeta y decolorar las bacterias. Algunas bacterias no se decoloran y permanecen azules. A estas bacterias que permanecen azules se
les llama Gram positivas, a las que se han decolorado se les llaman Gram negativas. Para ver mejor las bacterias Gram negativas se
aplica otro colorante, generalmente safranina o fucsina, que dan un color rosa a las bacterias. Así, quedan bacterias teñidas de azul
(Gram positivas) y bacterias teñidas de rosa (Gram negativas). La diferente respuesta a la tinción de Gram se debe a que el cristal
violeta es retenido por la capa de peptidoglicano y, al ser más delgada en las bacterias Gram negativas, estas sufren la decoloración
al aplicar la mezcla de alcohol y acetona. Se creía que el cristal violeta pasaba al interior celular pero recientemente se ha observado que
no ocurre así sino que las moléculas de cristal violeta se adhieren al peptidoglicano y no atraviesa la membrana citoplasmática. En las
bacterias Gram negativas esta adherencia sería menor al tener menos peptidoglicano.

Limitaciones de la tinción de Gram

Existen bacterias que dan respuestas a la tinción de Gram que no se corresponde con la estructura real de su pared celular. Por
ejemplo, existen bacterias con una estructura de pared celular Gram positiva pero con una capa delgada de peptidoglicano que dan
negativo en la tinción de Gram. Incluso hay bacterias con una sola membrana y sin peptidoglicano (mycoplasmas) que también dan
negativo en la tinción de Gram aunque están estructuralmente más relacionadas con las bacterias Gram positivas

Por este motivo, aunque la tinción de Gram sigue siendo ampliamente utilizada como método de aproximación diferencial, la
definición de bacteria Gram negativa y bacteria Gram positiva en función de su respuesta a la tinción de Gram no es del todo
fiable. La respuesta a la tinción de Gram también se utilizó como clasificación taxonómica (Negibacterias y Posibacterias) pero con el
desarrollo de la biología molecular se pudo comprobar que esta clasificación no forma grupos filogenéticos coherentes. La línea
monofilética de las Gram negativas fue desacreditada definitivamente en 1987 con el estudio de Carl Richard Woese sobre la evolución
bacteriana. Todos estos hechos hacen que los términos Gram negativa y Gram positiva sean actualmente ambiguos pudiendo referirse a
una clasificación taxonómica, a un tipo de estructura de pared celular o la respuesta a la tinción de Gram. Dado que la presencia de una
o dos membranas lipídicas rodeando a la célula son los dos principales tipos de ultraestructuras de células procariotas, se han
propuesto otros nombres para referirse de forma específica a esta característica. El microbiólogo Gupta propuso en el año 2000 los
términos monoderma y didermapara referirse a bacterias con una o dos membranas respectivamente. También se propuso estos
términos como aplicables de forma general para referirse a las características de cualquier célula procariota.

Implicaciones sanitarias
Entre las bacterias Gram negativas muchas son patógenos para el ser humano y la estructura de la pared celular de estas bacterias tiene
un papel destacado tanto en la patogenicidad como en el tratamiento. Por un lado, el lípido A (la parte lipídica del lipopolisacárido)
es una endotoxina y es capaz de estimular respuestas del sistema inmunitario generando una reacción tóxica responsable de muchos
de los efectos patógenos. Entre los efectos tóxicos más importantes del lípido A está la estimulación de la respuesta inflamatoria y
fiebre. El mecanismo de acción está relacionado con la activación de los macrófagos, los cuales liberan Interleucina-1, factor de necrosis
tumoral y óxido nítrico que desencadenan la respuesta inflamatoria y la fiebre. Por otro lado, la membrana externa supone una barrera
de protección que impide o dificulta la actividad de agentes antimicrobianos como pueden ser antibióticos o detergentes
antisépticos. Por ejemplo, la membrana externa de las bacterias Gram negativas es la responsable de que sean resistentes a la lisozima y
a la penicilina. No obstante, hay disponibles antibióticos con actividad frente a las bacterias Gram negativas, por ejemplo, la
estreptomicina o la ampicilina.