DETERMINACION POR PCR EN TIEMPO REAL DE Escherichia coli EN CARNES

I. INTRODUCCION
Las enfermedades transmitidas por alimentos, ocasionadas por microorganismos
patógenos, constituyen un grave problema de salud pública a nivel mundial. Los métodos
microbiológicos utilizados comúnmente en la detección de estos patógenos, de origen
alimentario, son laboriosos y consume mucho tiempo. En base a esto, la presente revisión
describe las ventajas y limitaciones de los principales métodos moleculares utilizados en la
detección e identificación de microorganismos patógenos transmitidos por alimentos. Para
ello, se consideró la actualidad de la información consultada, el análisis objetivo de la
temática y su alcance. La literatura reciente reporta un número significativo de técnicas
moleculares, alternativas, sensibles y selectivas para la detección, enumeración e
identificación de microorganismos patógenos en alimentos, siendo la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) la plataforma más popular, mientras que la secuenciación de alto
rendimiento se perfila como una técnica de gran aplicabilidad a futuro.

Los microorganismos que se pueden encontrar en los alimentos de origen animal proceden
tanto de la microbiota de la materia prima, principalmente de animales destinados para el
consumo humano, como de la que se incorpora durante las operaciones de
recolección/sacrificio, tratamiento, almacenamiento y distribución (González Flores y Rojas
Herrera, 2005)

Escherichia coli EN CARNES

Los productos cárnicos de origen vacuno pueden contaminarse en cualquiera de las etapas
de procesamiento, ya que este tipo de ganado es un reservorio natural de microbiota
intestinal y patógenos para el humano, por lo que sus heces son fuente significativa de
microorganismos.2,3 Así, la carne fresca puede resultar contaminada en el ambiente del
rastro al momento del sacrificio, por lo que los agentes patógenos pueden permanecer en
la superficie de la carne o penetrar con algún utensilio en el tejido muscular.

La Escherichia coli , es la principal causa de gastroenteritis para la población en los países

subdesarrollados (Instituto Nacional de Salud, 2008). Las infecciones por E. coli pueden
causar pequeños brotes en la población; entre el 60 % y 80 % de los casos son
esporádicos; pero en ocasiones se producen grandes brotes en hospitales, escuelas,
colegios, universidades y restaurantes.
Aplicación de la Técnica de PCR en Tiempo Real

Para reducir los tiempos y costos que involucra la utilización del cultivo bacteriológico
estándar, se han desarrollado técnicas rápidas de detección de Escherichia coli. El
Lightcycler PCR (Roche) de tiempo real permite reducir los tiempos de detección, procesar
hasta 32 muestras simultáneamente y realizar el diagnóstico con una alta especificidad y
sensibilidad.

En la PCR a tiempo real se realizará la amplificación y la detección de ADN especifico de

manera simultánea, evitando el uso de geles para la detección de los productos permitidos
la cuantificación. Se utilizara termocicladores que incorporan un lector de fluorescencia, es
decir que durante la amplificación se puede cuantificar el ADN sintetizado debido a que la
florescencia emitida es proporcional a la cantidad de ADN formado (Tomay de Dios L., et al
2013)

Ventajas de la PCR a tiempo real

 Es una técnica rápida y eficaz

 Utiliza sistemas cerrados evitando la contaminación
 Permite llevar a cabo en el mismo instrumento ensayos cualitativos, cuantitativos,
determinación de mutaciones, PCR múltiple, etc.
 Alta especificidad y sensibilidad.

Foodproof ® STEC ScreeningLyokit: permite la detección de los genes vtx1, vtx2 (incluyendo
vtx2f) y eae en una única reacción de PCR múltiple en tiempo real. Y foodproof® STEC
IdentificationLyoKit: detecta e identifica 8 serogrupos O26, O45, O103, O104, O111, O121,
O145 y O157 en una única reacción de PCR en tiempo real.

IQ – Check TM STEC Kits: incluye dos kits, basados en PCR en tiempo real, destinados a la
detección de genes de virulencia VTEC (vtx1, vtx2 y eae) y 7 serogrupos principales de STEC
(O26, O45, O103, O111, O121, O145, and O157:H7), respectivamente, en productos
cárnicos y lácteos.

BAX® System Real-Time PCR STEC Suite: sistema, basado en reacciones de PCR en tiempo
real, diseñado para la detección de los top six VTEC en productos cárnicos. Incluye un
screening para la detección de los genes vtx y eae, y dos paneles que identifican los
serogrupos O26, O111, O121 (panel 1) y O45, O103, O145 (panel 2).

GeneDisc® Technologies – STEC: presenta distintos productos que, a través de la tecnología

de PCR en tiempo real, permite la detección de cepas VTEC en numerosos tipos de
alimentos, especialmente cárnicos y lácteos: GeneDisc Shiga Toxic E. coli, GeneDisc EHEC 5
ID (H7, O26, O103, O111, O145), GeneDisc STEC Top 7 (genes de virulencia O157, O26, O103,
O111, O145, O45, O121 serogrupos), GeneDisc STEC Plus (genes de virulencia).

Confirmación de E. coli O157:H7 por PCR en tiempo real (PCR-TR)

Para la confirmación por PCR en tiempo real se utilizó el sistema de detección comercial de
Applied Biosystems TaqMan® para E. coli O157:H7 en un termociclador de sistema
MiniOpticon.* La mezcla de reacción de PCR-TR consistió en 15 μl de mezcla maestra EMM,
3 μl de mezcla blanco TAM (ambas incluidas en el sistema de detección) y 12 μl de ADN
bacteriano obtenido por lisis (proceso descrito anteriormente). La amplificación consistió
en un ciclo para la activación de la enzima Taq ADN polimerasa de 95º C por 10 min seguida
de 45 ciclos de 95º C por 15 s para desnaturalización y 60º C por 1 min para hibridación y
extensión. La interpretación de resultados se hizo con el software Opticon Monitor 3,
utilizando como referencia el ciclo umbral #14 obtenido por el testigo positivo, de acuerdo
con los dos fluorocromos; FAM (señal específica para la secuencia blanco) y VIC (señal
específica para el control interno).
 II. CONCLUSION

La carne más contaminada E. coli. Se encuentra en las carnes que se encuentran en

refrigeración. Por su parte, Hernández et al.17 evaluaron la calidad microbiológica de la
carne de canal en un rastro municipal de Hidalgo, México, y encontraron que los niveles de
E. coli registrados en ese estudio representaban un riesgo sanitario para los consumidores.
Es frecuente identificar E. coli en niveles bajos en las áreas de procesamiento de productos
cárnicos y durante su distribución, debido a que esta bacteria es parte de la flora entérica
normal del ganado bovino. Sin embargo, es importante considerar que el hallazgo de E. coli
indica contaminación de origen fecal y es considerada como un indicador de mala calidad
del alimento por un manejo inadecuado, ya sea durante su procesamiento o durante su
mercadeo; además, permite sospechar la presencia de microorganismos patógenos
provenientes del mismo origen(ZHAO).

III. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

HERNÁNDEZ S, ESTRADA A, SANCHEZ I, CASTRO J, ROMAN A, SANTOS E. Condiciones

microbiológicas en el proceso del sacrificio en un rastro municipal del Estado de Hidalgo,
México. Vet Méx 2007; 38:187-195.

González Flores, T.; Rojas Herrera, R. A. (2005). Enfermedades transmitidas por alimentos y
PCR: prevención y diagnóstico. salud pública de México / vol. 47 no.5: 388-390

ZHAO C, GE B, DE VILLENA J, SUDLER R, YEH E, ZHAO S et al. Prevalence of Campylobacter

spp., Escherichia coli, and Salmonella serovars in retail chicken, turkey, pork, and beef from
the Greater Washington, D.C. Appl Environ Microbiol 2001; 67:5431-436.

Tamay de Dios L, Ibarra C, Velasquillo C. (2013). Fundamentos de la reacción en cadena de

la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigación en Discapacidad, Vol. 2, Núm
pp 70-78

https://rpmesp.ins.gob.pe/index.php/rpmesp/article/view/93/1932