Abstrak

Latar Belakang: Penggunaan malaria spesifik kuantitatif real-time PCR (qPCR) meningkat karena
sensitivitas yang tinggi,
spesiasi dan kuantifikasi parasit malaria. Namun, karena kurangnya konsensus atau standar metode
dalam melakukan qPCR, sulit untuk mengevaluasi dan / atau membandingkan kualitas kerja yang
dilaporkan oleh penulis yang berbeda untuk
lintas-studi dan / atau analisis uji cross-platform.
Metode: Pertunjukan tujuh tes qPCR diterbitkan yang mendeteksi Plasmodium spp atau Plasmodium
falciparum
dibandingkan dengan menggunakan DNA standar dan sampel dari percobaan klinis. Amplifikasi dan
pengukuran qPCR
yang dilakukan menggunakan Biosystems Terapan 7500 Cepat Real-Time PCR System. Semua analisis
yang
otomatis didirikan menggunakan pengaturan default. Untuk format TaqMan penyelidikan, alat tes yang
dilakukan di latar belakang QuantiFast Probe Guru Mix sedangkan di SYBR Hijau Format, alat tes
dilakukan di latar belakang QuantiFast SYBR Hijau Guru Mix dan QuantiTect SYBR Hijau Guru
Campur latar belakang.
Hasil: Tes dengan efisiensi PCR tinggi mengungguli mereka dengan efisiensi yang rendah di semua
kategori
termasuk sensitivitas, presisi dan konsistensi terlepas dari format uji dan latar belakang. Dengan
pengecualian satu uji, semua tes dievaluasi menunjukkan sensitivitas yang lebih rendah dibandingkan
dengan apa yang telah
diterbitkan. Ketika sampel dari sebuah penelitian tantangan malaria dianalisis, uji qPCR dengan
keseluruhan
performa terbaik terdeteksi parasit dalam mata pelajaran paling awal dan dengan sebagian besar
konsistensi.
Kesimpulan: Data menunjukkan perlunya peningkatan konsensus dan pedoman yang akan mendorong
praktek eksperimental yang lebih baik, memungkinkan interpretasi yang lebih konsisten dan tidak
ambigu hasil qPCR.
Latar Belakang
Metode standar emas untuk diagnosis malaria adalah mikroskop
[1,2]. Namun, berbagai tantangan terkait
dengan melakukan kualitas mikroskop dapat menyebabkan variasi
sensitivitas uji dan spesifisitas [3,4] mempengaruhi pasien
hasil diagnostik dan / atau hasil uji klinis [5].
Mikroskop sangat bergantung pada operator dan kemampuan
pengujian diperlukan untuk mencapai direproduksi, berkualitas tinggi
Data [6]. tes molekuler yang mendeteksi Plasmodium khusus
sekuens asam nukleat semakin sering dilaksanakan
untuk mengatasi beberapa keterbatasan yang terkait
dengan mikroskop. tes ini beberapa kali lipat
lebih sensitif dibandingkan mikroskop atau antigen deteksi
tes [7,8]. aplikasi malaria spesifik realtime kuantitatif
PCR (qPCR) telah memungkinkan untuk identifikasi, spesiasi
dan kuantifikasi parasit malaria [14/07]. Terutama,
qPCR semakin banyak digunakan untuk menganalisis pra-paten
parasitemia infeksi malaria manusia dikendalikan (CHMI)
uji coba serta evaluasi parasitemia rendah di lapangan
Studi [15-19]. PCR juga dapat digunakan sebagai alat untuk identifikasi
dari tanpa gejala operator [20].
Sebagian besar tes qPCR yang telah dijelaskan
untuk mendeteksi Plasmodium menargetkan 18S MULTICOPY
RNA (rRNA) gen ribosom [21]. target lainnya seperti

sebagai gen mitokondria, var dan stevor gen memiliki juga

telah dijelaskan [13,21]. tes ini dirancang sebagai
monoplex mana mereka memperkuat target tunggal atau sebagai multipleks,
di mana mereka memperkuat dua target atau lebih. ketika digunakan
sebagai uji monoplex, melaporkan rentang batas deteksi
dari sekitar 0,002-30 parasit / uL [14,21] sedangkan
sebagai multipleks, batas deteksi berkisar antara 0,2
5 parasit / uL [7,8,14,21]. Hermsen et al. [9] dan Lee
et al. [10] menggambarkan beberapa awal qPCR monoplex
tes untuk mendeteksi Plasmodium spp dengan deteksi sebuah
batas 0,02 parasit / uL dan 0,1 parasit / uL masing-masing.
Kedua studi ini ditargetkan gen rRNA.
Baru-baru ini, Farrugia et al. [13] dijelaskan monoplex a
assay yang menargetkan gen sitokrom b (ctyb) dengan deteksi a
batas 0,05 parasit / uL. Meskipun ini dan
penelitian lain mengikuti metode penelitian serupa, perbedaan
dalam ruang dan waktu, reagen, standar yang digunakan untuk kuantifikasi,
pengenceran rentang, instrumen atau platform,
metode pengujian analisis, interpretasi data, dan banyak
lebih, berkontribusi perbedaan deteksi dilaporkan
batas. Karena kurangnya konsensus atau standar metode
dalam melakukan qPCR, sulit untuk mengevaluasi dan / atau membandingkan
kualitas kerja yang dilaporkan oleh penulis yang berbeda
untuk cross-studi dan / atau analisis uji cross-platform.
Ini juga menghambat kemampuan untuk mereproduksi dilaporkan
tes.
Informasi minimum untuk publikasi kuantitatif
real-time eksperimen PCR (MIQE) pedoman
yang diterbitkan baru-baru [22]. Mereka mengatasi keandalan
dari qPCR hasil untuk membantu menjamin integritas
literatur ilmiah, mempromosikan konsistensi antara
laboratorium, dan peningkatan transparansi eksperimental.
Penggunaan malaria qPCR sebagai klinis konfirmasi
endpoint assay dalam penelitian bidang meningkat secara eksponensial
sebagaimana tercermin dalam jumlah besar publikasi
melaporkan data qPCR. Selain itu, ada diskusi
tes dari molekul menggantikan mikroskop sebagai
alat diagnostik yang disukai untuk malaria, terutama di
laboratorium rujukan dan dalam uji CHMI. Kurangnya
konsensus tentang bagaimana melakukan yang terbaik qPCR telah menyebabkan
kesulitan serius dalam membangun PCR sebagai independen
tolok ukur [22] dan saat ini, tidak ada FDA
disetujui assay qPCR untuk mendeteksi malaria. Penggunaan
MIQE dan pedoman lainnya set-balik akan memastikan qPCR
relevansi, akurasi, penafsiran yang benar, kehandalan,
dan reproduktifitas. Menuju upaya ini, penting
untuk memperoleh data yang harmonis dari beberapa saat
banyak digunakan tes qPCR malaria sebagai langkah penting
terhadap uji standardisasi.
Dalam penelitian ini, kinerja beberapa diterbitkan
tes qPCR menggunakan standar internasional WHO
untuk Plasmodium falciparum DNA amplifikasi asam nukleat
teknologi assay sebagai referensi kalibrasi
reagen dibandingkan. Kondisi eksperimental,
metode analisis uji dan interpretasi data yang
seragam dilakukan untuk semua tes qPCR dinilai.

metode
Plasmodium falciparum referensi reagen
WHO Standar Internasional untuk Plasmodium falciparum
DNA digunakan untuk menganalisis efisiensi, sensitivitas
dan spesifisitas target assay diterbitkan untuk Plasmodium
spp. dan P. falciparum. Reagen referensi diperoleh
dari Institut Nasional Standar Biologi dan
Control (NIBSC; Hertfordshire, UK). Standar ini terdiri
dari persiapan beku-kering dari seluruh darah yang dikumpulkan
dari pasien yang terinfeksi dengan P. falciparum dengan pertukaran
transfusi. Berikut rekomendasi NIBSC, yang
Bahan liofilisasi ditangguhkan di 500 uL steril,
nuklease air gratis untuk konsentrasi akhir 1 ×
10.993 IU / mL, yang sesuai dengan parasitemia dari
9,79 parasit / 100 sel darah merah (sel darah merah) [13]. parasit
kepadatan Standar WHO Internasional untuk
DNA P. falciparum setelah pemulihan yang diperkirakan
menjadi 469.920 parasit / uL, berdasarkan rata-rata
RBC hitungan 4,8 × 106 RBC / uL. Kecuali dinyatakan lain,
segar seluruh darah yang tidak terinfeksi digunakan sebagai pengencer
untuk mempersiapkan pengenceran serial. DNA diekstraksi menggunakan EZ1
otomatis sistem pemurnian (Qiagen, CA, USA) dengan menggunakan
kit darah EZ1 DNA (Qiagen, CA, USA) berikut
produsen rekomendasi. Untuk tujuan
mendirikan batas deteksi (LOD), DNA adalah
serial diencerkan lima kali lipat untuk pertama empat poin dilusi
diikuti oleh pengenceran dua kali lipat selama rentang lima log. Itu
konsentrasi terendah DNA yang positif di semua
ulangan ditetapkan sebagai LOD.
Primer dan probe
Tujuh set primer dan probe untuk deteksi
Plasmodium spp. dan P. falciparum yang dipilih dari
menerbitkan karya. Tabel 1 menunjukkan primer dan probe
urutan yang dipilih untuk proyek ini diterbitkan. Mereka
diperoleh baik dari Life Technologies (Carlsbad,
CA, USA) atau Integrated DNA Technologies (IDT-DNA,
Coralville, IA, USA). Untuk tujuan kesederhanaan dan
keseragaman, semua probe untuk semua tes yang berlabel
dengan 6-karboksi-fluorescein (FAM) sebagai reporter dan 6-
karboksi-tetramethylrhodamine (Tamra) sebagai pemadam a.
tes qPCR dan desain eksperimental
Amplifikasi dan qPCR pengukuran dilakukan
menggunakan Applied Biosystems 7500 Cepat Real-Time PCR
Sistem, dengan versi 2.0.6 software. Semua analisis, termasuk
pengaturan ambang dan kuantifikasi
siklus (Cq) nilai-nilai, secara otomatis didirikan menggunakan
pengaturan default. Percobaan dilakukan di 96-
piring dengan baik. Untuk format TaqMan penyelidikan, alat tes
dilakukan di latar belakang QuantiFast Probe

Background: Currently, a lack of consensus exists on how best to perform and interpret
quantitative real-time PCR (qPCR) experiments. The problem is exacerbated by a lack of
sufficient experimental detail in many publications, which impedes a reader’s ability to evaluate
critically the quality of the results presented or to repeat the experiments.

Content: The Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments
(MIQE) guidelines target the reliability of results to help ensure the integrity of the scientific
literature, promote consistency between laboratories, and increase experimental transparency.
MIQE is a set of guidelines that describe the minimum information necessary for evaluating
qPCR experiments. Included is a checklist to accompany the initial submission of a manuscript
to the publisher. By providing all relevant experimental conditions and assay characteristics,
reviewers can assess the validity of the protocols used. Full disclosure of all reagents, sequences,
and analysis methods is necessary to enable other investigators to reproduce results. MIQE
details should be published either in abbreviated form or as an online supplement.
Summary: Following these guidelines will encourage better experimental practice, allowing
more reliable and unequivocal interpretation of qPCR results.

Membandingkan DNA standar dan DNA sampel dari percobaan klinik. Perbanyakan dan pengukuran
qPCR menggunakan sistem aplikasi Biosistem 7500 Fast Real-Time PCR
Metode
1. Plasmodium falciparum reference reagent
Reagen referensi diperoleh
dari Institut Nasional Standar Biologi dan
Control (NIBSC; Hertfordshire, UK). Standar ini terdiri
dari persiapan darah beku-kering dari seluruh darah yang dikumpulkan
dari pasien yang terinfeksi dengan P. falciparum dengan pertukaran
transfusi. DNA diekstraksi menggunakan EZ1
automated purification system (Qiagen, CA, USA). Untuk tujuan
mendirikan batas deteksi (LOD), DNA adalah
serial diencerkan lima kali lipat untuk pertama empat poin dilusi
diikuti oleh pengenceran dua kali lipat selama rentang lima log. Itu
konsentrasi terendah DNA yang positif di semua
ulangan ditetapkan sebagai(limit of detection) LOD.
2. Primer dan probe
Tujuh set primer dan probe untuk deteksi
Plasmodium spp. dan P. falciparum yang dipilih dari
karya yang telah diterbitkan. Tabel 1 menunjukkan primer dan probe
urutan yang dipilih untuk pempublikasian proyek ini.
3. tes qPCR dan desain eksperimental
Perbanyakan dan pengukuran qPCR menggunakan sistem aplikasi Biosistem 7500 Fast
Real-Time PCR dengan software versi 2.0.6
 F = forward ujung 5-3
R = reserve ujung 3-5
F&R = primer
P = probe
Summary of published assays analysed in this study
1. Kamau et al [14], PLU3: Published LoD 0.0512
parasites/μL, 1 μL of DNA in 10 μL total reaction
volume in 1X QuantiTect Probe RT-PCR Master
Mix (Qiagen). Efficiency not reported. Performed in
ABI7500 platform.
2. Lee et al [10], MACH: Published LoD 0.1 parasites/μL,
5 μL of DNA in 25 μL total reaction volume in
1X TaqMan universal PCR master mix (Applied
Biosystems, CA, USA). Efficiency not reported.
Performed in iCycler (Bio-rad) platform.
3. Farrugia et al [13], CYTB: Published LoD
0.05 parasites/μL, 5 μL of DNA in 20 μL total
reaction volume in 1X Probe Master (Roche
Molecular Biochemicals). Efficiency reported at
94.5%. Performed in a LightCycler 480
instrument.
4. Padley et al [7], WHO: Published LoD 16.2
parasites/μL. The amount of DNA used and reaction
total reaction volume not provided however, reports
amplification reactions were performed using the
Light-Cycler FastStart DNA Master Hybprobe kit
(Roche Applied Science, Mannheim, Germany).
Efficiency not reported. Performed in a LightCycler
2.0 instrument.
5. Perandin et al [12], FAL: Published LoD 0.7
parasites/μL, 5 μL of DNA in 50 μL total reaction
volume in 1X TaqMan universal PCR master mix
(Applied Biosystems). Efficiency not reported.
Performed in ABI 7700 platform.
6. Rougemont et al [11], PLASMO: LoD and Efficiency
not published. 5 μL of DNA in 25 μL total reaction volume in 1X TaqMan universal PCR master mix
(Applied Biosystems). Performed in ABI 7700 platform.
7. Hermsen et al [18],TURBO: Published LoD 0.02
parasites/μL, 5 μL of DNA in 25 μL total reaction
volume of 25 μL of buffer containing 20 mM Tris-HCl,
100 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0.02% gelatin, and
400 μM deoxynucleoside triphosphates
(Microsynth, Balgach, Switzerland). Efficiency not
reported. Performed in a GeneAMP PCR system
9700 (Applied Biosystem).

4. Analisis sampel yang diperoleh dari studi bantahan

Untuk lebih membandingkan tes yang dijelaskan di sini, sampel
diperoleh dari lima orang yang berpartisipasi dalam percobaan
infeksi P. falciparum dianalisis di
rangkap tiga dengan menggunakan masing-masing tujuh tes sedang diuji.
Sampel yang digunakan untuk analisis berasal dari kontrol positif
subyek bantahan yang tidak menerima
produk apapun atau berlisensi obat anti-malaria sebelumnya
untuk melawan gigitan nyamuk yang terinfeksi.

Hasil penelitian membandingkan antara sampel yang diuji cobakan dan data yang telah
dipublikasikan sebelumnya. Peneliti membandingkan sensitivitas, efisiensi, nilai R2 dan
presisi dari pengujian PCR. Pada pengujian mengenai sensitivitas PCR semua pengujian
dilakukan dalam format SYBR Green dan format TaqMan probe. Untuk format TaqMan
probe dilakukan pada latar belakang QuantiFast Master Mix sementara untuk format SYBR
green pengujian dilakukan dalam background of QuantiFast SYBR
Green Master Mix dan QuantiTect Sybr green Master Mix.

Assay Published Clinical trial

name
PLU3 0.0512 50 parasites/mL
parasites/μL

MACH 0.1 parasites/μL, 100 parasites/mL

CTYB 0.05 parasites/μL 50 parasites/mL

WHO 16.2 16,200 parasites/mL
parasites/μL.
FAL 0.7 700 parasites/mL
parasites/μL
 TURBO Efficiency 20 parasites/mL
not published.
PLASMO 0.02 NOT REPORTED
parasites/μL

Sementara itu untuk Perbandingan rentang dinamis dan efisiensi tes PCR
Assay Published Clinical trial Clinical trial
name (SYBR Green
(TaqMan probe QuantiFast assay
assay performance) performance)
(%) (%)
PLU3 Efficiency not 100.412 95.389
reported
MACH Efficiency not 90.399 88.683
reported
CTYB 94.5% 88.154 89.419
WHO Efficiency not 97.394 90.095
reported
FAL Efficiency not 74.954 40.067
reported
TURBO Efficiency 86.788 75.551
not reported
PLASMO Efficiency 88.135 76.088
not published



 Darah kering beku dari pasien yang terinfeksi with P. falciparum
 2× QuantiFast Master Mix
 forward and reverse primer
 probe
 nuclease-free water
 DNA template