INTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIA

BIOLÓGICAS

LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

Profesores:
Gabriela Olguin Ruiz
Violeta Larios Serrato
Francisco Fernández López
Rogelio Benites Ibarra

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE

ENZIMAS PROTEOLÍTICAS. MÉTODOD DE KUNITZ.

Akire Marey Quintana Valderrabano

Sección 4 grupo: 5QM1
28/082018
Objetivos:
 Establecer una curva de actividad enzimática estándar.
 Determinar la actividad enzimática de la bromelaína y la papaína (enzimas
proteolíticas) a partir de una curva estándar de actividad enzimática de la
Tripsina.
 Determinar cuál de las enzimas empleadas tienen mayor actividad
enzimática sobre el mismo sustrato.

Fundamento:
El método se fundamenta en el cambio de solubilidad de una proteína en ácido
tricloroacético (ATC) cuando está sujeta a la acción de una enzima proteolítica.
Mide la cantidad de péptidos y/o aminoácidos que sean solubles durante la
hidrólisis. Dichos compuestos, o al menos algunos, absorberán a 280 nm.

Resultados:

Tabla 1. Datos para la curva de Actividad enzimática de la Tripsina y de los

problemas de las enzimas a determinar su actividad.
Tubo Concentración de Tripsina (mg/mL) A280 A280 corregida
Problema Testigo
T1 y 1 0.04 0.054 0 0.054
T2 y 2 0.08 0.085 0.005 0.08
T3 y 3 0.12 0.126 0 0.12
T4 y 4 0.16 0.18 0 0.18
T5 y 5 0.2 0.201 0.002 0.199
PROBLEMAS
TI y I Bomelaína 1:10 0.853 0.135 0.718
TII y II Bomelaína 1:20 0.564 0.06 0.504
TIII y III Papaína 1:2 0.449 0.272 0.177
TIV y IV Papaína 1:4 0.269 0.154 0.11
 0.25

0.2
A280 corregida

0.15
y = 0.975x + 0.0096
R² = 0.9763
0.1

0.05

0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
Concentración de tripsina (mg/mL)

Gráfica 1. Curva de Actividad enzimática de la Tripsina.

a) ¿Cuántas unidades trípticas hay por miligramo de tripsina?

𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑡𝑎 0.975

Unidades Tripticas = = =0.04875 UT/mg
20𝑚𝑖𝑛. 20

Tabla 2. Datos para la Curva de actividad enzimática específica para la digestión

de caseína por tripsina.

Tubo Unidades Trípticas A280 corregida

1 0.00195 0.054
2 0.0039 0.08
3 0.00585 0.12
4 0.0078 0.18
5 0.00975 0.199
 0.25

y = 20x + 0.0096
0.2 R² = 0.9763
A280 corregida

0.15

0.1

0.05

0
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012
Unidades Trípticas

Gráfica 2. Curva de actividad enzimática específica.

Tabla 3. UT/g de muestra en piña y papaya (bromelaína y papaína,
respectivamente)

UT UT/g de muestra
Bromelaína 1:10 0.03542 0.595
Bromelaína 1:20 0.02472 0.8305
Papaína 1:2 0.00837 0.0267
Papaína 1:4 0.00502 0.0401

Cálculos:
Absorbancia corregida: A280 problema - A280 testigo
A partir de la ecuación e la recta de la curva de actividad enzimática específica,
obtenemos:
y = 20x + 0.0096
Para obtener las UT de muestra despejamos “x” de la ecuación anterior:
x = y – 0.0096/20
donde “y” es la A 280 corregida de las diluciones de bromelaína y papaína, entonces,
por ejemplo, para el tubo con solución de papaína 1:2:
x = 0.177-0.0096/20 = 0.00837 UT

Después, para los UT/g muestra:

Considerando el valor anterior de UT, el factor de dilución, el volumen del extracto
y el peso de la muestra:

(𝑈𝑇)(𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛)(𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜) (0.00837)(2)(40)

UT/mg= = =0.0267UT/mg
𝐺𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 25
Discusiones:
El uso de los tubos testigos es principalmente el de tener tubos sin actividad
enzimática para poder comparar, pero además nos pueden ayudar a detectar la
presencia de sustancias que absorban a 280 nm y que se encuentren presentes
antes y después de la hidrólisis de la caseína. Dichas sustancias afectan la lectura
de absorbancia, debido a que después de realizar la hidrólisis en los tubos
problema, la solución absorberá como si ésta tuviera una cantidad de proteína
mayor a la que pusimos. Por lo tanto, debe obtenerse una absorbancia corregida,
siendo esta la diferencia entre la absorbancia del problema y la absorbancia del
testigo, lo anterior se hace con la finalidad de obtener resultados experimentales
más confiables.
A través de una curva de actividad enzimática realizada con tripsina sobre caseína
se puede utilizar para conocer la actividad proteolítica de otras enzimas como la
papaína y bromelaína, puesto que los datos de dicha curva son independientes de
la enzima proteolítca utilizada sobre el sustrato (en este caso caseína) siempre y
cuando se mantengan las mismas condiciones para la determinación (pH = 7.6, T =
35ºC).
Comparando los valores de UT de la tripsina con los de las enzimas
que estudiamos, observamos que la bromelaína tiene una mayor actividad
proteolítica (hidrolizan más a la caseína), puesto que el valor de UT calculados son
mayores a los obtenidos para la tripsina.
Aunque hay que considerar que los valores de UT para la papaína y bromelaína las
obtuvimos por gramo de muestra. Observamos además que por tener una mayor
actividad proteolítica las enzimas trabajadas, las concentraciones de UT no entran
dentro de la curva de actividad específica.

Comparando la actividad enzimática de la papaína y la bromelaína, obtuvimos que

ésta última tiene mayor actividad enzimática puesto que tiene valores más altos de
UT/g de muestra. Lo anterior podría relacionarse con que éstas 2 enzimas son
utilizadas en algunos lugares como ablandadores de carne, y se ha visto que la
eficiencia de la papaína en este particular aspecto es bastante menor que la
eficiencia de la bromelina.

El número de UT/g muestra para la papaína es muy similar independientemente de

la dilución, pudiendo sugerir que la actividad enzimática de la papaína sería similar
a pasar de estar en menos concentración. Sin embargo, el último tubo al que se le
añadió enzima fue justamente el tubo de papaína 1:4, y puede que haya transcurrido
más tiempo de acción de la enzima y por eso haya una actividad enzimática similar
a la del tubo menos diluido (1:2).
El grado de maduración de los frutos pudiera ser un factor importante también,
puesto que si es más maduro el fruto mayor será el contenido de enzimas
hidrolíticas que éste contiene. La piña de la cual hizo el extracto estaba muy madura,
más que la papaya, lo cual podría explicar también por qué es mayor la actividad
enzimática en este caso de la bromelaína.
Conclusiones:
-Se puede obtener una curva de actividad enzimática estándar que sea
independiente de la enzima proteolítica siempre y cuando se utilice el mismo
sustrato y las mismas condiciones experimentales (pH, Temperatura, etc.)
-Se obtuvo una actividad enzimática para tripsina de: 0.04875 UT/mg
-Se obtuvo una actividad enzimática para bromelaína de: 0.595 y 0.8305 UT/g
muestra (respectivamente para dilución 1:10 y 1:20).
-Se obtuvo una actividad enzimática para papaína de: 0.0267 y 0.0401 UT/g mta.
(respectivamente para dilución 1:2 y 1:4).

Preguntas:
a) Defina actividad enzimática y actividad enzimática específica
Se define la unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que cataliza la
conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto.
La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína
(U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml).

b) Clasificación de las proteasas en función de su mecanismo de acción y diga en

qué grupo se ubican las determinadas en la práctica

La papaína y la bromelaína pertenecen al grupo de las cisteín-proteasas.

c) ¿Para qué se añade cisteína en las muestras de piña y papaya?

El mecanismo catalítico de las cisteín-proteasas involucra la formación de un
intermediario enzimático acilado. El ataque nucleofílico se realiza a través de in
grupo tiol reactivo de una cisteína presente en el sitio activo. El tiol se transforma en
un nucleófilo al desprotonarse gracias a un residuo de His adyacente.
Tienen actividad proteolítica debido a que la bromelina y papaína que se activan por
la cisteína, tiosulfato y glutatión.

d) ¿Cuál es la especificidad de enlace de la tripsina?

La tripsina rompe el enlace peptídico después de residuos con largas cadenas
laterales cargadas positivamente, a saber, arginina y lisina.

BIBLIOGRAFÍA:
1.Styer, L. Bioquímica. 6ª edición. Reverté. Barcelona. 2008. Pp. 67.
2.Ramírez, K. et al. ENZIMATICA S DE ACTIVIDADES PROTEOLITICAS DE
PRODUCTOS UTILIZANDO LATEX DE PAPAYA (Carica Papaya) PARA LOGRAR EL
ABLANDAMIENTO DE LA CARNE. (En línea) Departamento de Graduados e
Investigación en Alimentos. ENCB-IPN. Consulta: 18/09/2016. Disponible en:
[http://www.smbb.com.mx/congresos%20smbb/morelia07/TRABAJOS/Area_III/Carteles/C
II-8.pdf ]
3.Clavijo, Diego; Portilla Martinez, Maghdiel Cecilia; Quijano Parra, Alfonso Cinética
de la bromelina obtenida a partir de la piña perolera (Ananas Comosus) de
Lebrija-Santander Bistua: Revista de la Facultad de Ciencias Básicas, vol. 10,
núm. 2, 2012, pp. 41-49