VALIDACIÓN DE

MÉTODOS ANALÍTICOS
Pablo Richter
 Introducción

 La validación de un método analítico tiene como objetivo

establecer por medio de estudios científicos, que un
método tiene las características de desempeño que son
adecuadas para cumplir los requerimientos de las
aplicaciones analíticas pretendidas.
 Una vez validada una metodología analítica, el laboratorio
de ensayo deberá fijar los intervalos de aceptabilidad para
el control de calidad de cada una de las propiedades
analíticas del método. Una metodología, aún cuando tenga
el carácter de método estándar u oficial, debería ser
validada antes de ser utilizada en forma rutinaria.
 Introducción
 Las propiedades analíticas que necesariamente deberán ser
documentadas en un proceso de validación, son la
siguientes:

 Precisión al nivel de replicabilidad y repetibilidad

 Exactitud
 Incertidumbre
 Intervalo de linealidad
 Límite de detección del método
 Límite de cuantificación del método
 Campo de Aplicación
 El presente documento corresponde a una guía técnica que
define los términos y los procedimientos relativos a la
validación de un método de análisis.

 En todas las actividades de laboratorio es esencial

uniformar las definiciones y los métodos de cálculo para los
diferentes términos. En este documento se establecen las
definiciones relativas a propiedades de métodos analíticos
que se utilizarán en los laboratorios de rutina del país.
 Definiciones
 CURVA DE CALIBRACIÓN: Representación gráfica
bidimensional, que muestra la variación de la señal
analítica con la concentración del analito. Esta última se
obtiene al graficar el valor obtenido de la señal analítica
(valor absoluto, altura, área, etc.) versus las
concentraciones de los estándares respectivos.
 SENSIBILIDAD: Propiedad analítica que se define como la
capacidad de un método para discriminar entre
concentraciones (cantidades) semejantes de analito. La
sensibilidad de un método analítico corresponde a la
pendiente de la curva de calibración. Algunas veces se
expresa informando la razón entre el valor de señal
obtenida a una concentración dada de estándar.
 Definiciones
 LIMITE DE DETECCIÓN: Existen distintas
formas de definir los límites de detección de un
método de acuerdo a criterios estadísticos,
basados en el cuociente entre la magnitud de la
señal de la medida y el ruido de fondo producido
por el instrumento o por el blanco analítico.

a) Límite de Detección IUPAC: Concentración de

analito que origina una señal que puede
diferenciarse estadísticamente de un blanco
analítico.
 Límites de detección y cuantificación
¿Cuál es la menor concentración que podemos detectar o cuantificar con este método
de análisis?

S= Señal
Razón señal ruido S/n

LD => S/n = 3
n = ruido LC => S/n = 10
b) Límite de Detección Instrumental (LDI):
Corresponde a la concentración mínima de un compuesto
analizado que, sin la presencia de la matriz, un
instrumento puede detectar con una fiabilidad definida y
que es estadísticamente diferente de la respuesta
correspondiente al ruido de fondo obtenido por el
instrumento.

c) Límite de Detección del Método (LDM): Corresponde

a la concentración mínima de un compuesto que puede
ser detectada en una matriz real, la cual es tratada
siguiendo todas las etapas del método completo,
incluyendo separaciones y pretratamientos. Esta mínima
concentración produce una señal detectable con una
fiabilidad definida, estadísticamente diferente a la señal
producto del blanco obtenido en las mismas condiciones.
 Definiciones
 LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN DEL MÉTODO (LCM):
Corresponde a la concentración mínima de un analito que
puede ser cuantificada en una matriz real, la cual es
tratada siguiendo todas las etapas del método empleado,
incluyendo separaciones y pretratamientos. Esta mínima
concentración produce una señal cuantificable con una
nivel de confianza definido.

 INTERVALO DE LINEALIDAD O DE DETERMINACIÓN:

Corresponde al intervalo de concentración más fiable de
medida para la determinación analítica del analito. Este
intervalo esta comprendido entre la concentración
correspondiente al del LCM y la concentración máxima que
entrega el límite de linealidad.
Definiciones

 PRECISIÓN: Grado de concordancia de un

grupo de resultados entre sí. Dispersión de estos
resultados alrededor de su media. Existen tres
formas de plantear un estudio de precisión:

 Replicabilidad (Repeatability, “within run precision”)

 Repetibilidad (Intermediate precision, “within lab reproducibility”)
 Reproducibilidad (Reproducibility conditions, “between lab precision”)
Niveles de Precisión
 Replicabilidad: Forma de plantear el estudio de precisión. Se define
como la dispersión de resultados originados por aplicaciones del mismo
método a alícuotas de la misma muestra, para determinar el mismo
analito, en el mismo laboratorio, por el mismo operador y con las mismas
herramientas analíticas, en un corto intervalo de tiempo.
 Repetibilidad: Forma de plantear el estudio de precisión. Se define
como la dispersión de resultados originados por aplicaciones del mismo
método a alícuotas de la misma muestra, para determinar el mismo
analito, en el mismo laboratorio, y al menos una de las siguientes
condiciones es diferente: analista, instrumento, día.
 Reproducibilidad : Forma de plantear el estudio de precisión. Se define
como la dispersión de resultados originados por aplicaciones del mismo
método a alícuotas de la misma muestra, para determinar el mismo
analito, en diferentes laboratorios, y en las siguientes condiciones:
diferente analista, diferente instrumento, igual o diferente día.

Esta propiedad analítica no se determina de forma rutinaria en un procedimiento de

validación. Sólo es aplicable a ejercicios de intercomparación.
 Definiciones
 EXACTITUD: Expresa la cercanía entre el valor que es aceptado,
como un valor de referencia (material de referencia certificado) y
el valor encontrado (valor promedio) obtenido al aplicar el
procedimiento de análisis un cierto número de veces. La exactitud
se expresa en términos de error, generalmente como error
relativo (Ver más adelante SESGO).

 RECUPERACIÓN: Corresponde a la diferencia (en porcentaje)

entre la concentración medida de un analito en una muestra
fortificada (a la que se le ha agregado una cantidad conocida de
estándar) y la concentración medida en la misma muestra sin
fortificar, dividido por la concentración de sustancia agregada.
 Definiciones
 INCERTIDUMBRE: Se puede distinguir entre los siguientes
conceptos:

a) Incertidumbre genérica: Duda acerca de la composición

química de un objeto o una muestra. Es lo contrario a
información.

b) Incertidumbre específica: Intervalo de valores en que puede

encontrarse un resultado, una media de los mismos y el valor
considerado verdadero.

 SELECTIVIDAD: Capacidad de un método analítico para

originar resultados que dependan de forma exclusiva del
analito, para su identificación y/o cuantificación.
Error vs Incertidumbre

Resultado de un análisis: 2,5 ± 0,8 mg / Kg

Valor certificado: 2,9 ± 0,2 mg / Kg

Error: 2,9 – 2,5 = 0,4 mg / Kg

Incertidumbre: 0,8 mg / Kg
PROCEDIMIENTOS
I. Calibración del método

1) Procedimiento para construir una Curva de

calibración
Preparar una batería de estándares de concentración conocida en el
solvente apropiado, dentro del intervalo de concentraciones en que
se estima que estarán las muestras a analizar. Posteriormente
determinar la señal analítica que origina cada una de las soluciones,
y
 Realizar una inspección preliminar, graficando los puntos
experimentales disponibles y verificando visualmente si existe
alguna desviación de la linealidad y aproximadamente a partir de
qué valor ésta se manifiesta.

 A partir de la curva de calibración estimar la parte lineal, obtener

la recta de calibración: Y = S C + Yb, donde C es la masa o la
concentración de la sustancia a ser cuantificada y S e Yb la
pendiente y ordenada en el origen de la recta, respectivamente.
Calcular los coeficientes S, Yb y r (coeficiente de correlación)
para la curva de calibración, descartando los puntos
preliminarmente eliminados en la etapa anterior. Calcular también
los límites inferior (LI) y superior (LS) a partir de los cuales los
cuocientes (señal / masa) o (señal / concentración) indiquen que
un punto está fuera del intervalo lineal LI = 0,95s y LS= 1,05s,
respectivamente.
 Verificar si existe algún punto preliminarmente incluido
en la curva de calibración que, por comparación con los
límites de corte calculados en b) debería de ser excluido
(o sea, si el correspondiente cuociente (señal / masa) o
(señal / concentración) es menor que LI o mayor que LS)
o si algún punto inicialmente excluido debería de ser
considerado para el cálculo de la curva de calibración.

 Inclusión o exclusión de nuevos valores en la curva: Si el

examen hecho en c) indica que todos los puntos de la
curva preliminarmente incluidos (o excluidos) lo han sido
correctamente, el procedimiento está terminado. En caso
contrario, repetir las etapas de b) a d), incluyendo o
excluyendo los puntos necesarios, hasta que ningún valor
sea rechazado o considerado para el cálculo de la curva
de calibración.
EJEMPLO – Curva calibrado
 Los siguientes datos son las áreas Conc. MVK, mM Área relativa
máximas relativas en 0,5 3,02
cromatogramas de disoluciones
1,5 9,00
patrón de metil vinil cetona
(MVK): 2,5 15,03
 Determine la recta por el método 3,5 21,42
de los mínimos cuadrados
4,5 27,03
 Una muestra dio una señal para
MVK con un área relativa de 10,3. 5,5 32,97
Calcule la concentración de MVK 6,5 39,00
en la muestra. 7,5 44,20
 Dos evaluaciones adicionales de
8,5 47,00
la muestra dieron como resultado
las siguientes áreas; 10,8 y 10,1. 9,5 50,20
Calcule la precisión de esta
determinación.
I. Calibración del método

2) Adición de estándares
Cuando en el proceso de calibración del método, se determine que hay
interferencia de la matriz, utilizar el método de la adición estándar de
acuerdo a los siguientes procedimientos alternativos.

a) Con muestra sintética: Utilizar una mezcla preparada en el

laboratorio de todos los componentes de la matriz de la muestra
sin el principio activo a determinar, luego enriquecer con estándar
a diferentes niveles de concentración. Para preparar las soluciones,
en este caso se mantiene constante la cantidad de muestra
sintética y se agregan cantidades variables del estándar.
(curva en presencia de matriz)
Ácido oxolínico
 Curva de Calibración de Estándar  Curva de Calibración de ácido
de ácido Oxolínico Oxolínico en matriz

Curva Oxolínico Curva Calibración Ác. Oxolínico en Matriz

y = 42084x - 9036,7 y = 19162x + 4564,4

15000000 5000000
R2 = 0,9997 R2 = 0,9982
4000000
10000000
Área

3000000

Área
5000000 2000000
1000000
0 0
0,00 100,00 200,00 300,00 400,00 0,00 50,00 100,00 150,00 200,00
Conc: (ng/ml) Conc. (ng/g)
I. Calibración del método

2) Adición de estándares

b) Con muestra: Cuando no es posible contar con una muestra

sintética (o matriz blanco), trabajar directamente con una muestra
real. Determinar por duplicado la señal promedio del analito en la
muestra, con el método a validar; una vez conocida la señal
promedio, proceder a enriquecer las muestras con estándar a
diferentes niveles de concentración. Para preparar las soluciones,
en este caso se mantiene constante la cantidad de muestra tomada
y se agregan cantidades variables del estándar.

 La ICH (International Conference Harmonization), recomienda preparar

muestras independientes por triplicado a cada nivel de concentración.
EJEMPLO – Adición estándar
 En una muestra de agua de mar se determina cobre por voltamperometría de
redisolución anódica (ASV). Una alícuota de 5 ml de muestra es diluida en un
matraz de 10 ml con agua destilada. Enseguida en tres matraces de aforo de
10 ml se agrega una alícuta de 5 ml de muestra y respectivamente se agrega
un volumen de 1, 2 y 3 ml de solución estándar del analito de 10 µg/l. Las
señales respectivamente obtenidas son: 4,11 µA; 6,15 µA; 7,99 µA y 10,05
µA. Determinar la concentración de cobre en la muestra.

Cu, µg/l Señal, µA

0 4,1
1 6,15
ejemplo adicion estándar.xls
2 7,99
3 10,05
I. Calibración del método
3) Uso de estándar interno
 Siempre que sea posible, particularmente en cromatografía, debe emplearse un
estándar interno (explicar diferencia con estándar subrrogate), puesto que
esto minimiza los errores debidos a la adsorción en superficies, a la pérdida
durante la extracción, a las pérdidas durante la evaporación del solvente, o
durante los procedimientos de derivatización, y la irreproducibilidad debida a las
técnicas de transferencia y de inyección.

 Los estándares internos deben ser, idealmente, un homólogo del analito. Si esto
no es posible, se elegirá un compuesto que posea propiedades físico-
químicas similares a las del analito. Las propiedades cromatográficas del
estándar interno deben ser tales que eluya muy cerca del analito pero aún así,
completamente resuelto de cualquier otra sustancia presente.
EJEMPLO – Estándar Interno

Los siguientes datos de calibración han sido obtenidos en una

determinación de benzopireno (BP) por GC-MS. Como estándar interno
se utilizó pireno (C13). Construya la curva de calibrado correspondiente.
Area
Conc. BP, ppm Area BP Area estándar interno relativa

0,1 1100 8600 0,13

0,5 5200 8000 0,65

1,0 18000 12800 1,41

5,0 59000 9100 6,48

10,0 95000 7300 13,01

 II. Procedimiento para determinar la
sensibilidad

 Una vez establecida la curva de calibración de acuerdo al

procedimiento anterior, determinar la pendiente de la curva (S),
lo cual define la sensibilidad del método.

Curva Oxolínico Curva Calibración Ác. Oxolínico en Matriz

y = 42084x - 9036,7 y = 19162x + 4564,4

15000000 5000000
R2 = 0,9997 R2 = 0,9982
4000000
10000000
Área

3000000
Área 2000000
5000000
1000000
0 0
0,00 100,00 200,00 300,00 400,00 0,00 50,00 100,00 150,00 200,00
Conc: (ng/ml) Conc. (ng/g)
III. Procedimiento para determinar el
límite de detección IUPAC
 Medir la respuesta de al menos 10 blancos analíticos independientes, de
los que se deduce la media YB y la desviación estándar σB. De acuerdo
a la IUPAC, el límite de detección es:
YLD = YB + 3 σB

 A una señal YLD le corresponde una concentración CLD, lo que se

consigue por extrapolación gráfica en la curva de calibrado.

YLD Curva de Calibrado CLD

El límite de detección debe expresarse en

unidades de concentración
 EJEMPLO – LD
 Para estudiar la sensibilidad de un método de determinación de quínina
en agua tónica se han realizado dos series de experimentos. En la
primera, se realizan 11 medidas repetidas del blanco (agua tónica en
ausencia de quinina suministrada por el fabricante) y se obtiene los
siguientes datos de intensidad de fluorescencia: 0,70; 0,74; 0,72; 0,71;
0,73; 0,71; 0,73; 0,74; 0,70; 0,69 y 0,75. En otra serie de experimentos,
al agua tónica sin quinina, se le añaden cantidades crecientes de quinina
para preparar 7 muestras artificiales, obteniéndose los siguientes
resultados:

Quinina, ug/L 1,0 2,0 3,0 4,0 6,0 8,0 10,0

Intensidad de
Fluorescencia 2,51 4,60 6,52 8,60 12,71 16,68 20,81

Determinar la sensibilidad y límite de detección del método

ejemplo Limite deteccion quinina.xls

IV. Procedimiento para la determinación del
Límite de Detección Instrumental (LDI)
 Agregar una alícuota de solución estándar de analito en “agua pura” o
en el solvente adecuado, de manera de obtener una concentración
correspondiente a 2-10 veces el LDI estimado (obtener el límite
estimado alternativamente de valores reportados en literatura, catálogo
del equipo, razón señal / ruido, etc.). Someter esta solución a medición
(n replicas independientes de la solución) en el sistema instrumental.
Se determina la señal analítica Yb y su desviación estándar (σB) de
acuerdo a la siguiente expresión:

σB = ( (Xi- promedio)2/n-1)1/2

 La expresión para calcular el límite de detección instrumental es la

siguiente:

YLD = 3 σB n ≥10
Después utilizando la curva de calibrado se obtiene la concentración en
el límite de detección.
V. Procedimiento para la determinación del
Límite de Detección del Método (LDM)
 Determinar el límite de detección del método en una muestra
real, según el siguiente procedimiento

1) Si la concentración del compuesto analizado se sitúa entre 2 y 10

veces la concentración del límite de detección estimado, pasar a
la etapa siguiente. Si por el contrario la concentración es
demasiado elevada, cambiar de muestra. Si la concentración es
demasiado baja, ajustar mediante la adición de un estándar la
concentración del compuesto de interés, para situarla entre 2 y
10 veces el límite de detección estimado.
2) Separar a lo menos 10 alícuotas de la muestra utilizada para
evaluar el LDM y realizar todas las etapas implicadas en el
método analítico.
V. Procedimiento para la determinación del
Límite de Detección del Método (LDM)

3) A partir de los resultados obtenidos, calcular la media y la

desviación estándar (σB) de las replicas:

La expresión para calcular el límite de detección del método es

la misma anterior.
VI. Procedimiento para la determinación del límite
de detección de un método analítico, a través
de la construcción de una curva de calibración

1) Construir curva de calibración, sobre matriz de muestra, en un

intervalo de concentraciones cercano al cero (lo más bajo que pueda
ser detectado) (n ≥ 4) .

2) A partir de la curva, determinar:

a) Ordenada en el origen de la línea de regresión: YB
b) Desviación estándar de la regresión (se obtiene con cualquier programa
estadístico): σy/x

2
(yi yˆ i)
σy/x
n 2

Donde:
yi: Valor observado del punto en la ordenada
ŷi: Valor teórico del punto obtenido por la predicción del modelo de regresión
n: Número de puntos de la curva de calibración (n ≥ 4)

c) Pendiente de la curva de calibración: S

VI. Procedimiento para la determinación del límite
de detección de un método analítico, a través
de la construcción de una curva de calibración

3) Calcular Límite de detección:

Señal del Límite de detección:

yLD = yB + 3 sy/x

Concentración del Límite de detección se calcula haciendo uso

de la ecuación de la curva de calibración.
VII. Procedimiento para la determinación del
Límite de Cuantificación del Método (LCM)

 El límite de cuantificación del método se determina

siguiendo el mismo procedimiento que el usado para el
LDM pero finalmente en la expresiones respectivas el
factor 3 se sustituye por 10.
VIII. Ej: Procedimiento para la determinación del límite de
cuantificación de un método analítico, a través de la
construcción de una curva de calibración

 El límite de cuantificación del método, a través de una

curva de calibración, se determina siguiendo el mismo
procedimiento que el usado para el LDM, pero finalmente
la expresión que debe considerarse es:

Señal del Límite de cuantificación:

yLCM = yB + 10 sy/x

Concentración del límite de cuantificación a través de la

curva de calibración
IX. Procedimiento para calcular la
replicabilidad (Precisión)

 Dentro del intervalo de 2 a 10 veces el límite de cuantificación

del método, separar 10 alícuotas de una muestra y aplicarles
el método completo, respetando las siguientes condiciones:
mismo analista, mismo instrumento y mismo día. Para realizar
los cálculos que requiere el método e informar los resultados,
utilizar las unidades apropiadas y el número de cifras
significativas necesarias.
 La replicabilidad se expresa como la desviación estándar
relativa o coeficiente de variación (CV).
X. Procedimiento para calcular la
repetibilidad (Precisión)

 Dentro del intervalo de 2 a 10 veces el límite de cuantificación

del método, separar 10 alícuotas de una muestra y aplicarles
el método completo, cambiando al menos una de las
siguientes condiciones: el analista, el instrumento o el día.
Para realizar los cálculos que requiere el método e informar
los resultados, utilizar las unidades apropiadas y el número de
cifras significativas necesarias.

 Los resultados se expresan como desviación estándar relativa

o coeficiente de variación (CV).
XI. Procedimiento para determinar la
exactitud
 Dentro del intervalo de determinación, aplicar el método
analítico completo “n” veces (n = 3-10 replicas) a una muestra
en la cual el parámetro a medir esté certificado por un
organismo reconocido (material de referencia certificado).

 Para determinar el error relativo del método (E, %), aplique la

siguiente ecuación:

(Vo Vc)
E(%) 100
Vc
Vc = Valor certificado;
Vo = media de los valores obtenidos aplicado el método.

 Además, puede ser necesario hacer el cálculo estadístico para

la equivalencia con el material de referencia, utilizando el test
de varianzas homogéneas
XI. Procedimiento para determinar la
exactitud

Si no existe o no está disponible el material de referencia, la determinación de

la exactitud puede llevarse a cabo de acuerdo a una de las siguientes
posibilidades, y en siguiente orden de prioridad:

1) Comparación del método en la misma muestra, con un método

absoluto

2) Comparar el método con un método independiente, ya sea éste de

referencia o validado previamente.

3) Recuperación en una matriz real con 2 niveles de concentración

distintos. Los niveles de concentración deben estar, en un caso entre 2
y 10 veces el LCM y en el otro, entre 20 y 30 veces el LCM.

4) Intercomparación entre a lo menos 2 laboratorios que utilicen

metodologías validadas.
XII. Procedimiento para determinar la
recuperación
 Analizar una muestra real y en paralelo analizar la misma
muestra a la que se ha agregado una concentración dada de
estándar. La concentración final debe estar dentro del rango de
determinación del método. Calcular la recuperación de acuerdo
a la siguiente expresión:

(Cs C)
Recuperación (%) 100
Ca

Cs = concentración de la muestra fortificada

C = concentración en la muestra no fortificada
Ca= concentración agregada.
XIII. Procedimiento para el cálculo de
la incertidumbre

Cuantificación de los componentes de incertidumbre.

• Una forma común de presentar las diferentes contribuciones a la

incertidumbre de la medición total es usar los diagramas de causa y efecto.
Este enfoque puede resultar muy útil cuando se estudia o cuantifica
componentes de incertidumbres individuales.

• Se ha demostrado, sin embargo, que en algunos casos esta metodología

subestima la incertidumbre de las mediciones, dado que es difícil poder incluir
todas las posibles contribuciones de incertidumbre en tal enfoque.

• En este contexto, el grupo de expertos en calidad y metrología de “Nordtest

(2004)” ha propuesto el modelo para el cálculo de la incertidumbre en el que
la repetibilidad (P. intermedia) de las mediciones se combina con la estimación
del sesgo del método. Así, usando el control de calidad existente y los datos
obtenidos en la validación del método analítico, la probabilidad de incluir todas
las contribuciones de incertidumbre se maximiza.
Sesgo: Diferencia entre el valor medio medido a partir de una serie de resultados de ensayo y un valor de referencia aceptado (un valor
certificado o nominal).
XIII. Procedimiento para el cálculo de
la incertidumbre
En este plano, un laboratorio puede combinar dichos componentes individuales
en 2 tipos de incertidumbre: incertidumbre derivada de la repetibilidad
(P. Intermedia) del método (urep) y la incertidumbre derivada del
sesgo (usesgo).

La manera más común de estimar los componentes del sesgo son: el

uso de material de referencia certificado, participación en rondas
interlaboratorios o ensayos de recuperación.
XIII. Procedimiento para el cálculo de
la incertidumbre

Cálculo de Incertidumbre Expandida (U).

Para realizar el cálculo de U, se deben determinar previamente las dos
incertidumbres estándares antes expuestas.

Cálculo de incertidumbre repetibilidad del método (urep):

*t (0.95, n 1)
urep = n

Donde:
= Desviación estándar al nivel de repetibilidad.
t = Coeficiente de student para un 95% de nivel de confianza.
n = número de datos.
XIII. Procedimiento para el cálculo de
la incertidumbre

Cálculo de incertidumbre derivada del sesgo (usesgo):

usesgo = (sesgo) 2 (uCER) 2

Donde:

sesgo = el valor puede ser determinado alternativamente por medio del

análisis de un material de referencia certificado, participación en rondas
interlaboratorios o ensayos de recuperación .

u(CER) = Incertidumbre del material de referencia certificado o del patrón de

referencia (valor certificado) utilizado en el ensayo de recuperación
XIII. Procedimiento para el cálculo de
la incertidumbre

Finalmente la incertidumbre expandida (U) del proceso analítico, se

expresa combinando ambas incertidumbres antes mencionadas, considerando
un factor de recubrimiento igual a 2:

U= 2 (urep) 2 (usesgo) 2

Incertidumbre Expandida (U): Cantidad que define un intervalo alrededor del

resultado de una medición que se espera que abarque una gran parte de la
distribución de valores que se podrían atribuir razonablemente al mensurando,
para un cierto nivel de confianza. Una Incertidumbre expandida (U) se calcula
de una incertidumbre estándar combinada (u) y un factor de cobertura k
usando: U = k x u.
 EJEMPLO – Calculo incertidumbre
 Determinación de BTEX
Se lleva a cabo una determinación de benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos
(m+p, o) en una muestra de agua.
El estándar de calibración corresponde a una solución en metanol que certifica
que las concentraciones de los compuestos son las nominales ± 0,5%.
El sesgo del método fue determinado a través de un ensayo de recuperación,
con los siguientes datos (O: valor promedio obtenido; R: valor de referencia):

Benceno Tolueno E-Bz (m+p)-XIL o-XIL

µg/g µg/g µg/g µg/g µg/g
O R O R O R O R O R

10,2 11,0 9,9 11,0 11,5 11,0 25,0 11,0 11,1 11,0
Determinación de BTEX
En la validación del método analizaron separadamente 8 alícuotas
de una muestra real obteniéndose las siguientes concentraciones:

Nº µg/g BEN µg/g TOL µg/g ET-BEN µg/g (m+p)-XIL µg/g o-XIL

1 43,42 48,62 32,14 44,15 14,15

2 43,41 48,44 32,17 44,64 13,07

3 43,52 48,20 31,36 44,67 13,59

4 43,60 48,27 31,14 43,68 13,06

5 43,61 48,41 31,91 44,22 12,91

6 43,57 48,56 31,80 44,67 12,96

7 42,17 47,63 31,21 45,33 13,19

8 42,29 47,70 31,25 43,03 12,80

Ejemplo incertidumbre.xls
 1. Para la determinación analítica de nitrofurantoína en formas farmacéuticas se añaden cantidades crecientes de la
droga de la droga en dimetilformamida (DMF). En seguida se mide la respuesta instrumental (señal analítica) de cada
solución y se obtienen los siguientes datos:
CONCENTRACIÓN Respuesta
mg/l Instrumental
0 0,01
0,5 0,058
1 0,11
2 0,225
4 0,445
6 0,67
8 0,89
10 1,08
12 1,1
15 1,12
20 1,11

(a)Determine la Sensibilidad del método.

Por otra parte, al no disponer de un material de referencia certificado, se prepara una muestra artificial de tableta que contiene 750
mg de excipientes comunes (estereato de magnesio, talco, almidon, colorante, gelatina etc.) y 250 mg de nitrofurantoina pura. Una
porción de 10 mg de muestra artificial se agrega en un matraz de aforo de 1 litro y se afora con DMF. A la solución resultante se le
determina su respuesta instrumental dando un valor de 0,272. (b) Determine la exactitud del método (error relativo) e indique si
hay interferencia por parte de los excipientes de la formulación.
10 muestras que contienen sólo la mezcla de excipientes (sin nitrofurantoína) son analizadas independientemente por el método. Las
respuestas instrumental obtenidas son: 0,015; 0,010; 0,012; 0,015; 0,010; 0,012; 0,009; 0,010; 0,015; 0,008. (c) Determine el límite
de detección del método.
10 porciones de una muestra real de tabletas de nitrofurantoína se analizan independientemente por el método analítico y se obtienen
los siguientes resultados (mg): 250,35; 250,44; 249,36; 248,99; 250,98; 250,00; 249,98; 251,05; 250,39; 248,98. (d) Determine la
precisión del método (desviación estándar relativa).
Rechazo de datos dudosos
 Un dato dudoso difiere excesivamente de la media.
 La prueba estadística Q se utiliza para decidir si un dato debe
retenerse o rechazarse.
 Primero se calcula un valor de Qexp y se rechaza el dato
cuando el valor es mayor que el valor estadístico (Qcrit)

xq xn
Qexp , xq es el valor dudoso.
xm ax xm in
xn es el valor más cercanoal valor dudoso.
Valores de Qcrit
Número Qcrit a 90% Qcrit a 95%
de Datos de probabilidad de probabilidad
3 0.941 0.970

4 0.765 0.829

5 0.642 0.710

6 0.560 0.625
 Ejemplo: Prueba Q
Valor (x) x2
 Para las mediciones replicadas que 3.5 12.25
aparecen al lado, aplique la
prueba Q para el valor 2.5. Use 3.1 9.61
un Qcrit a 90% de confianza. 3.1 9.61
3.3 10.89
2.5 6.25
(x)=15.5 (x2)=48.61

Qcrit 0.642 para 5 valores y a 90% de probabilid ad.

2.5 3.1
Qexp 0.60
3.5 2.5
Qexp Qcrit , se retiene el valor.
EJEMPLO – Dato dudoso
En el mundial de fútbol de Alemania 2006, al final de cada partido,
llevan a un par de jugadores para hacer la prueba del doping. En la
orina se determinan si hay substancias prohibidas (en este caso
efedrina).
Previamente el laboratorio que hizo el análisis validó su método con
muestras certificadas de efedrina en orina. Esta tenía un contenido
certificado de 2,05 ± 0,08 ng/ml. Al analizar esta muestra diez veces
de manera independiente se obtuvieron los siguientes valores en
ng/ml: 2,08; 2,14; 2,09; 2,21; 3,91; 2,01; 2,09; 1,99; 1,98; 2,05.
 Indique: cuál es el objeto, el analito y la muestra para el análisis.
 cuál es la exactitud y precisión del método que utiliza el laboratorio.
 Qcrit (tabla (n=10) 0,464)

ejemplo prueba Q.xls

Cartas de Control

 Una vez que ha sido validada una metodología y se comienza con su

aplicación en análisis de rutina, todos los controles de calidad
relacionados con las propiedades analíticas deben ser documentadas a
través de la construcción de Cartas de Control, de forma tal que el
comportamiento del método en el tiempo pueda ser trazable.

EJEMPLO carta control turbiedad.xls

GLOSARIO
 Alícuota: porción bien definida (masa, volumen) de la muestra

 Muestra: es la parte (alícuota) del objeto que contiene los analitos

 Análisis: someter una muestra a un proceso analítico para conocer información

química sobre la misma

 Blanco analítico: Muestra, generalmente artificial, que no contiene el analito.

Teóricamente no debería originar señal, si lo hace ésta se denomina “señal blanco”.
El blanco analítico es un elemento de control de calidad utilizado en la rutina
analítica el que se procesa como una muestra más en un análisis

 Interferente: Todo compuesto, todo elemento, toda partícula o todo factor que
afecte el resultado generado por un método analítico

 Determinación (cuantificación): proceso para conocer la cantidad

/concentración de un analito (o familia) de una muestra que es analizada

 Detectar: Acción de un instrumento para producir una señal y transducirla en una

magnitud física fácilmente medible. Proceso de medición con fines cualitativos.

 Identificar: proceso analítico cualitativo que implica un reconocimiento del analito,

a través de las características químicas o fisicoquímicas del mismo o de su
producto de reacción

 Caracterizar: acción de establecer los aspectos diferenciales de un objeto o

sistema, a partir de los resultados analíticos
 Técnica: principio científico que se utiliza para extraer información analítica.
Implica el empleo de un instrumento

 Método Analítico: corresponde a la Adaptación específica de una técnica analítica

para un propósito de medición seleccionado. Es un conjunto de operaciones
especificas para caracterizar cuali y/o cuantitativamente a un analito (o familia) en
una determinada muestra. Implica el empleo de un técnica (instrumento)

 Método absoluto: es aquel método de cuantificación calculable que no se basa en

el empleo de estándares analíticos

 Procedimiento: descripción pormenorizada de una metodología analítica

 Material de referencia: Material o sustancia, en el cual una o más de sus

propiedades están suficientemente bien establecidas, homogéneas y estables, que
se emplean para calibración, asignación de valores a materiales o evaluación de
métodos analíticos

 Material de referencia certificado: son materiales de referencia que tienen

certificados uno o varios valores de sus propiedades (con sus incertidumbres
específicas) obtenidos por procedimientos especiales (Ejemplo: ejercicio de
intercomparación) bajo la responsabilidad de un organismo competente e
independiente

 Ejercicio de intercomparación: conjunto de procesos de medida (método)

llevados a acabo por diferentes laboratorios, bajo la coordinación de un ente
competente, para analizar alícuotas de la misma muestra para determinar los
mismos analitos
Referencias
 J.C. Miller and J.N.Miller, Statistic for Analytical Chemistry, Ellis Horwood Limited
edition, Chichester, England, 3rd edition, pag. 115-118, 1993.

 M. Valcarcel, Principios de Química Analítica, Springer-Verlag Ibérica, Barcelona,

España, 1999.

 Norma IRAM 301:2000-Norma ISO/IEC 17025: 1999.

 The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method

Validation and Related Topics. EURACHEM Guide. Editor: H. Holcombe, LGC,
Teddington: 1998.

 Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. Guide EURACHEM- CITAC Guide:

2000.

 Nordtest Report 537. 2004. Handbook for Calculation of Measurement Uncertainty in

Environmental Laboratories.

 Norma ISO 9000: 2000.

 IUPAC, Limit of Detection, Spectrochim. Acta 33 B, 242, 1978.

 Centre d'expertise en analyse environnementale du Québec. Protocole pour la

validation d'une méthode d'analyse en chimie DR-12-VMC. Edition 2000-03-01