INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACINAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

Departamento de Bioquímica

PRACTICA: Precipitación, Separación y Punto Isoeléctrico de Proteínas

SECCION

Introducción Precipitado 2 - Las proteínas

precipitaron,
La multiplicidad de grupos ácidos y básicos de una están en el
proteína hace que su solubilidad dependa de las precipitado 2
concentraciones de las sales disueltas, la
constante dieléctrica del disolvente, pH y
temperatura. Algunas proteínas precipitan en Precipitación por efecto del pH
condiciones en que otras aún están bastante Tubo 1 2 3 4
solubles. Este efecto debe usarse como base para Clara de 3.0 ml 3.0 ml 3.0 ml 3.0ml
la purificación proteica. huevo
filtrada
La solubilidad de una proteína a baja fuerza iónica HCl 0.1 1ml - - -
se incrementa por lo general en la solución salina. ml
La explicación del fenómeno salting in (incremento NaOH 0.1 1ml -
de la solubilidad por las sales), es que a medida ml
que se incrementa la concentración salina de la Regulado - - 1ml -
solución proteica, las contracciones adicionales r de
acetatos
recubren con mayor eficiencia las numerosas
0.1M
cargas iónicas de la molécula de proteína.
(4.7ml)
Las interacciones entre solutos se vuelve más Agua 1ml
fuente que las que hay entre el soluto y el Observaci Precipita Precipita Precipita No
ones ción ción ción presento
solvente. La que proporciona la precipitación de
media menor mayor precipitaci
este. Los solventes misibles en agua, como la ón
acetona y el etanol, suelen ser buenos
precipitantes de proteínas, por que sus bajas
constantes dieléctricas reducen el poder de Precipitación por modificación de la Constante
solución de sus soluciones acuosas hacia los Dieléctrica
iones disueltos, como las proteínas. Tubo Clara Solución Observaciones
de
Objetivos huevo
1 2ml Etanol Precipito
Analizar el efecto que produce la modificación de 1ml
factores fisicoquímicos sobre la solubilidad de las 2 2ml Agua No hubo
proteínas. 1ml presipitación
Determinar el punto isoeléctrico de la insulina,
basándose en sus propiedades de solubilidad a Precipitación por metales pesados
diferentes valores de pH. Tubo Clara Solución Observaciones
de
Resultados huevo
1 1ml Cloruro Precipito
Salting Out
mercúrico
Biuret Interpretación
5%
Filtrado 1 + Positiva porque
(0.25ml)
(sobrenadante) hay proteínas
2 1ml Nitrato de Precipito
Precipitado 1 + Positiva porque
plata 2%
aún hay
(0.25ml)
proteínas
3 1ml Acetato de Precipito
Filtrado 2 + Positiva porque
plomo 2%
(sobrenadante) quedan pocas
(0.25ml)
proteínas.
 4 1ml Cloruro de Solubilizo la sobrenadante se volvió a saturar con con
sodio 5% proteína (NH4)2SO4 en estado sólido para hacer más
(0.25ml) efectiva la saturación debido a que este no está
5 1ml Agua Solubilizo la diluido en agua. Se agito y se llevó a centrifugar
(0.25ml) proteína bajo las mismas condiciones. Finalmente se
volvieron a obtener 2 fases un sobrenadante y un
precipitado. Se hizo la transferencia del
sobrenadante en otro tubo de ensaye, el
Determinación del punto isoeléctrico de la precipitado se disolvió en un mililitro de agua y se
insulina realizó la reacción de Biuret a ambas fases. Los
Tu Ac. Acet Insuli pH Observaci resultados que se obtuvieron fueron: positivo para
bo Acéti ato na ones precipitado y negativo para sobrenadante. Esto
co de 40U/ sucedió porque al momento de saturar la solución
0.2 sodio ml lo que paso es que se hizo precipitar las proteínas
M 0.2 acelerando el proceso con la centrifugación. Al
(ml) M momento de hacer la prueba de Biuret, las
(ml) proteínas en realidad están en el precipitado y no
1 0.23 0.02 0.06 3.6 No en la fase acuosa de la mezcla
ml 7 precipito
2 0.15 0.10 0.06 4.5 Precipito Precipitación por efecto de pH y solventes.
ml 6 El pH al que la cantidad de precipitado fue mayor,
3 0.05 0.20 0.06 5.3 Precipito ya que la composición de la clara de huevo es:
ml 4 Ovalbúmina – 54%, Ovotransferrina – 12%,
4 0.01 0.24 0.06 5.4 No Ovomucoide – 11%, Ovoglobulina G2 – 4%,
ml 2 precipito
Ovoglobulina G3 – 4%, Ovomucina – 3.5%,
5 0.00 .025 0.06 9.0 No
Lisozima – 3.4%, Ovoinhibidor – 1%,
ml 6 precipito
Ovoglicoproteína – 1%, Flavoproteína - 0.8%,
Ovomacroglobulina – 0.5%, Avidina – 0.05%,
Cálculos Cistatina – 0.05%. Debido al alto contenido de
ovalbúmina, siendo el punto isoeléctrico de dicha
Para el punto isoeléctrico de la insulina: proteína 4.6 y el regulador de acetatos de pH=4.7,
[𝐴− ] esto causó que dicha proteína se encontrase en su
𝑝𝐻 = 𝑝𝑘𝑎 + 𝑙𝑜𝑔
[𝐴𝐻] estado sin carga, precipitando en mayor cantidad
que en los tubos a los que se adicionó HCl y NaOH.
[0.20]
𝑝𝐻 = 4.74 + 𝑙𝑜𝑔
[0.05] Conclusiones
Las variaciones de pH, por la presencia de
𝒑𝑯 = 𝟓. 𝟑𝟒 metales pesados y sales afecta a las proteínas de
manera directa, ya que esta provoca cambios en
únicamente hay concentración de sal:
la carga de sus grupos R, cambiando su
1 1 conformación estructural, coagulándolas y
𝑝𝐻 = 7 + 4.74 + log[0.25] facilitando su separación de acuerdo a la
2 2
secuencia de aminoácidos y las cargas que estas
𝒑𝑯 = 𝟗. 𝟎𝟔 posean, dichas técnicas son útiles para el
aislamiento e identificación de proteínas de interés
Discusiones
médico y en investigación para su caracterización
Separación de proteínas por precipitación con y secuenciación. Todas las proteínas deben ser
sales.Al adicionar 6 mL de la solución saturada de solubilizadas menos las fibrosas estas son
(NH4)2SO4 esta provocó la precipitación de ciertas hidrofóbicas.
proteínas,se da por las moléculas de agua
Bibliografía
solubilizando a la proteína y las que solubilizan a
Zumdahl, Steven S. (2009). Chemical Principles
los iones NH4+ y SO42-, acaparando los iones las
6th Ed. Houghton Mifflin Company. p. A21.
moléculas de agua, y causando que la proteína se
coagule por las interacciones hidrofóbicas que hay Nelson, D. Cox, M. 2013. Lehninger – Principles of
entre los residuos de aminoácidos de la misma. Se biochemistry. W.H. and Freeman. 147-151pp.
realizó a una muestra de 1ml de cada una de ellas,
la reacción de Biuret. De las cuales se obtuvo un Voet. 2006. Bioquímica. 3ra edición.
resultado positivo para ambas. Posteriormente el Panamericana. 139-141pp.
Pregunta extra:
Proteínas de la clara de huevo y pK
Ovalbúmina – 54%, Ovotransferrina – 12%,
Ovomucoide – 11%, Ovoglobulina G2 – 4%,
Ovoglobulina G3 – 4%, Ovomucina – 3.5%,
Lisozima – 3.4%, Ovoinhibidor – 1%,
Ovoglicoproteína – 1%, Flavoproteína - 0.8%,
Ovomacroglobulina – 0.5%, Avidina – 0.05%,
Cistatina – 0.05%.