PENGARUH PENAMBAHAN SERUM SAPI PADA MEDIA KULTUR TERHADAP KOMPETENSI

MEIOSIS OOSITANJING DARI BERBAGAI STADIUM ESTRUS SECARA IN VITRO

INFLUENCE OF COWS SERUM ADDITION ON MEIOTIC COMPETENCE OF DOG OOCYT

FROM VARIOUS ESTRUS STADIAE IN I/ITRO

Yuda Heru tr'ibrianto', Claude Mona Airin', Asyhari', Amrullah Anindito', Nuraini Rachmawati',
Koko Kurniawan'o Pradityo Yoga Wibowo'

'Bagian
Fisiologi, Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
Email: fibrianto1802@gmail.com

ABSTRACT

Reproductiontechnologyachievementon caninewas fast developed,with born of cloning and transgenic

dog, unforfunately that'stechnology still usedoocyte maturedin vivo becausecanine oocyte matwation in vitro
in this animalnot developedyet andmafurationratestill low. The presentstudywas to investigatedthe effectsof
cow serumsupplementationon meiotic resumptionof canineoocytesfrom various estms stage.Ovary obtained
from bitchesatan-,pro-and di-estrusstageafterovariohysterectomized at clinic veterinarypractice.Ovary were
placed in 0.9o/ophysiologycal saline added 1% pennicilline-streptomycinwith temperature37'C and then
broughtto laboratory.Ovary washedseveraltimesusedPBS andoocyteswere obtainedby slicing ovariantissue
intissueculturemedium(TCM)-l99supplementedwith 25mMHepes,1%pennicillin-streptomycin.Selected
cummulusoocytecomplexes(COCs) were maturedin TCM-199 as control and TCM-1 99 + 10% cow serumas
treatment,on incubator with 38C, 5VoCO, and 5yo Or. After 72 h incubation and Hoechst 33342 staining, the
result shows that cow serum supplement have higher meiotic resumption significantly (P<0.05) in MI
achievementthan in control and oocyte from proestrusirave higher meiotic competent(46.5%) comparing
oocytefrom anestrus(29,4%)significantly(P<0.05)but not significantly(P>0.05)with diestrusstages(34.8%).

Keywords: meiosis,oocyte,ovarium,cowsserum

ABSTRAK

Teknologi reproduksi pada anjing telah berkembangdenganpesatdengandihasilkannya anjing kloning dan

anjing transgenik. Teknologi tersebut masih menggunakanoosit unjing yang masak secara in vivo karena
teknologi pemasakansel telur anjing belum berkembangdenganbaik dan laju maturasinyamasih sangatrendah.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh penambahan serum sapi pada media kultur
terhadapkompetensimeiosis oosit anjing dari berbagaistadium estrus secarain vitro. Kompleks.sel telur
dikoleksi dari ovarium anjing stadium an-, pro-, dan diestrusdari anjing yang diovariohisterektomi dan dibawa
ke laboratoriumdi dalam 0.9% NaCl 37'C. Sel telur diperolehdengancaramencacahovarium di dalammedia
tissueculture medium(TCM)-199 dengan25 mM Hepes,dan lYolarutanpenicillin-streptomycin. Sel telur yang
terkoleksi dimasakkanke dalam media TCM-199 sebagaikontrol dan TCM-199 + 10 serum sapi sebagai
perlakuan, pada inkubator dengan suhu 38oC, soh CO, dan 5o/oOr. Setelah inkubasi selama 72 jam dan
pengecatandengan Hoechst 33342 diperoleh hasil bahwa penambahansenrm sapi 10% pada media kultur
memberikanperkembanganmeiosisyang lebih tinggi (P<0,05)dalam mencapaistadiumMI daripadakontrol,

15
J. Soin Vet.Vol.29 No. I Th. 201I

dan oosit dari stadiumproestrusmempunyaikompetensimeiosisyang lebih tinggi (46,5%) dipitaing oosit dari
anestrus(29,4%) secarasignifikan (P<0,05), tetapi tidak berbedanyata (P>0,05) dengan stadium diestms
(34,8%).

Kata kunci: meioses.oosit.ovarium

PENDAHULUAN
tetapi lajn pemasakansel telur anjing in vitro masih
sangatlahrendah (<20%) (Luvoni dkk., 2003; Otoi
Telah lahir anjing afghanhound hasil kloning
dkk., 2000; Songsasen, 2002) diiringi dengan
pertama di dunia (Lee dkk., 2005), serigalahasil
tingginya hal yang tak terduga dipitaing dengan
interspesiescloning (Kim dkk., 2007), dan anjing
mamalialain sepertisapi,babi dll. (Sahadkk., 2000;
transgenik yang berpendar (Hong dkk., 2009).
Telfer dkk., 2000; Hyun dkk., 2003). Media kultur
Keberhasilan teknologi cloning pada dua jenis
adalahfaktor yang paling penting untuk systemIVM
hewan ini merupakanterobosanbaru di dalam dr,rnia
sehinggabanyakpara peneliti telah mencobaunhrk
keilmuan, walaupun dari kedua hasil yang luar biasa
mengidentifikasi kondisi kultur yang memadai dan
ini diperoleh dengan menggunakan sel telur yang
sesuaiuntuk sel telur anjing, seperti:media kultur
masak secaraalami di dalam tubuh (in vivo) dari
yang berbeda dengan berbagai macam tambahan
anjing yang digunakan sebagai pendonor sel telur'.
sumber energi, serum atau hormon (Nickson dkk.,
Pemakaian sel telur yang masak secara in vivo di
1993; Hewitt dan England,1998;Otoi dkk., 1999;
karenakan adanya kekurangberhasilan pemasakan
Srsendkk., 1998;Songsasendkk., 2003; Rodrigues,
buatan sel telur anjing (in vitro) yang umumnya
Rodrigues2003), tetapi hasil yang diperolehmasih
dilakukan pada kloning hewan lain. Pemasakansel
jauh dari yang diharapkan seperti sistem IVM yamg
telur di luar tubuh (in vitro maturation, IVM) yang
diperolehpada hewan domestic lainnya (Sha dkk.,
sesuai dan baik bagi pertumbuhan dan pemasakan
2000;Telferdkk., 2000;Hyun dkk., 2003;Bogliolo
sel telur ini merupakan sebuah prasyarat penting
dkk., 2004).Pembahanyang terjadi padatingkat inti
dalam berbagaibioteknologi yang menggunakansel
dan sitoplasmadari sel telur anjing selamaproses
telur anjing seperli pembuahan di luar tubuh,
pertumbuhandan pemasakansangatberbedadengan
produksiembriodancloning (Lanzadkk., 1999).
sel telur mamalia lainya, sehingga dibutuhkan
Pengembangan sistem kultur yang akan
kondisi dan persyaratantersendiri unhrk lingkungan
menghasilkan sel telur yang siap diferlilisasi akan
mikro dari media kulturnya.
sangat bermanfaat, tidak hanya untuk mengetahui
Perhrmbuhan dan pemasakan sel telur pada
proses folikulogenesis,tetapi juga preservasidan
anjing berbeda sangat nyata dari hewan mamalia
penyimpananjangka panjangdari selkelaminbetina
jenis lain. Pada anjing, sel telur mengalami
(CarroldanGodsen,1993).
pemasakan di dua tempat, setelah mengalami
Berbagai usaha telah dilakukan untuk
pemasakanpertama di dalam folikel, sel telur di
meningkatkan efisiensi sistem IVM pada anjing,
ovulasikandari ovari padastadiumgerminalvesikel

l6
Yuda l-leru Fibrianto. Pengaruh PenambahanSerum Sapi pada Media Kultur terhadapKompetensi Meiosis Oosit Anjing ...
(GV) dan mengalami pemasakan kedua didalam
bagian belakang oviduk sekitar 2-5 hari (Tsutsui,
1989).Komplek kumulus dan sel telur anjing yang
diovulasikan, akan bertahan hidup di oviduk untuk
periode yang lama dengan sedikit atau tidak ada
ekspansidari sel kumulus untuk periode waktu yang
lama dengansedikit atau tidak ada ekspansidari sel
kumulus dan sel Korona.radiata tetap menempel
sampai setelah setelah fertilisasi. Oleh karena itu,
dibutuhkan cara pendekatan berdasarkan pada
kondisi linglcungandari oviduk untuk pemasakansel
telur anjing di luar tubuh. Oviduk mengeluarkan
berbagaikomponen termasuk ion, vitamin, protein
dankarbohidrat,hanya cairan oviduk, sel oviduk dan
cairan oviduk buatanyang digunakan sebagaimedia
atau media tambahan (Hewit dan England 1998;
Bolombadkk .,2002;Luvoni dkk., 2003).
Perlu dilakukan penelitian unhrk mengetahui
pengaruh dari penambahansemm sapi pada media
terhadapprosespertumbuhan dan pemasakanoosit
anjing pada berbagai stadium estnrs secarain vitro
karenaserum sapi adalahbahanyang mudah didapat
dan banyak mengandung nutrisi yang diperlukan
sepertiyang terdapatpadacairan oviduk.
MATERI DAN METODE
Bahan penelitian. Bahan-bahanyang digunakan
dalam penelitian ini antara lain ovarium anjing
betina sehat,0,9 % NaCl; PBS (PhosphateBuffered
Saline); Penicillin dan streptomycin (Sigma, USA);
tissueculturemedium(TCM)-199 (Gibco,USA); 25
mM Hepes (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineetha-
nesulfo ni c aci d) ; Ho echst33342 ( Sigma, USA).
Peralatanyang digunakan dalam penelitian ini
antara lain cawan petri, skalpel, gunting, pinset,
termometer,termos penyimpan ovarium, mikroskop
stereolinverted dengan fluorescen, mikropipet,
inkubatorCOr.
Pembuatan10% Serum Sapi. Semm dibuat dari
dalah sapi yang diambil dari nrmah potong hewan.
Darah tersebutdibekukan hingga terpisah antarazat
padat yang terkandung di dalam darah dengan
cairannya. Serum kemudian difilter dengan
menggunakanmikrofi lter ukuran 0,45pm, disignpan
dalam tabung ependorf 1,5 mL, dan dibekukan
dalam freezer untuk digunakan sewaktu-waktu
dalam pembuatanmedia kultur.
Koleksi ovarium dilalcukan dari anjing betina
sehat,umur lebih dari 6 bulan yang diperoleh setelah
operasi ovariohisterektomi pada klinik praktek
dokter hewan. Saluran peranakanditempatkan pada
larutan 0,9 oANaCl yang telah ditambah penicillin
dan streptomycin kemudian dimasukkan ke dalam
termos dengan temperatur sekitar 35-37 oC,
selanjutnyadibawa ke laboratorium. Stadium siklus
estrus dievaluasi berdasarkan penampakan
gambaranluar dari ovarium setelahovarium tersebut
diambil dari saluran peranakannya,terlihat adanya
satuataulebih follikel (diameter2-10 mm), Diestrus
(fase luteal), terlihat adanya sahr atau lebih korpus
luteum.
Koleksi sel telur dilakukan dengan caraovarium
diambil dan dicuci beberapa kali dengan PBS.
Koleksi oosit dilakukan denganmetodepencacahan.
Metode pencacahan dilakukan dengan cara
mencacah ovarium dengan menggunakan skalpel
pada suhu ruangan dalam medium tissue culture
medium (TCM)-199 dengan 25 mM Hepes, 1 o/o
larutanp eni ci I I in -strep t omyci n. Ko leksi dan seleksi
oosit dilakukan di bawah mikroskop dan hanya oosit
grade satu yang digunakan untuk bahan penelitian.
t7
J. Sain Vet. Vol. 29 No, I Th. 2011
Klasifikasi kLralitasoosit yang dipakai berdasarkan
metodeHewitt(1997),yang membagimenjadi3 tipe
kelas, yaihr: grade l) oosit berwarna gelap dan
sepenuhnyadikelilingi oleh satu atau lebih lapisan
sel kumulus; grade 2) oosit transparan dengan
lapisan sel kumulus yang tidak sempurna;grade 3)
oosit pucat, tidak utuh, dan tanpa lapisan sel
kumulus.
Oosit hasil koleksi dicuci tiga kali untuk
selanjutnyadikultur pada mediurn TCM-199 tanpa
penambahanserum(sebagaicontrol) dan TCM-199
yang telah ditambahkan serum sapi 10%. Sel telur
diinkubasikan pada inkubator dengan suhu 38oC,
kelembabanadara5%oCO dan5o/oO, selama72j am.
"
Setelahinkubasi, sel telur dilepaskan dari kumulus
dengancaraberulangkali memipet selama10 menit
dalam Tissue Culture Medium (TCM)-199 yang
mengandung 0,5 mg/mL hyaluronidase. Sel telur
yang telah hilang kumulusnya difiksasi
menggunakan cairan formaldehyde-Triton X-100
(Sigma, St Louis, MO) selama 15 menit dan dicuci
denganPBS.Seltelur dipindahkanke deckglassdan
dicat dengan i,9 pM Hoechst 33342 (Sigma, St
Louis, MO) dalam gliserol (Sigma, St Louis, MO).
Status kromatin dan posisi spindle dan migrasinya
diamati di bawah lampu UV untuk menentukan
stadium meiosis ciariperkembangansel telur seperti
stadium Germinal Vesicle (GV), Germinal Vesicle
Breakdown(GVBD), MetafaseI (MI),I\{etaphaseII
(Mrr).
l8
Data penelitian dianalisa dengan menggunakan
metode ANOVA, sedangkan analisa pencapaian
perkembangan meiotik menggunakan metode chi-
souare.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kemampuan perkembangan oosit diperoleh
hasil pada stadiumproestrusyang mencapaistadium
Metafase I (MI) rnenggunakan media yang
ditambahkan serum sapi 10% sebesar46,50/0untuk
pada media yang tidak ditambahkan serum hanya
mencapaiI2,5oA.Sedangkanoosit yang degenerasi
setelahdiamatimencapai5o/o.Pada
stadiumdiestrus
diperolehstadiumMI mencapai34,8o/o
pada media
yang ditambahkanserumsapi 10% dan24,5%opada
media yang tidak diberi serum sapi, tidak nampak
adanya oosit degenerasi. Pada stadium anestrus,
perkembangan oosit mencapai stadium MI
menggunakanmedia yang ditambahkan serum sapi
10% sebesar29,4%odan pada media yang tidak
ditambahkanserumhanya mencapaistadiumGVBD
sebesar88,9ohdan tidak terlihat adanya oosit yang
degenerasi. Penambahan serum sapi l0o/o pada
media kulttu memberikan perkembangan meiosis
yang lebih tinggi (P<0,05) dalam mencapai stadium
MI daripadakontrol dan oosit dari stadiumproestrus
mempunyai kompetensi meiosis yang lebih tinggi
(46,5%) dipitaingoosit dari anestrus(29,4o/o)
secara
signifikan (P<0,05), tetapi tidak berbeda nyata
(P>0,05)denganstadirundiestrus(34,8%)(Tabel1).
Yuda Heru Fibrianto. Pengaruh PenambahanSerum Sapi pada Media Kultur terhadapKompetensi Meiosis Oosit Anjing ...

Tabel1. Kompetensimeiotik oosit anjing dari berbagaistadiumestrusyang ditanam pada media kultur yang ditambahr
l0%oserumsapi

Stadium Media Stadium maturasi inti sel

oosit GV MI- Degene

MII rasi
Proestnrs tanpa serum 40 25% 57,5Yo 12,soha 5%
10%Serum 58 l0,3yo 34,4o4 46,5Yob 8,6yo
sapi
Diestrus tanpa serum 45 22,2% 53,30/o 24,5Yoa

10%Serum 69 17,4oh 34,lyo 34,8Yoa 8,1yo

sapi
Anestrns tanpa serLrm l8 ll,lyo 88,9%o

lO%Serum l7 9,4o 4l ,2oA 29,4o/oa

sapi

Ket.: "'osuperscripyang berbeda menunjukkan perbedaanyang signifikan (P<0,05), GV: Germinal Vesikel; GVBD:
GerminalVesikelBreakDown, MI: MetafaseI; MII: MetafaseII

Mekanisme reproduksi anjing betina berbeda
denganmekanismepada mamalia yang lain. Oosit
anjing diovulasikan pada stadium Germinal Vesikel
dan membutuhkan waktu 2-5 hari untuk mencapai
pemasakanyang sempurna,sedangkanmamalia lain
sel telur diovulasikan dalam keadaan masak
(stadiummetafaseII) dan siap untuk dibuahi. Martin
dkk. (2006)menunjukkanbahwa oositpadastadium
estrus,oosit yang dikultur berkembang secaracepat
mencapaiMI denganpersentase15,3yo.Konsentrasi
plasmaprogesterondalam anjing betina meningkat
selama fase proestrus sebagaimanawaktu puncak
estradiol.Concanondkk. (1975) menyatakanbahwa
oosit dalamkondisi progesteronyang tinggi sebelum
ovulasi.
Banyak macam serum yang telah digunakan
sebagai zat penambah untuk mendapatkan
lingkungan yang maksirnal sebagaimana kondisi
dalam lingkungan oviduk, tempat oosit diovulasikan
seearain vivo. Serum anak sapi atau serum anjing
estrus dengan konsentrasi yang bermacam-macam
telah dilaporkan digunakan (Mahi dan Yanagimachi,
1976; Yamada dkk., 1992; Nickson dkk., 1993;
Hewitt dan England, 1998). Fetal bovine serum
hanyamendukungkehidupanoosit dalammediajika
konsentrasinya lebih dari l0% dengan tidak
memberikan efek.yang menguntungkan terhadap
maturasi.Namun Bolamba dkk. (2002) melaporkan
bahwa penambahan serum anak sapi dengan
albumin serum sapi pada media sederhana
menunjukkan tidak essential untuk membantu
pemasakanoosit anjing secarain vit ro.
Perpitaingan antara penambahan serum ajing
estrus dengan serum sapi estrus menunjukkan
perpitaingan tingkat perrtumbuhan lebih baik untuk
serum anjing estrus (10,40 : 4,2o/o) dalam
pencapaianstadium Metafase I (MI). Penambahan
serum pada media memberikan pengaruh yang
bermacam-macam: serum anjing estrus(CES) dapat
meningkatkan pengaruh dari maturasi oosit
(Otoi,1999) sedangkan dilaporkan tidak
memberikan pengaruh pada penelitian yang lain

l9
J. Sain Vet. Vol.29 No, I Th, 2011
(Rodrigues dkk., 2003); penambahan0,3% BSA
(bovine serum albumin) secara langsung
rnemberikan hasil yang lebih baik dari pada serum
anak sapi, dan dengan konsentrasi semm 200%
merupakan penambahan paling optimal untuk
penanaman96 jam (Hewitt dan England, 1998);
keberadaandari semm bermanfaatuntuk menceqah
terjadinya pengerasanzonapelusida.
Ketidakpastian hasil dari penambahan semm
dikarenakan darah mempunyai kandungan tidak
hanya protein, disamping komponen protein
(albumin), beberapahormon seperti gonadotrophin,
steroid, dan factor perhrmbuhan atau sitokin. Hal
inilah yang menyebabkan alasan sulitnya
menentukan senyawa spesifik yang memberikan
efek positif pada maturasi ooosit anjing (Luvoni
dkk., 2005). Mungkin kadar hormon atau protein
yang ter(andung pada serum sapi yang diigunakan
tidak mempunyai konsenffasi yang cukup untuk
pelkembanganmaturasi oosit anjing. Kemungkinan
lain yang bisa terjadi adalah pencampuran
pencampuralldari faktor-faktor yang terkandung di
dalam serum sapi sehinggamendapatkanhasil yang
kurang maksimal, sehingga salah satu faktor dapat
bersifat menghambatbagi faktor yang lain.
Protein dalam serum mempunyai pengaruh
terhadap perkembangan oosit karena kandungan
growth faktor yang terikat bersamanya. Dengan
kapasitasyang cukup, albumin serum menyebabkan
inaktivasi metabolismetoksik dari produksi oksigen
radikal bebas dan mempersatukankomponen yang
lain, seperti steroid, vitamin, asam lemak (Luvoni
dkk., 2004). Penambahan dan ketersediaan yang
baik EGF murni meningkatkan hasil IVM dan dapat
berpengaruh terhadap tingkat fertilisasi dan
pembelahansel pada berbagai spesies(Cui dkk.,
20
2005). Namun, hal yang berbeda ditunjuldcan oleh
Cui dkk. (2005) yang melaporkan bahwa
penggantian serum dengan BSA dapat
meningkatkan oosit degeneratif setelah IVM.
Kondisi ini mungkin disebabkan karena BSA dan
FBS yang dijual dipasaranmengandungbeberapa
material yang tidak diketahui secarapasti yang dapat
berpengaruhterhadaphasil penelitian.
Oosit dipilih dari berbagai stadium estmskarena
adanya dugaan bahwa stadium estrus berpengaruh
terhadap tingkat maturasi inti oosit anjing yang
dimungkinkan karena besarnya fluktuasi dari
reseptor estrogen dan progesteron selama siklus
reproduksi akan memberikan perbedaan yang
signifikan dalam tingkat IVM. Hasil penelitian
menunjukkan adanya hubungan yang signifikan
antarastadium siklus estfus terhadapperkembangan
oosit anjing yang dimasakkan secara in vitro.
Stadium proestnrs mempunyai persentase yang
paling besar untuk mencapai stadium MI
dipitaingkan stadium yang lain. Hubungan atau
komunikasi antar sel merupakanhubunganantarasel
kumulus dan oosit yang memfasilitasi perpindahan
nutrisi, ion dan molekul kecil yang lain sepertiCa'*
dan cAMP (Rodrigrresdkk., 2002). Hubungan ini
tidak ditemukan selama masa anestrus.Sehingga
oosit yapg ditanam berasal dari stadium anestnrs
mempunyai kemungkinan kecil untuk rnencapai
pembelahanmeiotik (Luvoni dl*., 2001). Padadata
menunjukkan kesesuaiandistribusi stadium anestrus
mempunyai persentase paling rendah jika
dipitaingkan denganstadium yang lain (88,9% untuk
kontrol dan 24,9%a pada perlakuan) tingkat
perkembangan proestrus yang tinggi mungkin
disebabkanketersediaand ari gabj unction yang telah
terbuka saat perkembangan oosit di dalam folikel.
Yuda Heru Fibrianto. PengaruhPenambahanSenrm Sapi pada Media Kultur terhadapKompetensi Meiosis Oosit Anjing ...
Pelepasanoosit dari folikel tidak selalu dalam
stadium GV hal ini sesuaidenganpenelitian Fujii
dkk., 1999 bahwa terdapat l% (l oosit) dari
pemasakaninti langsungke stadiumMI.
Pada tabel 1 terlihat oosit yang mengalami
degenerasi,pada stadium proestms mencapai 5%o
pada rnedia TCM-199 tanpa serum, sedanguntuk
mediayangditambahkanserummencapai8%. Pada
stadium diestnrs hanya media dengan penambahan
serllm yang menunjuldcan terjadinya degenerasi
oosit. Banyak peneliti yang menyatakantingginya
tingkat degenerasipada oosit anjing terjadi sejak
pengkoleksian, dan setelah kultur (Hewitt dan
England, 1998; Theiss,2001). Hewitt dan England
(1998) melaporkan bahwa efek negatif dari
penggunaan serum dapat meningkatkan tingkat
degenerasi oosit, sehingga dimungkinkan
degenerasiyang terjadi pada stadium proestrus dan
diestrus terjadi karena penambahan serum pada
media.
senrmsapipadamedia TCM
Penambahan100%
199 pada maturasi in vitro oosit anjing secara
keselunrhan tidak memberikan perbedaan yang
signifikan dipitaingkan dengan kontrol, hanya
mempunyai makna pada stadium proestrus dan
anestrus(P<0,05). Jumlah dan persentaseoosit pada
tiap stadium perkembanganmeiosis tergantungdari
stadiumsiklus estms.Baik penambahanI}Yo senrm
maupun kontrol memberikan hasil yang berbeda
pada persentase perkembangan stadium meiosis
tiaptiap stadiumsiklus estrus.
UCAPAII TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada
Direktur PHKA2 FakultasKedokteran Hewan tahun
2007 yang telah membiayai penelitian ini dengan
dana PHKA2 Bacth I, sehingga penelitian ini
berjalandenganbaikdan lancer.
DAFTAR PUSTAKA
Bogliolo,L,,ZedaM.T.,LeddaS.,Leoni G.,Naitana
S., Pau S. 2002. Influence of co-culture with
oviductal epithelial cells on in vitro mafuration
of canineoocytes.ReprodNutr D ev 42:265-273 .
Bolamba, D., Borden-Russ, K.D., Durrant, B.S.
1998. In vitro mahrration of domestic dog
oocytescultured in advancedpreantral and early
antralfollicl es.Theriogenologt 49 :933-42.
Concannon,P.W.1991. Reproductionin the dog and
cat. In: Cupps PT, editor. Reproduction in
domesticanimals.4thed. SanDiego:Academic
PressInc.:5l7-54.
Concannon,P.W., Cowan, R., Hansel,W. 1979.LH
ReleaseIn OvariectomizedDogs In Response
To EstrogenWithdrawalAnd Its Fasilitation By
Proesterone. Biol Repro I 7: 604.
Cui, X.S, Jin,Y.X., Shen,X.H., Lee, J.Y.,Lee,H.S.,
Yin, X.J., Kong, I.K., Kim, N.H. 2006.
Epidermal growth factor enhances meiotic
resumptionof canineoocytesin the presenceof
BSA. Theriogenology 66: 2 67-2 74
Fujii, M., Otoi, T., Murakami, M., Tanaka,M.,IJne,
S., Suzuki, T. 2000. The quality and maturation
ofbitch oocytesrecoveredfrom ovariesby the
slicing method.J VetMed Sci.62(3):305-7.
Hewitt, D.A., England, G.C.W. 1998.The effect of
oocyte size and bitch age upon oocyte nuclear
maturation in vitro. Theriogenology 49:957-
966.
Hewitt, D.A. 1997. Oocyte Maturation and
Fertilisation in the Bitch; The Use of In Wtro^
CuI ture. PhD Thesis,University of London.
Hyu., S.H.,Lee,G.S,Kim, D.Y.,Lee,S.H.,Kim, S.,
Lee, E.S., Lim, J.M., Kang, S.K., Lee, 8.C.,
Hwang, W.S. 2003. Effect of maturationmedia
and oocytes derived from sows or gilts on the
2l
J, Ssin Vet.Vol.29 No. I Th. 2011
development of cloned pig embryos.
Theri ogenoIogy 59: | 64 | - | 649.
Lanza,R.P.,Cibelli J.B., West,M"D. 1999.Human
therapeuticcloning.Nat Med 5:975-7.
Lee, B.C., Kim, M.K., Jang,G., Oh, H.J., Fibrianto,
Y., Kim, H.J., Hossein,M.S., Kim, J.J.,Kang,
S.K., Schatten,G., Hwang, W.S. 2005. Dogs
cloned from adult somatic cell.Nature: 436-64l
Luvoni, G.C., Chigioni, S., Allievi, 8., Macis, D.
2003. Meiosis resumption of canine oocytes
cultured in the isolated oviduct. Reprod Dom
Anim38(5):410-414.
. 2004.Factorsinvolved in vivo and
in vitro maturation of canine oocytes.
Theriogenolo9,, 63:41-59.
. 2005. Factorsinvolved in vivo and
in vitro maturation of canine oocytes.
Theriogenology63: 4I -5 9
Luvoni, G.C., Luciano,A.M., Modina, S., Gandolfi,
F. 2001. Influence of different stages of the
oestrous cycle on cumulus-oocytes on the
effrcieny of in vitlo maturation. J. Reprod Fertil
Suppl57:14l-146.
Mahi, C. A., Yanagimachi,R. 1976.Maturation and
SpermPenetrationof Canine Ovarian Oocyte In
Vitro. -r.Exp. Zoo., 196:189-196.
Martins,L.R, Ponchirollil C.B.,BeierS.L.,Landim-
Alvarenga,F.C.,Lopes,M.D.2006. Analysis of
NuclearMaturationin InVitro MaturedOocytes
From Estrous and Anestrous Bitches. Anim.
Reprod.,v.3,n.l :49-54.
Nickson DA, Boyd JS, EckersallPD, FergusonJM,
Harvey MJA, Renton, J.P. 1993. Molecular
biological methods for monitoring oocyte
maturation and in vitro fertilization in bitches.-I
ReprodFertil Sttppl 47: 23 I -4 0.
Otoi I Willingham L, Shin T, Kraemer DC,
Westhusin M. 2002. Effect of oocyte culture
densityon meiotic competenceofcanine oocyte.
ReproductionI 24: 775-7B1.
Rodrigues, 8.A., Rodrigues, J.L. 2002. Maturation
of canine oocytes in TCM-199 supplemented
22
with different proteins. In : Proceedingsofthe 3'"
European Veterinary Society of Small Animal
ReproductionCongless,2002, Liege, Belgium.
Liese:EVSSAR:94-95.
2002. Meiotic responseof in vitro
maturated canine oocytes under heterologous
hormonsupplementation.In : Proceedingsofthe
3'oEuropeanVeterinarySocietyof SmallAnimal
ReproductionCongress,Liege, Belgium. Liege :
EVSSAR:58-159.
. 2003. Influence of reproductive
status on in vitro oocyte maturation in dogs.
Theriogenologt 60:9-66.
Saha,S., Shimizu, M., Geshi,M., Izaiki, Y. 2000. In
vitro culture of bovine preantral follicle. Anim
ReprodSci 63:27-39.
Songsasen,N, D.E. Wildt. 2007. Oocyte Biology
And Challenges In Developing In Vitro
Maturation Systems In The Domestic Dog.
Animal reproduction Science98:2-22
SrsenV, Kalous J, Nagyova E, Sutovsky P,King WA,
Motlik J. 1998. Effects of follicle stimulating
hormone, bovine somatotrophin and. okadaic
acid on cumulus expansion and nuclear
maturation ofblue fox (Alonex lagopus)oocytes
invitro. Zygote6:299-309.
Telfer E, Gosden RG. 1987. A quantitative
cytological study of polyovular follicles in
mammalianovarieswith particular referenceto
the domesticbitch (Canis familiaris). J Reprod
FertilSl:13747.
TheissT. l99T.Investigationson the collection,in
vitro maturation and -fertilization of dog
oocytes. Thesis. Tierartzliche Fakultat der
Ludwig-Max&i&n Universitat Munich.
Tsutsui T. I989.Gamete physiology and timing of
ovulation and fertilization in dogs. -/ Reprod
Fertil 39:269-275.
Yamada,S.,Shimazu,Y., Kawaji, H., Nakazawa,M.,
Naito, K., Toyoda, Y. 1992. Maturation,
fertilization, and development of dog oocytesin
vitro. Biol Reprod 46:853-858.