LBM 3

Upgrade Hasil Uji in vitro ternyata rumit ya

Step 1

In vitro = uji coba pd sebagian organ hewan coba yg dilakukan pada cawan petri;
Bertujuan untuk membuktikan efek obat atau ekstrak herbal pada organ yg terisolasi.

In vivo = uji coba pada seluruh organ hewan coba.

Step 2

1. Macam-macam desain penelitan dan kapan menentukan nya?

2. Apa saja kelebihan dan kekurangan in vivo?
3. Apa saja kelebihan dan kekurangan in vitro?
4. Bagaimana cara menentukan subjek uji in vivo?
5. Apa uji analisis dari metode in vivo dan in vitro?
6. Bagaimana parameter yg diukur dari uji in vivo dan in vitro?
7. Bagaimana tahap uji farmakologi in vivo?
8. Apa saja pertimbangan untuk membuat desain penelitian di uji farmakologi?
9. Apa saja contoh contoh uji in vitro?
10. Bagaimana tahap uji toksikologi in vivo?

Step 3

1. Macam-macam desain penelitan dan kapan menentukan nya?

Eksperimental ada perlakuan
- Pre post sebelum dan setelah perlakuan
- Post test
- Cross over  individu yg sm mendapat kontrol dan perlakuan kemudian disilangkan
- Paralel hanya ekstrak saja atau kontrol saja.

True membandingkan antara perlakuan dg kontrol (sebab akibat)

Kuasi tdk dibandingkan dengan kontrol

Observasional menganalisis
- Kohort diamati prospektif
- Case kontrol dari kasus diruntut ke belakang faktornya
- Cross sectionaldalam satu waktu
2. Apa saja kelebihan dan kekurangan in vivo?
Kelebihan :
- Struktur nya lebih utuh metab dan faal nya mirip
- Dapat melihat efek zat yg kita lihat secara keseluruhan multi organ failure,
rx.biokimia
- Farmakokinetik dan farmakodinamik bisa dilihat

Kekurangan :

- Mahal
- Dibutuhkan sampel banyak (miniman 2 spesies rodent dan non rodent
menggambarkan fisiologi dan patologi manusia)
- Butuh syarat-syarat tertentu sesuai dengan penelitian
- Menyakiti hewan coba
- Tidak bisa melihat secara molekuler (irrepresentative) perubahan2 reseptor???
Penelitian Molekuler???Batasannya/definisinya apa?
- Selama penelitian harus diperhatikan variabel perancunya

3. Apa saja kelebihan dan kekurangan in vitro?

Kelebihan
- Perlakuan akan lebih terfokus
- Kontrol lebih baik
- Interpretasinya lebih jelas
- Murah dan cepat
- Sampel lebih sedikit

Kekurangan
- Hanya bisa meneliti satu organ saja
- Hanya bisa farmakodinamik

Contoh in vitro selain organ? Urin hasil ekskresi, fertilisasi in vitro, mikrobiologi (uji
antibiotik terhadap bakteri)

4. Bagaimana cara menentukan subjek uji in vivo?

- Mencari hewan uji yang sehat pergerakan hewan uji nya
- Reproduksi cepat
- Makan dan minum mudah
- Mudah di kendalikan
- Disesuaikan spesiesnya dg tujuan penelitian : mau yg seperti apa? Misalnya mau
darah: mencit iml, tikus 5 ml, kelinci 10ml agar sampel bisa terpenuhi
- Berat badan  recovery eritrosit
- Jenis sampel: apakah serum; urin tikus, kelinci
 - Anatomi dan faal mirip manusia

5. Bagaimana parameter yg diukur dari uji in vivo dan in vitro?

In vivo :
Disesuaikan tujuan penelitian nya :
- Anti inflamasi  di induksi karagen (tikus udem)  penilaiannya : udem
berkurang / tidak, indikator lain anti inflamasi??
- Analgesik  menggeliat, indikator lain?
- Hepatoprotektor  sgot sgpt, histopatologi, indikator lain?
- Antidiabetes glukosa darah

Studi pustaka...

In vitro:
- Antibakteri: Isolasi bakteri beberapa misal s.aureus ditetesi ekstrak bixin
kemudian dilihat zona hambatnya
- Antioksidan asetondiukur DPPH? Larutan DPPH 0,1 mmol, metanol 90 ml, 1
ml aseton.

6. Apa uji analisis data dari metode in vivo dan in vitro?

Bergantung dari tujuan penelitian nya
Perbedaan uji beda
Skala yg diukurkadar?kesakitan ya-tidak?
Kelompok 2 kelompok atau lebih?
Desain berpasangan (pre post); tidak berpasangan (post test only control group
design)
Contoh dari masing2 yg kita teliti(tujuan, desain, skala, kelompok, uji analisisnya)?satu
satu yaa.

7. Bagaimana tahap pengembangan tanaman obat?

Apa yg tergambar dlm alur penelitian?pemilihan sampel....

8. Apa saja pertimbangan untuk membuat desain penelitian di uji farmakologi?

- Tujuan
- Prevalensi
- Waktu
- Biaya
- Sumber daya
- Subjek penelitian banyak sedikitnya subjek; berkaitan dengan banyaknya darah yg
diambil mencit: post test only saja (agar tidak mati sebelum diteliti)
 Kenapa pilihnya post test? Kenapa pilihnya cross sectional?

9. Apa saja contoh contoh penelitian uji in vitro?

Misalnya pengaruh ekstrak mahkota dewa terhadap dobbling time (pembelahan) sel
kanker payudara MCF7
Cara pengukurannya kultur sel berikan ekstrak dihitung < 5 menit sel yg mati
Yg diukur waktu pembelahan?

Sel hella Ca cerviks contoh penelitiannya?

10. Bagaimana tahap(langkah) uji toksikologi in vivo?

Toksisitas akut menentukan LD 50 misal pada ikan sehat atau tidak ikan nya (dari
pergerakannya) jumlah sampel nya tiap kelompok (misalnya 10 ekor) beri perlakuan
misalnya dengan alkohol 70%, dosis disesuaikan dengan kelompok perlakuan lihat
efeknya selama 5 menit berapa yg mati.

Step 4

Concept Mapping

Tujuan Penelitian

Uji Farmakologi

Farmakodinamik Farmakokinetik

In vitro In vivo
Subjek penelitian
Prevalensi
Desain penelitian Waktu
Biaya
Sumber daya
Skala Analisis data
STEP 7

1. Macam-macam desain penelitan dan kapan menentukan nya?

Metode penelitian survei deskriptif

Survey deskriptif didefinisikan suatu penelitian yang dilakukan untuk mendeskripsikan
atau menggambarkan suatu fenomena yang terjadi di dalam masyarakat.
Dilakukan terhadap sekumpulan objek yang biasanya bertujuan untuk melihat gambaran
fenomena (termasuk kesehatan) yang terjadi di dalam suatu populasi tertentu. Pada
umumnya survei deskriptif digunakan untuk membuat penilaian terhadap suatu kondisi
dan penyelenggaraan suatu program dimasa sekarang, kemudian hasilnya digunakan
untuk menyusun perencanaan perbaikan program tersebut.

Metode penelitian survey analitik

Adalah survey atau penelitian yang mencoba menggali bagaimana dan mengapa
fenomena kesehatan itu terjadi. Kemudian melakukan analisis dinamika korelasi antara
fenomena atau antara faktor risiko dengan faktor efek. Secara garis besar, survei analitik
dibedakan menjadi 3 pendekatan, yaitu cross sectional,case control, dan cohort.
1. Rancangan survei cross sectional
Ialah suatu penelitian untuk mempelajari dinamika korelasi antara faktor-faktor
risiko dengan efek,dengan cara pendekatan, observasi atau pengumpulan data
sekaligus pada suatu saat. Artinya tiap subjek penelitian hanya diobswrvasi sekali
saja dan pengukuran dilakukan terhadap status karakter atau variabel subjek pada
 saat pemeriksaan. Hal ini tidak berarti penelitian dilakukan dalam waktu yang
sama. Metode penelitian ini yang paling lemah karena paling mudah dilakukan
dan sangat sederhana.

Ratio prefalensi : angka yang menggambarkan prevalensi dari suatu penyakit

dalam populasi yang berkait dengan faktor resiko yang dipelajari atau timbul
sebagai akibat faktor resiko tertentu.

2. Case Control
Faktor resiko dipelajari dengan menggunakan pendekatan retrospektif, efek
diidentifikasi dahulu, baru faktor resiko dipelajari secara retrospektif
Odd ratio : perhitungan risiko relatif secara tidak langsung

3. Rancangan Penelitian Kohort (prospektif)

Suatu penelitian non eksperimen yang paling baik dalam mengkaji hubungan
antara faktor risiko dengan efek.
 Suatu penelitian yang digunakan untuk mempelajar dinamika korelasi antara
faktor risiko dengan efek melalui pendekatan longitudinal ke depan atau
prospektif. Artinya faktor risiko yang akan dipelajari diidentifikasi dulu kemudian
diikuti ke depan secara prospektif timbulnya efek, yaitu penyakit atau salah satu
indikator status kesehatan.

Metode penelitian eksperimen

Rancangan penelitian eksperimen dikelompokkan menjadi 3, yakni:
- Rancangan-rancangan praeksperimen (pre experimental designs)
- Rancangan-rancangan eksperimen sungguhan (true experimental designs)
- Rancangan-rancangan eksperimen semu (quasi experimental designs)
 1. Rancangan Praeksperimen
a. Post test only design
Dalam rancangan ini perlakuan atau intervensi telah dilakukan (X), kemudian
dilakukan pengukuran (observasi) atau postest (02). Hasil observasi ini hanya
memberikan informasi yang bersifat deskriptif. Dalam rancangan ini sama sekali
tidak ada kontrol dan tidak ada internal validitas. Sifatnya cepat dan mudah.
Tidak memiliki dasar untuk melakukan perbandingan sehingga kesimpulan dapat
menyesatkan.

Eksperimen Post test

X 02

b. One group pretest - post test

Juga tidak memiliki pembanding (kontrol), tetapi paling tidak sudah dilakukan
observasi pertama (pretest) yang memungkinkan menguji perubahan yang terjadi
setelah adanya eksperimen (program). Kelemahan rancangan ini antara lain tidak
 ada jaminan bahwa perubahan yang terjadi pada variabel dependen karena
intervensi atau perlakuan.

Pre test Perlakuan Post test

01 X 02

c. Static group comparison (Perbandingan kelompok statis)

Seperti rancangan pertama hanya bedanya menambahkan kelompok kontrol atau

kelompok kontrol atau kelompok pembanding. Kelompok eksperimen menerima
perlakuan (X) yang diikuti dengan pengukuran kedua atau observasi (02). Hasil
observasi ini kemudian dikontrol atau dibandingkan dengan hasil observasi pada
kelompok kontrol, yang tidak menerima program atau intervensi. Beberapa
kelemahan seperti history, maturation, testing, dan instrumentation dapat
dikontrol walaupun tidak dapat diperhitungkan efeknya.

Perlakuan Posttest

Kelompok eksperimen X 02

Kelompok kontrol 02

1. Rancangan eksperimen sungguhan (True Eksperimen)

a. Rancangan Pretest Posttest dengan kelompok kontrol (Pretest-Posttest with
control group)
Dalam rancangan ini dilakukan randomisasi, artinya pengelompokkan anggota-
anggota kelompok kontrol dan kelompok eksperimen dilakukan berdasarkan acak
atau random. Kemudian dilakukan pretest (01) pada kedua kelompok tersebut dan
diikuti intervensi (X) pada kelompok eksperimen. Setelah beberapa waktu
dilakukan posttest (02), pada kedua kelompok tersebut. Dengan randomisasi,
maka kedua kelompok mempunyai sifat yang sama sebelum dilakukan intervensi
(perlakuan). Rancangan ini adalah salah satu rancangan yang terkuat dalam
mengontrol ancaman-ancaman terhadap validitas.
Tetapi rancangan ini sulit dilakkan di lapangan karena sulit atau bahkan tidak
mungkin dilakukan randomisasi. Di samping itu dari segi etika dan aspek lain,
 sering tidak mungkin melakukan intervensi pada kelompok yang satu dan tidak
melakukan intervensi pada kelompok yang lain.

Pre test Perlakuan Posttest

R (Kelompok eksperimen) 01 X 02
R (kelompok kontrol) 01 X 02

b. Rancangan Randomized Salomon Four Group

Dapat mengatasi kelemahan eksternal validitas yang ada pada rancangan
randomized control group pretest postest. Apabila pretest mungkin mempengaruhi
subjek sehingga mereka menjadi lebih sensitif terhadap perlakuan (X) dan mereka
bereaksi secara berbeda dari subjek yang tidak mengalami pretest, maka eksternal
validitas terganggu dan kita tidak dapat membuat generalisasi dari penelitian itu
untuk populasi. Rancangan ini dapat mengatasi masalah dengan menambah
kelompk ke 3 (dengan perlakuan tanpa pretest) dan ke 4 (tanpa perlakuan, tanpa
pretest)
Pretest Perlakuan Posttest
R ( Kel. Eksperimen) 01 X 02
R. (Kel. Kontrol) 01 02
R. (Kel. Kontrol)
X 02
R. (Kel. Kontrol)
02

c. Rancangan penelitian postetst dengan kelompok kontrol (Posttest only control

group)
Tidak diadakan pretest, kasus telah dirandomisasi baik pada kelompok kontrol
maupun eksperimen.
Perlakuan Posttest
R (Kelompok Eksperimen) X 02
R (Kelompok Kontrol) 02

2. Rancangan eksperimen semu (Quasi Experiment Design)

Disebut eksperimen semu karena eksperimen ini belum atau tidak mempunyai ciri-ciri
eksperimen sebenarnya, variabel-variabel yang seharusnya dikontrol atau
 dimanipulasi tidak dapat atau sulit dilakukan. Oleh karena itu, validitas penelitian
menjadi kurang cukup untuk disebut eksperimen yang sebenarnya. Perbedaan utama
antara penelitian sungguhan (true) dengan eksperimen semu terletak pada
randomisasinya.

(Soekidjo. 2012. Metodologi Penelitian Kesehatan. Jakarta: Rineka Cipta)

(Ahmad, Watik. 2000. Dasar – Dasar Metodologi Penelitian Kedokteran & Kesehatan.
Raja Grasindo Persada: Jakarta)
(http://file.upi.edu/Direktori/FIP/JUR._PEND._LUAR_BIASA/195602141980032-
TJUTJU_SOENDARI/Power_Point_Perkuliahan/Eksperimen/disain__EKSPERIMEN.pp
t_%5BCompatibility_Mode%5D.pdf)

2. Apa saja kelebihan dan kekurangan in vivo?

- Tidak bisa melihat secara molekuler (irrepresentative) perubahan2 reseptor???
Penelitian Molekuler???Batasannya/definisinya apa?

Advantages of animal experiments

Advantages usually the same as for clinical studies, but :
 A large number of animals can be studied (contrary to humans)
 Relatively cheap compared to clinical studies
 More invasive procedures can be used to investigate biological effects from
exposure to electromagnetic fields
 Chronic exposure can be studied (e.g., life-time exposures of mice and rats)
 Specific animal models can be used (e.g., extra sensitive strains, genetically modified
animals, …)

Limitations of animal experiments

It is indeed difficult to extrapolate the results of animal studies to the case of actual
human exposure. Animals are not humans and the biological effects observed in the
animal are obtained under very specific experimental conditions.
Here are some limitations that prevent results in animals to be automatically
transposed in humans:
 Applied doses are not always equivalent between species
 Differences in life expectancy
 Differences in size
 Differences in diet
 Differences in genetic variability
 Differences in amount of antioxidants
 Ethical problems
 (http://www.bbemg.be/en/elf-emf-and-health/study-methods/info-invivo-
studies.html)

In vivo :
Terletak di dalam tubuh manusia  digunakan hewan utuh dan kondisi hidup (baik
sadar atau teranestesi)
dalam lingkungan yang terkendali
Syarat hewan yg digunakan sangat banyak tgt jenis obatnya, missal yang jelas harus
dilakukan control terhadap galur/spesies, jenis kelamin, umur, berat badan
(mempengaruhi dosis)
harus dilakukan pada minimal 2 spesies yakni rodent/hewan mengerat dan non
rodent. Alasannya krn system fisiologi dan patologi pada manusia merupakan
perpaduan antara rodent dan non rodent.

kekurangan
Kebutuhan sample yang digunakan lebih banyak
Mahal dan lama
(http://chemedu09.wordpress.com/2012/05/23/apa-sih-bedanya-antara-in-vivo-in-
vitro-dan-ex-vivo/)

3. Apa saja kelebihan dan kekurangan in vitro?

Terletak di dalam suatu system tetapi di luar tubuh manusia
dilakukan mikroorganisme pada tidak hidup tetapi dalam lingkungan terkontrol,
misalnya di dalam tabung reaksi atau cawan Petri
Jenis penelitian ini bertujuan untuk menjelaskan pengaruh dari variabel
eksperimental pada subset dari bagian pokok suatu organisme. Hal ini cenderung
untuk memfokuskan pada organ , jaringan , sel , komponen sel, protein , dan / atau
biomolekul
tingkat penyederhanaan sistem yang diteliti lebih besar , sehingga peneliti dapat
fokus pada sejumlah komponen. Sebagai contoh , identitas protein dari sistem
kekebalan tubuh ( misalnya antibodi ) , dan mekanisme yang mengenali dan
mengikat antigen asing akan tetap sangat jelas jika tidak untuk penggunaan ekstensif
kerja in vitro untuk mengisolasi protein , mengidentifikasi sel-sel dan gen yang
memproduksi mereka , mempelajari fisik sifat interaksi mereka dengan antigen , dan
mengidentifikasi bagaimana interaksi mereka menyebabkan sinyal seluler yang
mengaktifkan komponen lain dari sistem kekebalan tubuh
Respon seluler adalah spesies - spesifik , lintas analisis - bermasalah spesies . Metode
baru spesies - sasaran yang sama - , studi multi- organ yang tersedia untuk
memotong hidup , pengujian lintas-spesies

kekurangan :
 - Banyak percobaan biologi seluler dilakukan di luar organisme atau sel ; karena
kondisi pengujian mungkin tidak sesuai dengan kondisi di dalam organisme, ini
dapat mengakibatkan hasil yang tidak sesuai dengan situasi yang muncul dalam
organisme hidup. Akibatnya, hasil eksperimen tersebut sering dijelaskan dengan
in vitro, bertentangan dengan in vivo.
- Namun, kondisi yang terkendali hadir dalam sistem in vitro berbeda secara
signifikan dari yang in vivo, dan dapat memberikan hasil yang menyesatkan. Oleh
karena itu, dalam studi in vitro biasanya diikuti oleh studi vivo.
Contohnya termasuk:
- Dalam biokimia, fisiologis stoikiometri konsentrasi non-aktif dapat
mengakibatkan enzim dalam arah terbalik, misalnya beberapa enzim dalam siklus
Krebs mungkin tampak memiliki tata-nama, salah.
- DNA dapat mengadopsi konfigurasi lainnya, seperti A DNA .
- Protein lipat mungkin berbeda seperti dalam sel ada kepadatan tinggi protein
lain dan ada sistem untuk membantu lipat, sementara in vitro, kondisi kurang
bergerombol dan tidak membantu.
-
Kelebihan
Kebutuhan sample yang digunakan lebih sedikit
Murah dan cepat
Dalam penelitian in vitro yang lebih cocok dibandingkan in vivo untuk menyimpulkan
tindakan mekanisme biologis. Dengan variabel yang lebih sedikit dan perseptual
diperkuat menyebabkan reaksi halus, hasil yang umumnya lebih jelas.
in vitro lebih cocok untuk mengamati efek keseluruhan percobaan pada subjek hidup
Contoh :
- uji pada mikroba jika antibiotic;
- pada sel kanker dari hewan utk obat anti kanker;
- pada plasmodium utk obat anti malaria;
- pada jamur missal candida pada obat anti keputihan/candidiasis;
- pada cacing utk obat cacing;
- pada virus utk obat antivirus;
- pada bagian organ tertentu dari hewan contoh obat asma bronkodilator diuji
pada otot polos trachea marmot;
- pada jantung hewan dalam chamber utk obat angina dan aritmia; dll.

(http://chemedu09.wordpress.com/2012/05/23/apa-sih-bedanya-antara-in-vivo-in-
vitro-dan-ex-vivo/)
Kelebihan:

Kekurangan:

https://www.roswellpark.edu/sites/default/files/uploads/page/583-foster41911.pdf
 Advantages of in vitro studies

 Especially important to investigate and identify cellular/molecular working

mechanisms:

o You know exactly what you are doing

o Your work can be very specific and detailed

e.g., Investigations of cell division failures by looking at mitotic spindle
apparatus or particular DNA studies, ‘omics’,…

 Fast (fast screening): negative in vitro = negative in vivo

 Relatively inexpensive

 Often predictive of a real hazard or risk (e.g., DNA damage)

 High throughput screening:

o ex: VITOTOX-test (see further in PubMed)

o “Omics” (microarray technology, see an example in PubMed)

o Specific cell lines (lung-, or skinepithelial cells, white blood cells,

hepatocytes,….)

Limitations of in vitro studies

 Cells are treated outside their normal ‘environment’ (no surrounding tissues, no
blood supply, no normal supply of nutrients, …)

 In vivo exposures can not easily be mimiced

(Metabolisation can be simulated by addition of specific chemical agents)
=> Enhanced credibility when same effects are also demonstrated in vivo.

(http://www.bbemg.be/en/elf-emf-and-health/study-methods/info-invitro-studies.html)

4. Bagaimana cara menentukan subjek uji in vivo?

Spesies yang ideal untuk uji toksisitas sebaiknya memenuhi criteria-kriteria sebagai
berikut:
 Berat badan lebih kecil dari 1 kg
 Mudah di ambil darahnya dan jumlah darah yang dapat diambil cukup banyak
 Mudah dipegang dan dikendalikan
 Pemberian materi mudah dilakukan dengan berbagai rute (oral, subkutan)
 Mudah dikembangbiakan dan mudah dipelihara di laboratorium
 Lama hidup relative singkat
 Fisiologi diperkirakan sesuai/identik dengan manusia/hewan yang dituju
(Kusumawati.2004.Bersahabat dengan hewan coba.Yogyakarta:Gadjah Mada University
Press)

Kesehatan hewan  bebas dari penyakit

Disesuaikan dengan tujuan penelitian
Kebutuhan bahan makanan di sesuaikan berat badan
BB disesuaikan dengan rancangan penelitian
(Bersahabat dengan hewan coba UGM)

Penelitian yang memanfaatkan hewan coba, harus menggunakan hewan percobaan

yang sehat dan berkualitas sesuai dengan materi penelitian. Hewan tersebut dikembang-
biakkan dan dipelihara secara khusus dalam lingkungan yang diawasi dan dikontrol
dengan ketat. Tujuannya adalah untuk mendapatkan defined laboratory animals
sehingga sifat genotipe, fenotipe (efek maternal), dan sifat dramatipe (efek lingkungan
terhadap fenotipe) menjadi konstan. Hal itu diperlukan agar penelitian bersifat
reproducible, yaitu memberikan hasil yang sama apabila diulangi pada waktu lain,
bahkan oleh peneliti lain.

Berbagai hewan kecil memiliki karakteristik tertentu yang relatif serupa dengan
manusia, sementara hewan lainnya mempunyai kesamaan dengan aspek fisiologis
metabolis manusia.

Dalam penelitian kesehatan yang memanfaatkan hewan coba, juga harus diterapkan
prinsip 3 R dalam protokol penelitian, yaitu: replacement, reduction,dan refinement.
Replacement adalah keperluan memanfaatkan hewan percobaan sudah diperhitungkan
secara seksama, baik dari pengalaman terdahulu maupun literatur untuk menjawab
pertanyaan penelitian dan tidak dapat digantikan oleh mahluk hidup lain seperti sel atau
biakan jaringan. Replacement terbagi menjadi dua bagian, yaitu: relatif (mengganti
hewan percobaan dengan memakai organ/jaringan hewan dari rumah potong, hewan
dari ordo lebih rendah) dan absolut (mengganti hewan percobaan dengan kultur sel,
jaringan, atau program komputer).

Reduction diartikan sebagai pemanfaatan hewan dalam penelitian sesedikit mungkin,

tetapi tetap mendapatkan hasil yang optimal. Jumlah minimum biasa dihitung
menggunakan rumus Frederer yaitu (n-1) (t-1) >15, dengan n adalah jumlah hewan yang
diperlukan dan t adalah jumlah kelompok perlakuan. Kelemahan dari rumus itu adalah
semakin sedikit kelompok penelitian, semakin banyakjumlah hewan yang diperlukan,
 serta sebaliknya. Untuk mengatasinya, diperlukan penggunaan desain statistik yang
tepat agar didapatkan hasil penelitian yang sahih.

Refinement adalah memperlakukan hewan percobaan secara manusiawi (humane),

memelihara hewan dengan baik, tidak menyakiti hewan, serta meminimalisasi perlakuan
yang menyakitkan sehingga menjamin kesejahteraan hewan coba sampai akhir
penelitian.
(http://indonesia.digitaljournals.org/index.php/idnmed/article/viewFile/1237/1210)

5. Bagaimana parameter yg diukur dari uji in vivo dan in vitro?

In vivo :
Analgesik
(http://lib.ui.ac.id/file?file=digital/20311589-S42961-Uji%20efek.pdf)

Antiinflamasi
(http://repository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789/24139/1/MIGI%20FEBRI%2
0ARINI-fkik.pdf)
In vitro:
1. Uji aktivitas antiaskaris (anticacing)
2. Uji antifungi
3. Uji antikalkuli
4. Uji efek mukolitik
5. Uji farmakodinamik dg organ terisolir
6. Uji toksisitas in vitro
- metode Brain Shrimp Test (BST)
- metode Sitotoksisitas

EFEK SITOTOKSIK IN VITRO DARI EKSTRAK BUAH MAHKOTA DEWA (PHALERIA

MACROCARPA) TERHADAP KULTUR SEL KANKER MIELOMA
Uji Aktivitas Sitotoksik. Sediaan uji dan sediaan kontrol pelarut masing-masing sebanyak
0,1 ml dimasukkan dalam sumur microwell plateyang telah berisi 0,9 ml suspensi sel
hasil inisiasi. Replikasi dilakukan sebanyak dua kali. Selanjutnya diinkubasi dalam
inkubator CO2 suhu 37ºC selama 24 jam. Kemudian dari masing-masing sumur diambil
sebanyak 0,1 ml dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditambah dengan larutan tripan
blue 0,5% sebanyak 0,1 ml (perbandingan 1:1) dan dihomogenkan. Dari campuran
tersebut dipipet dan diletakkan diatas ruang hitung hemositometer. Perhitungan
dilakukan dibawah mikroskop dengan pembesaran 100 kali. Viabilitas sel dihitung

dengan rumus:

(http://journal.unair.ac.id/filerPDF/06%20vol%207%20april%202008%20(48-54).pdf)

Antifungi
UJI AKTIVITAS ANTIJAMUR EKSTRAK ETANOL KULIT BATANG RAMBUTAN (Nephelium
lappaceum L.) TERHADAP JAMUR Candida Albicans SECARA IN VITRO
Pengujian Aktivitas Antijamur
a. Media dasar PDA dituang ke dalam cawan petri dan dibiarkan mengeras.
b. Pada permukaan lapisan dasar diletakkan 6 pencadang dan diatur sedemikian rupa
sehingga terdapat daerah yang baik untuk mengamati zona hambat yang terjadi.
c. PDA yang mengandung suspensi jamur uji dituang ke dalam cawan petri di sekeliling
pencadang.
d. Dikeluarkan pencadang dari cawan petri sehingga terbentuk sumur yang akan
digunakan untuk larutan uji, larutan kontrol positif (+) dan larutan kontrol negatif (-).
e. Diteteskan larutan uji ekstrak sampel kering etanol, ekstrak sampel basah etanol,
larutan kontrol positif (+) dan larutan kontrol negatif (-).
f. Dilakukan pengulangan secara triplo dengan cara yang sama.
g. Diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 37 C selama 1x24 jam.
h. Diamati zona hambat yang terjadi di sekitar sumuran kemudian diukur diameter zona
hambat secara horizontal dan vertikal dengan menggunakan penggaris berskala.
(http://download.portalgaruda.org/article.php?article=123510&val=5543)

Organ Terisolasi
EFEK EKSTRAK DAUN CIPLUKAN (Physalis minima L) TERHADAP RELAKSASI OTOT
POLOS TERPISAH TRAKEA MARMUT (Cavia porcellus)
METODOLOGI
Percobaan dilakukan dengan menggunakan hewan coba marmut jantan (n=5).
Percobaan dilakukan dengan metoda organ terpisah yaitu menggunakan rantai cincin
trakea yang dimasukkan ke dalam organ bathdan dihubungkan dengan rekorder
macLab. Selama percobaan rantai cicin trakea di dalam organbath direndam cairan
fisiologis Kreb”s yang selalu diganti setiap 15 menit, temperatur dipertahankan 35-37 C
dan terus menerus dialiri gas karbogen (9). Daun ciplukan (Physalis minima L) dibuat
ekstrak dengan menggunakan etanol. Untuk melihat respon relaksasi dari pemberian
ekstrak daun ciplukan, dilakukan stimulasi kontraksi otot polos trakea terlebih
duludengan menggunakan histamin 10-5 M (9,10), jika sudah terjadi kontraksi yang
stabil, kemudian baru ditambahkan ekstrak daunciplukan secara kumulatif dengan dosis
0,3 %, 0,5 %, 0,7 % dan diamati respon relaksasi otot polos trakea dari penurunan kurva
yang terekam di komputer mac lab dan dapat diukur besar kontraksi dan relaksasi
dalam satuan mv. Ekstrak daun ciplukan diberikan secara kumulatif berdasar penelitian
pendahuluan yang didapatkan hasil bahwa efek relaksasi ekstrak daun ciplukan bertahan
lama dan baru hilang responsnya setelah dilakukan pencucian. Data yang diperoleh
adalah besar kontraksi dari otot polos trakea setelah pemberian histamin (kontrol) dan
penurunan kontraksi (relaksasi) otot polos trakea setelah pemberian ekstrak daun
ciplukan (perlakuan). Besar kontraksi yang terekam pada komputer maclab
menggunakan satuan mili volt Data yang didapatkan dianalisis dengan uji anova, dan uji
korelasi regresi.
(http://jkb.ub.ac.id/index.php/jkb/article/viewFile/237/229)

Mukolitik
SKRINING KOMPONEN KIMIA DAN UJI AKTIVITAS MUKOLITIK EKSTRAK RIMPANG
BANGLE (Zingiber purpureum Roxb.) TERHADAP MUKOSA USUS SAPI SECARA IN VITRO
Pembuatan Larutan Stok Ekstrak Uji
Larutan stok ekstrak uji dibuat dari ekstrak uji yang ditimbang sesuai kadar yang di-
inginkan (1 % b/v dan 0,5 % b/v) dan dibasahi dengan tween 80 hingga konsentrasi
tween 80 dalam larutan mencapai 1% dengan cara mela-rutkan tween sebanyak 1 g
dengan 100 ml akua-dest, lalu diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam ekstrak uji dan
dihomogenkan hingga terbentuk dispersi ekstrak.
 Larutan Stok Kontrol Positif dan Kontrol Negatif
Larutan stok kontrol positif yang diguna-kan asetilsistein 50 mg/ml dengan tween 80
hingga konsentrasi tween 80 dalam larutan mencapai 1 %, sedangkan kontrol negatif
adalah mukus sapi dalam larutan dapar fosfat pH 7.

Pembuatan Dapar Fosfat pH 7

Larutan dapar pH 7 dibuat dengan men-campurkan 125 ml kalium dihidrogen fosfat 0,2
M dengan 72,75 ml natrium hidroksida 0,2 N dan di-encerkan dengan air bebas CO2
hingga 500 ml.

Penyiapan Mukus
Mukus didapatkan dari mukosa usus sapi yang dicuci dengan air mengalir sampai bersih,
kemudian dibelah dan dikerok. Mukus ditampung pada gelas kimia. Mukus yang
didapatkan berwarna putih kecoklatan sampai putih kekuningan.

Pengujian Aktivitas Mukolitik

Efek mukolitik diuji secara in vitro dengan mengukur perubahan viskositas mukus
usus sapi. Hasil pengukuran dibandingkan dengan hasil pa-da kontrol positif dan kontrol
negatif. Campuran mukus dibuat dalam larutan dapar fosfat pH 7 dengan perbandingan
70 : 30. Pengukuran dilakukan dengan menghi-tung efek mukolitik menggunakan alat
viscometer Brookfield spindle no. 3 dengan kecepatan 50 rpm. Sebelumnya, sampel
diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 C. Pada saat pengukuran, sampel uji
ditempatkan pada plat panas (hot plate) dan dijaga suhunya pada 37 0,5 C).
Pengukuran dilakukan sebanyak 3 kali untuk masing-masing sampel uji.
(http://download.portalgaruda.org/article.php?article=29862&val=2174)

6. Apa uji analisis data dari metode in vivo dan in vitro?

Bergantung dari tujuan penelitian nya
Perbedaan uji beda
Skala yg diukurkadar?kesakitan ya-tidak?
Kelompok 2 kelompok atau lebih?
Desain berpasangan (pre post); tidak berpasangan (post test only control group
design)
 Contoh dari masing2 yg kita teliti(tujuan, desain, skala, kelompok, uji analisisnya)?satu
satu yaa.

7. Bagaimana tahap pengembangan tanaman obat?

Apa yg tergambar dlm alur penelitian?pemilihan sampel....

8. Apa saja pertimbangan untuk membuat desain penelitian di uji farmakologi?

- Tujuan
- Prevalensi
- Waktu
- Biaya
- Sumber daya
- Subjek penelitian banyak sedikitnya subjek; berkaitan dengan banyaknya darah yg
diambil mencit: post test only saja (agar tidak mati sebelum diteliti)

Kenapa pilihnya post test? Kenapa pilihnya cross sectional?

9. Apa saja contoh contoh penelitian uji in vitro?

10. Bagaimana tahap(langkah) uji toksikologi in vivo?

Toksisitas akut menentukan LD 50 misal pada ikan sehat atau tidak ikan nya (dari
pergerakannya) jumlah sampel nya tiap kelompok (misalnya 10 ekor) beri perlakuan
misalnya dengan alkohol 70%, dosis disesuaikan dengan kelompok perlakuan lihat
efeknya selama 5 menit berapa yg mati.

3.b.1. PRINSIP

Sekelompok hewan uji dengan jenis kelamin yang sama diberikan dosis bertingkat menggunakan
metode fixed doses antara lain: 5, 50, 300 dan 2000 mg/kg (dosis dapat ditambah hingga 5000
mg/kg). Dosis awal dipilih berdasarkan uji pendahuluan sebagai dosis yang dapat menimbulkan
gejala toksisitas ringan tetapi tidak menimbulkan efek toksik yang berat atau kematian. Prosedur ini
dilanjutkan hingga mencapai dosis yang menimbulkan efek toksik atau ditemukan tidak lebih dari 1
kematian, atau tidak tampak efek toksik hingga dosis yang tertinggi atau adanya kematian pada
dosis yang lebih rendah.

3.b.2. PROSEDUR

3.b.2.1. Penyiapan Hewan Uji

Hewan yang digunakan adalah rodensia tikus putih (strain Sprague Dawley atau Wistar) atau mencit
(strain ddY atau BALB/c dan lain-lainnya). Umumnya digunakan tikus betina karena sedikit lebih
sensitif dibandingkan tikus jantan. Namun bila bahan uji (menurut literatur) secara toksikologi atau
toksikokinetik menunjukkan bahwa tikus jantan lebih sensitif, maka jenis kelamin jantan harus
digunakan untuk uji. Secara prinsip jika hewan jantan digunakan maka diperlukan alasan yang kuat.
Hewan diseleksi secara acak, diberi tanda untuk identifikasi tiap-tiap hewan, dan dilakukan
aklimatisasi sekurang-kurangnya 5 hari sebelum diberi perlakuan.

3.b.2.2. Penyiapan Sediaan Uji

Sediaan uji dilarutkan dengan bahan pembawa yang sesuai (misalnya aquadestilata, minyak nabati).
Tergantung dari formulasi bahan uji, pemilihan cairan untuk suspensi/emulsi yang aqueous lebih
dianjurkan dari pada larutan suspensi/emulsi yang larut dalam minyak (minyak jagung) dan apabila
menggunakan pelarut non aqueous maka karakteristik toksisitas cairan pembawa sudah harus
diketahui.

3.b.2.3. Pemberian Sediaan uji dan Volume Pemberian

Hewan uji harus dipuasakan sebelum diberikan perlakuan (tikus dipuasakan selama 14-18 jam,
namun air minum boleh diberikan; mencit dipuasakan selama 3-4 jam, air minum boleh diberikan).
Setelah dipuasakan, hewan ditimbang dan diberikan sediaan uji. Sediaan uji diberikan dalam dosis
tunggal dengan menggunakan sonde. Pada keadaan yang tidak memungkinkan untuk diberikan dosis
dengan satu kali pemberian, sediaan uji dapat diberikan beberapa kali dalam jangka waktu
pemberian zat tidak boleh melampaui 24 jam. Setelah diberikan perlakuan, pakan boleh diberikan
kembali setelah 3-4 jam untuk tikus dan 1-2 jam untuk mencit. Bila sediaan uji diberikan beberapa
kali, maka pakan boleh diberikan setelah perlakuan tergantung pada lama periode pemberian
sediaan uji tersebut. Volume cairan maksimal yang dapat diberikan tergantung pada ukuran hewan
uji. Pada rodensia, jumlah normalnya tidak melampaui 1 mL/100 g berat badan, namun bila
pelarutnya air (aqueous) dapat diberikan hingga 2 mL/100 g berat badan. Umumnya sediaan uji
diberikan dalam volume yang tetap selama pengujian (konsentrasi berbeda), akan tetapi jika bahan
uji berupa cairan atau campuran cairan, sebaiknya digunakan dalam bentuk tidak diencerkan
(konsentrasi tetap).

3.b.2.4. Uji Pendahuluan

Tujuan dari uji pendahuluan adalah mencari dosis awal yang sesuai untuk uji utama. Dosis awal
pada uji pendahuluan dapat dipilih dari tingkatan fixed dose: 5, 50, 300 dan 2000 mg/kg BB sebagai
dosis yang diharapkan dapat menimbulkan efek toksik (Lampiran 1, 2). Pemeriksaan menggunakan
dosis 5000 mg/kg hanya dilakukan bila benar-benardiperlukan. Diperlukan informasi tambahan yaitu
data-data toksisitas in vivo dan in vitro dari zat-zat yang mempunyai kesamaan secara kimiawi dan
struktur. Jika informasi tersebut tidak ada, maka dosis awalnya ditentukan sebesar 300 mg/kg BB.
Interval waktu pengamatan sekurang-kurangnya 24 jam pada setiap dosis dan semua hewan harus
diamati sekurang-kurangnya selama 14 hari. Bila kematian terjadi pada dosis 5 mg/kg BB, sehingga
nilai cutt-off LD50 adalah 5mg/kg BB (masuk kategori 1 GHS) maka penelitian sudah harus dihentikan
tanpa perlu melakukan uji utama. Namun, jika diperlukan penegasan nilai LD50 maka prosedur
tambahan dapat dilakukan sbb: Pada hewan uji kedua diberikan dosis 5 mg/kg. Jika hewan kedua
ini mati, maka kategori 1 GHS terkonfirmasi dan percobaan dihentikan. Jika hewan ini hidup, maka
pemberian bahan uji dosis 5 mg/kg BB secara berurutan dilanjutkan kepada 3 hewan uji lainnya.
Interval waktu pemberian antara satu hewan dengan hewan berikutnya harus cukup agar dapat
dilakukan penilaian apakah hewan tersebut akan tetap hidup atau tidak. Jika hewan ke-3 mati (jika
dihitung dari awal merupakan kematian kedua hewan uji), maka pemberian bahan uji dihentikan
dan tidak diteruskan kepada hewan ke-4 dan ke-5. Berdasarkan Lampiran 2, maka bahan uji masuk
kelompok A (kematian 2 atau lebih), dan berlaku klasifikasi pada dosis 5 mg/kgBB (Kategori 1 jika
ada 2 atau lebih kematian atau Kategori 2 jika hanya ada 1 kematian).

3.b.2.5. Uji Utama

Uji utama dilakukan dengan memperhatikan tingkat dosis dimana terjadi kematian pada uji
pendahuluan. Penentuan dosis antara setiap tingkatan didasarkan pada waktu terjadinya gejala
toksik. Pengujian tidak diteruskan pada dosis selanjutnya sampai diketahui apakah hewan masih
bertahan hidup atau mati (Lampiran 3, 4). Secara umum terdapat 3 pilihan yang akan diambil:
menghentikan uji, melanjutkan uji dengan dosis yang lebih tinggi atau melanjutkan uji dengan dosis
yang lebih rendah. Pada umumnya, klasifikasi bahan uji sudah dapat ditentukan pada dosis awal dan
uji selanjutnya tidak diperlukan. Pada uji ini diperlukan sejumlah 5 ekor hewan uji untuk tiap
tahapan dosis uji. Kelima ekor hewan tersebut terdiri atas 1 ekor hewan dari uji pendahuluan dan
4 ekor hewan tambahan. Interval waktu antara dosis uji ditentukan oleh onset, lama dan beratnya
toksisitas. Peralihan pemberian bahan uji pada tahap dosis berikutnya harus ditunda sampai
diperoleh petunjuk bahwa hewan uji tersebut bertahan hidup. Umumnya diperlukan interval waktu
peralihan selama 3-4 hari, namun dapat diperpanjang bila hasilnya tampak meragukan.
Sehubungan dengan animal welfare, bila akan menggunakan dosis diatas 5000 mg/kg,
dipertimbangkan bahwa dosis tersebut sangat relevan dengan kepentingan untuk melindungi
manusia, hewan atau lingkungan.

3.b.2.6. Uji Batas

Jika pada uji pendahuluan tidak ada kematian pada tingkat dosis 2000 mg/kg dan pada uji utama
hanya 1 ekor atau tidak ada hewan yang mati pada tingkat dosis 2000 mg/kg, maka tidak perlu
diberikan dosis melampaui 2000 mg/kg.

3.b.2.7. Pengamatan

Hewan uji diobservasi secara individual sekurang-kurangnya pada 30 menit pertama setelah
pemberian sediaan uji, dan secara periodik setiap 4 jam selama 24 jam pertama dan sehari sekali
setelah itu selama 14 hari. Namun durasi pengamatan dapat bervariasi dan diperpanjang
tergantung dari reaksi toksik dan waktu onset serta lama waktu kesembuhan. Waktu timbul dan
hilangnya gejala toksisitas (khususnya jika ada kecenderungan tanda-tanda toksik yang tertunda)
harus dicatat secara sistematis dalam catatan individual yang dilakukan untuk setiap hewan.

Pengamatan tambahan perlu dilakukan jika hewan menunjukkan gejala toksisitas secara terus-
menerus. Pengamatan yang dilakukan termasuk pada: kulit, bulu, mata, membran mukosa dan juga
sistem pernafasan, sistem syaraf otonom, sistem syaraf pusat, aktivitas somatomotor serta tingkah
laku. Selain itu, perlu juga pengamatan pada kondisi: gemetar, kejang, salivasi, diare, lemas, tidur
dan koma. Hewan dalam kondisi sekarat dan hewan yang menunjukkan gejala nyeri yang berat atau
tampak menderita harus dikorbankan. Hewan uji yang dikorbankan atau ditemukan mati, waktu
kematiannya harus dicatat. Hal- hal yang harus diamati dalam periode observasi adalah:

a. Tingkah laku hewan seperti jalan mundur, jalan menggunakan perut

b. Berat Badan

Berat badan masing-masing hewan harus dimonitor pada saat sebelum diberikan sediaan uji dan
sekurang-kurangnya seminggu setelahnya. Perubahan berat badan harus dianalisis. Pada akhir
penelitian, hewan yang masih bertahan hidup ditimbang dan kemudian dikorbankan.

c. Pemeriksaan Patologi

Seluruh hewan (termasuk yang mati selama penelitian maupun yang dimatikan) harus dinekropsi.
Semua perubahan gross patologi dicatat untuk setiap hewan uji. Pemeriksaan mikroskopik dari
organ yang menunjukkan adanya perubahan secara gross patologi pada hewan yang bertahan hidup
selama 24 jam atau lebih setelah pemberian dosis awal dapat dilakukan untuk mendapatkan
informasi yang berguna.

3.b.2.8. Pengumpulan dan Analisis Data

Data masing-masing hewan harus tersedia dan semua data harus diringkas dalam bentuk tabel yang
menunjukkan dosis uji yang digunakan; jumlah hewan yang menunjukkan gejala toksisitas; jumlah
hewan yang ditemukan mati selama uji dan yang mati karena dikorbankan; waktu kematian masing-
masing hewan; gambaran dampak toksik dan waktu dampak toksik; waktu terjadinya reaksi
kesembuhan; dan penemuan nekropsi.

(PERATURAN KEPALA BADAN PENGAWAS OBAT DAN MAKANAN REPUBLIK INDONESIA NOMOR 7
TAHUN 2014 TENTANG PEDOMAN UJI TOKSISITAS NONKLINIK SECARA IN VIVO,
http://jdih.pom.go.id/showpdf.php?u=816)