Microbiología General – FCQ - UNA

Carreras: Bioquímica - Farmacia

PRACTICA N° 1

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y ESTERILIZACION DE MATERIALES

Objetivo general

 Conocer los principios generales de las técnicas de esterilización

 Observar el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la contaminación

microbiana

Objetivos específicos

 Distinguir entre medios de cultivo químicamente definidos y complejos

 Diferenciar el empleo de cada uno de los siguientes medios: selectivos, generales,

diferenciales, de enriquecimiento, para anaerobios.

 Discutir las ventajas y desventajas de la esterilización con calor seco y calor húmedo

 Definir términos fundamentales relacionados con el control microbiológico

Fundamentos

Por su minúsculo tamaño, los microorganismos no pueden estudiarse como individuos, sino que es
necesario manejarlos como poblaciones.

Para ello es necesario cultivarlos, es decir, favorecer su multiplicación in vitro, en ambientes

especiales que proporcionen las condiciones semejantes a las de sus hábitats naturales. En estos
ambientes se debe eliminar a todos aquellos microorganismos que interfieran en el estudio del
microorganismo de interés, a la vez proporcionar los nutrientes necesarios para su crecimiento y
multiplicación.

Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cambios de condiciones
ambientales y en la medida en que se han podido adaptar a estos cambios, se han distribuido en
una gran diversidad de hábitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de tipo físico y
químico.

Se han aplicado diversos procesos de desinfección y esterilización para limitar su presencia o

eliminarlos. La esterilización es un proceso por el cual se elimina totalmente todo tipo de
microorganismo y que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras que la
desinfección es un proceso que solamente disminuye el número de formas vegetativas de los
microorganismos a niveles mínimos.

La esterilización puede ser hecha mediante calor húmedo (para medios de cultivo, soluciones y
cultivos bacterianos que se desechan) el cual destruye a los microorganismos por desnaturalización
de las proteínas; calor seco (para asas de inoculación y materiales de vidrio y quirúrgico) que
destruye a los microorganismos por oxidación de sus componentes celulares.

La esterilización de materiales sensibles al calor, para los materiales de plásticos es recomendable

el uso de gases como óxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies se desinfectan con
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compuestos químicos en forma líquida como los fenoles, compuestos cuaternarios de amonio,
formaldehido, alcoholes, halógenos y detergentes.

¿Para qué se necesita esterilizar el material?

Es imprescindible trabajar con material y soluciones estériles con objeto de que los resultados que
se obtengan correspondan al microorganismo o microorganismos que están presentes en la
muestra que se estudia y no a contaminantes procedentes del medio o materiales que puedan
desarrollarse y falsear las pruebas. Para ella, antes de empezar el trabajo práctico se esterilizará,
junto con los medios de cultivo, el material que posteriormente se utilizará.

Resumen

La esterilización puede ser:

Flameado: es un procedimiento simple y eficaz, consiste en la exposición de un objeto a efecto de

la llama hasta la incandescencia. Ej: ansas de cultivo de siembra

Incineración: es el mejor sistema para aquellos productos en los que no importe su destrucción. Ej:
material biológico

Autoclave: consiste en una cámara en la que el aire puede ser sustituido por vapor de agua sometida
a presión. Se opera a 121°C y 1,5 atm durante 15-20 minutos, destruye todas las formas vegetativas
y esporas. Ej: para medios de cultivos

Agentes químicos como el Óxido de etileno (gas) que inactiva microorganismos sustituyendo
átomos de hidrógeno lábiles por grupos como hidroxilos, carboxilos, etc. Ej: para materiales
termolábiles como prótesis, catéteres, etc

MEDIOS DE CULTIVO

Consta de un gel o una solución que cuenta con todos los nutrientes necesarios para permitir
condiciones favorables de pH y temperatura, así como para permitir también el crecimiento de virus,
bacterias, hongos, células, tejidos vegetales o incluso pequeñas plantas.

De acuerdo a sus cualidades físicas o consistencia se clasifica en:

1-Liquidos: Tambien se llaman caldos de cultivo, no contienen agar y se preparan en matraces

pequeños

2-Semisólidos: contienen 0.5% de agar y se preparan en matraces pequeños

3- Sólidos: contienen de 1.5% a 2% de agar y se preparan en cajas petri (placa) o en tubos de ensayo.
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Según su origen en:

Naturales: preparados a partir de sustancias naturales de origen vegetal o animal, pudiendo ser
extractos de tejidos o infusiones, su composición química no se conoce exactamente

Semisintéticos: son a los que se añaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto
orgánico complejo. Ej: extracto de levadura

Sintéticos: medios que contienen una composición química definida cualitativamente y

cuantitativamente
Clasificación de los medios de cultivo según la diversidad de microorganismos que puedan
desarrollar en él:

1-Generales: contiene componentes que permiten el crecimiento de la mayoría de los

microorganismos.

2-De enriquecimiento: contiene algunos componentes que favorecen el crecimiento de algunos

microorganismos frente a otros.

3-Selectivos: los componentes han sido añadidos selectivamente para inhibir el crecimiento de
ciertos microorganismos y no de otros.

4-Diferenciales: es aquel al que se ha añadido un componente (generalmente un colorante) que

permite diferenciar entre distintas reacciones químicas que se producen durante el crecimiento.

Materiales

Material por grupo Material por equipo Material especial

Balanza granataria Matraz Erlenmeyer de 500 y 1000 mL Mecheros

Potenciómetro Probeta de 100 o 250 mL Piseta

Espátulas Varilla de vidrio Ansas calibradas

Rollos de papel aluminio Gradilla Autoclave

Agua destilada Pipetas de 1 y 10 mL Incubadora a 35 °C

Soluciones amortiguadoras Tubos de ensayo de 16x150 mm y Papel kraft o de estrasa

22x175 mm con y sin tapa de
pH 4 y 7 baquelita

Agar deshidratado de PDA, Hisopos y gasas Estufa

Nutritivo, y medio mínimo

Caldo nutritivo Pipeta Pasteur Clips

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Metodología

Preparación y esterilización de material de vidrio

1. Lavar material con detergente líquido, enjuagar con abundante agua de la llave y al final con
agua destilada

2. Secar el material de vidrio de preferencia en horno, si no es posible, secar al aire

3. En las pipetas, colocar (con un clip) un filtro de algodón en la boquilla

4. Envolver las cajas de Petri y pipetas con papel kraft de acuerdo a las indicaciones del
profesor

5. Introducir los hisopos en un tubo de 22x175 y tapar con algodón

6. En el papel de la envoltura identificar con nombre y marcar el volumen de las pipetas

7. Introducir el material en un horno previamente calentado a 180°C, esperar a que la

temperatura se estabilice nuevamente y a partir de este momento contar con el tiempo de
esterilización (1 hora)

Preparación y esterilización de medios de cultivo

Medio de cultivo liquido

1. Leer cuidadosamente el rótulo de identificación del medio de cultivo deshidratado

2. Calcular la cantidad necesaria para preparar 100 mL de caldo del medio de cultivo
deshidratado

3. Pesar la cantidad calculada del medio deshidratado. Esta operación debe ser rápida para
evitar que la humedad del ambiente no afecte al resto del contenido del frasco

4. Disolver el medio en 50 mL de agua destilada en un erlenmeyer de 250 mL, y una vez

disuelto completar el volumen con 50 mL más.

5. Ajustar el pH entre 6,8 y 7,2

6. Colocar 10 mL de caldo en 5 tubos de 16x150 mm

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Medio de cultivo semisólido

1. Colocar los 50 mL restantes de caldo en el erlenmeyer de 250 mL y calcular la cantidad

necesaria de agar-agar para obtener un medio semisólido (2 g agar/1 L medio)*

2. Tapar el matraz y calentar hasta disolver totalmente, procurando agitar repetidamente

3. Una vez fundido el medio de cultivo semisólido colocar 10 mL en 5 tubos de 16x150 mm c/u

*NOTA: si el medio de cultivo esta deshidratado, hacer los cálculos y disolver por calentamiento

Medio de cultivo solido

1. Leer cuidadosamente el marbete del medio de cultivo deshidratado

2. Calcular la cantidad necesaria para preparar 100 mL de medio de cultivo solido deshidratado

3. Tapar el matraz y calentar hasta disolución total, para ello agitar repetidamente y evitar que
el medio de cultivo hierva y se derrame

4. Distribuir el medio de cultivo en el siguiente material: tubos de 16x150 mm  5 mL para

Agar Nutritivo (AN) y 7 mL para Agar papa dextrosa (PAD)

5. Tapar cada uno de los tubos con AN con tapón de rosca y los tubos con PDA con algodón y
gasa y esterilizarlos a 121°C y 15 libras de presión durante 15 minutos

PREPARACION DE LA CAJAS DE PETRI Y TUBOS CON MEDIOS DE CULTIVO

1- Los tubos con medios de cultivo con agar, se deberán colocar en una superficie inclinada de
tal forma que el medio se solidifique a una distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del
tubo.

2- Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado de la autoclave se enfríen a
una temperatura aproximada de 40-50 ªC, que coincide con la posibilidad de sostener el
matraz en la palma de la mano sin sentir un calor excesivo

3- Cerca del mechero, etiquetar 3 cajas de Petri con AN, 3 cajas con PDA y 3 con MM. Los
medios de cultivo se vacían en las cajas de Petri (aprox 25-30 mL) en zona aséptica cerca del
mechero o en campana de flujo laminar

4- Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 30 min) y posteriormente envolver las cajas
cuidadosamente con papel Kraft o acomodarlas en forma invertida en bolsa de plástico
limpias

5- Guardarlas en refrigeración hasta 24 h antes de utilizarlas

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PRUEBAS DE ESTERILIDAD

1- Colocar los tubos con agar inclinado y las cajas de Petri en forma invertida en una estufa de
incubación ajustada a 37ªC durante 24-48 h

2- Revisar los tubos y cajas de Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la
aparición de turbidez, nata superficial y/o depósito de material en el fondo de los tubos con
medio líquido; así como la formación de colonias microbiana en la superficie de medios
sólidos

3- Si no hay contaminantes de los medios, se abrirá una de las cajas de Petri de cada medio
durante 1 minuto en el laboratorio o zonas accesorias al mismo y se etiquetará como “AL
AIRE”

4- La otra caja de cada medio de cultivo se abre durante 30 segundos cerca del mechero y se
etiquetará “EN AREA ASEPTICA”

5- La tercera caja se conservará sin abrir y se etiquetará como “CONTROL”

Resultados

1- Hacerla descripción morfológica de las colonias obtenidas en las cajas con diferentes medios
de cultivo (AN, PDA y MM) y con los distintos tratamientos en relación a la caja control

2- Reportar el crecimiento en forma cualitativa: NEGATIVO= No hay crecimiento, POSITIVO en

cruces:

( + )  Poco crecimiento (++)  Regular crecimiento (+++)  Abundante crecimiento

3- Discuta los resultados y determine si la esterilización en el autoclave y horno fue adecuada,

así como el manejo de los materiales

Medio de cultivo Abierta al aire Abierta en área Control (sin abrir)

aséptica
Agar Nutritivo

Papa Dextrosa Agar

Medio Mínimo de
sales
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Cuestionario

1- Describa los conceptos de esterilización, desinfección, asepsia, sustancias antimicrobianas

2- Métodos de esterilización más utilizados en Microbiología

3- ¿Cómo se relaciona los procedimientos de Pasteurización con los procesos de esterilización,

desinfección y asepsia?

4- Sugiera un modelo de esterilización casera