Facultad de Ciencias Biológicas.

Laboratorio de Fisiología Vegetal

Mg.Mery L.Suni, Mg.Enoc Jara, Mg.Rafael La Rosa, Mg.Alfredo Berrocal

Universidad Nacional Mayor de San Marcos

(Universidad del Perú, Decana de América)
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Laboratorio de Fisiología Vegetal

GUÍA DE PRÁCTICAS DEL

CURSO
FISIOLOGIA VEGETAL

Para la E.A.P. de Genética y Biotecnología

AUTORES:
Mery L. Suni Ninataype Blga. Mg.
Enoc Jara Peña Blgo. Mg.
Rafael La Rosa Loli Blgo. Mg.
Alfredo Berrocal, Blgo. Mg.

SEMESTRE 2019-I

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CONTENIDO

PRÁCTICA TEMA PÁG.

Práctica 1. Determinación del potencial hídrico foliar 3

Práctica 2. Estomas y estado hídrico foliar 7

Práctica 3. Transpiración en hojas de álamo 10

Práctica 4. Deficiencia de nutrientes en el crecimiento 13

Práctica 5. Contenido de clorofila en la hoja 18

Práctica 6. Medición de la tasa de fotosíntesis (Uso del IRGA) 21

Práctica 7. Evaluación del crecimiento de la planta 13

Práctica 8. Maduración de las estructuras reproductivas

Práctica 9. Introducción a cultivo in vitro

Práctica 10. Inducción de raíces

Práctica 11. Interacción de ABA y AG3 en la germinación de semillas

Práctica 12. Regulación de la germinación por la luz

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PRÁCTICAS 4 Y 7. DEFICIENCIA DE NUTRIENTES EN EL CRECIMIENTO

INTRODUCCIÓN. -

El desarrollo y el crecimiento óptimo de la planta dependen de la presencia en la

cantidad necesaria de los elementos minerales esenciales. En la solución del suelo se
encuentran diferentes iones que las plantas pueden absorber, pero preferencialmente
ingresará algunos iones esenciales para la vida de la planta, como por ejemplo K+ o
NO3-. Pero también sucede que pese a que algunos iones son esenciales su absorción
transcurre lentamente, este es el caso del Ca2+ o SO42-. Como consecuencia de estas
diferencias en velocidad de absorción se presenta en la solución externa un
desplazamiento más o menos intenso de los iones. Estas variaciones en velocidad de
absorción de los cationes y aniones en la solución influyen en el pH de la misma. Una
solución nutritiva con gran cantidad de cationes de fácil absorción (K+ o NH4+) y con
aniones de difícil absorción (SO42-) al estar en contacto con la planta rápidamente origina
una disminución del pH; por el contrario, el valor del pH aumenta rápidamente cuando
en la solución predomina Ca(NO3)2. Finalmente, la planta logrará crecer a mayor tasa
cuando logra absorber la cantidad necesaria. Correspondiendo esto a la capacidad de
la planta de absorber nutrientes. Cabe indicar que se define como biomasa vegetal al
peso del material vegetal verde de una especie o de una comunidad vegetal contenido
en una unidad de superficie (área de suelo) y por unidad de tiempo. Habitualmente la
biomasa es expresada en términos de peso seco de materia orgánica.

OBJETIVO. -

Evaluar los síntomas de deficiencia de nutrientes en la coloración, número de hojas,

tamaño y biomasa de Zea mays

MATERIAL. -
Solución hidropónica San Marcos
3 botellas plásticas de 2L para preparar soluciones nutritivas
Bandeja de almácigos con 45 celdas
Balanza, pHmetro y conductímetro
Pipeta 10 mL
Probeta 1000 mL
Buffer de calibración para pHmetro de 7 y 10
Placas petri

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semillas de Zea mays por cada recipiente plástico

Materiales que deberán traer los estudiantes:

Papel toalla
4 baterías SP357/1.55 V para pHmetro y conductímetro (para los 2 grupos de práctica)
Agua destilada

MÉTODO. -
En el presente experimento se evaluará 3 niveles de nutrición (3 tratamientos):
solución óptima, solución deficiente y sin nutrientes. Se tendrá 15 repeticiones
(plantitas) por tratamiento. Sembrar un número mayor de semillas para asegurar
contar con 15 plantitas.

1. Preparación de las soluciones nutritivas:

Se usará el agua de caño como disolvente y preparar un volumen suficiente de las
soluciones a fin de regar semanalmente cada maceta según tratamiento. Utilizando
el pHmetro y conductímetro medir el pH y conductividad de las soluciones
preparadas. Ajustar el pH si fuera necesario a un valor ligeramente por debajo de 7,
por ejemplo 6.8

Instalación del experimento:

Humedecer homogéneamente la arena que se usará como sustrato. Vaciarlo en los
almácigos, llenando las celdas y presionando ligeramente para evitar espacios
vacíos en su interior. Con la ayuda de una pinza fina hacer pequeños hoyos de 0.5
a 1 cm de profundidad, donde se colocará una semilla. Distribuya al azar los
tratamientos. Rotularlos indicando tratamiento y fecha de instalación. A los 4 días de
sembrado inicie los tratamientos, regándolo con la solución que le corresponda.

2. Evaluación:
Cada semana retire 3 plantitas de cada tratamiento y registre el color, tamaño y
senescencia de las hojitas, así como el peso fresco y seco de cada plantita. También
realice observaciones de la longitud relativa de raíces al inicio y al término del
experimento. Realice estas mediciones cada semana durante 2 semanas. Estos
datos serán usados para el informe de la práctica 4.
Para la práctica Evaluación del crecimiento de la planta, evalúe las siguientes 3
semanas el peso fresco y seco de las plantitas. Para el informe de esta práctica use
todos los datos, es decir de las 5 semanas, para evaluar la tasa de crecimiento.

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RESULTADO. -
Presente la Ficha de registro de datos.
Analizar estadísticamente sus resultados y graficar los promedios mediante barras
o líneas donde se pueda observar las diferencias estadísticas entre los tratamientos
y elabore una Tabla con los promedios de los datos.

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FICHA DE REGISTRO DE DATOS. Evalúe a los 7 y 14 días de instalado el

experimento las variables abajo indicadas.

A los 7 días después de instalado el experimento

Rep Long N° N° hojas Color Pf Ps Observaciones

hoja hojas senescent hoja
Solución óptima

Solución deficiente

Solución sin nutrientes

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A los 14 días después de instalado el experimento

Rep Long N° N° hojas Color Pf Ps Observaciones

hoja hojas senescent hoja
Solución óptima

Solución deficiente

Solución sin nutrientes

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PRÁCTICA 5. CONTENIDO DE CLOROFILA EN LA HOJA

INTRODUCCIÓN. -
La luz resulta ser un factor decisivo en la fotosíntesis. Las plantas o partes de ella
presentan modificaciones, en general adaptaciones, que manifiestan su tolerancia a
condiciones de alta radiación o de luz reducida, denominadas plantas u hojas de sol y
de sombra respectivamente. Así, estas hojas presentan modificaciones en el área,
densidad y coloración, aspectos que serán evaluados en la presente práctica. Se
determinará el contenido de clorofila de las hojas de plantas de una misma especie pero
que crecen bajo diferente intensidad luminosa, así como el área foliar específica
(relación área foliar – peso). El contenido de clorofila en las hojas puede variar con la
nutrición y edad del órgano vegetal; inclusive con el procedimiento de cuantificación. Por
este motivo cuando se extrae la clorofila, se debe proceder rápidamente o protegerse
de su exposición directa a la luz ya que ésta la destruye de modo tal que su
concentración se reduce.

OBJETIVO.-
Evaluar el efecto de dos niveles de intensidad lumínica en la cantidad de clorofila a y b
y área foliar específica.

MATERIALES.-
Hojas de ambientes con diferente iluminación, plantas de sombra y de plantas a luz
directa, u hojas del exterior e interior de la copa de un árbol
0,1 g (peso fresco) de hojas de por cada tratamiento
Mortero y pilón
Tubos de prueba 15 o 20 mL (04 tubos por grupo), gradilla
Espectrofotómetro, celdas
Probetas 10 mL, tubos de prueba para espectrofotómetro
1000 mL alcohol 98% por cada grupo de práctica

Materiales que deberán traer los estudiantes:

Agua destilada
Papel toalla
Etiquetas

PROCEDIMIENTO.-

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1. Evaluación de las características foliares: Determine en el material colectado el

área foliar específica (cm2/g) de las hojas con la ayuda de la balanza y de un
sacabocado. Registre sus datos en la tabla adjunta.
2. Extracción de la clorofila: Trabajar por separado cada tratamiento. Usar una
muestra de 0.1 g en peso seco (como máximo), para ello con la ayuda de una tijera
fraccionar en trozos pequeños una muestra de 3 a 5 hojas por cada tratamiento,
mezclarlo, tomar una muestra y obtener el peso indicado. A continuación, los trozos
de hojas de cada tratamiento pasar al mortero, agregar 02 ml de alcohol y luego
triturarlas con el pilón para extraer la clorofila. Colocar las muestras en un tubo de
20 mL y añadirle 10 mL de alcohol. Rotularlo y colocarlo en la gradilla. A
continuación, los extractos de clorofila centrifugar utilizando una centrifuga a la
velocidad de 3500 rpm, y por 10 minutos. En esta condición se mantendrá hasta
obtener la extracción de toda la clorofila de las fracciones de hoja (tejido blanco y
solución alcohólica verde). Una vez alcanzado la total extracción, vaciar el solvente
a una probeta y determinar el volumen final. Luego vaciar a otro tubo, protegerlo de
la luz con la ayuda de un trozo de lámina de aluminio o de papel kraft.
3. Previamente encender el espectrofotómetro hasta que esté listo para la medición.
Cuantificar la clorofila mediante lectura de la absorción a 645, 649 y 665 nm.
Asegurarse de anular la absorbancia del solvente+tubo, leyendo un blanco formado
por ellos. Determinar la concentración mediante la siguiente fórmula:

mg cla/g = (13.7 * A665 – 5.76 *A649) * V /(1000 * P)

mg clb/g = (25.8 * A645 – 7.6 *A665) * V /(1000 * P)

donde: A = absorbancia leída en nm

V = volumen final del filtrado en mL
P = peso seco en g de la muestra

RESULTADOS.-

Llene la Tabla que se adjunta. Con los promedios realice un gráfico de columnas
apiladas para contenidos de clorofila a y b por cada tratamiento (nivel de radiación).
Presente en una tabla los promedios de área foliar específica y morfología foliar según
tratamiento.

CONCLUSIONES.-

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Considerando los resultados obtenidos y la bibliografía existente, justifique los

resultados obtenidos.

Ficha de Registro de Datos. Absorbancia de las muestras, cantidad de clorofila y

características de las hojas según tratamiento.

Tratamiento Área foliar

mg mg mg cl
específica A645 A649 A665
cla/g clb/g total/g
(cm2/g)

Luz
Completa

Luz Reducida

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PRÁCTICAS 3 y 6. MEDICIÓN DE LA TRANSPIRACIÓN Y LA TASA DE

FOTOSÍNTESIS

INTRODUCCIÓN.-

El crecimiento de un vegetal es explicado en última instancia por la Tasa Fotosintética

(o Fotosíntesis Neta) se expresa como la cantidad de CO2 que fija la planta por unidad
de área foliar y de tiempo, y se define como la cantidad neta de carbono (descontando
la respiración) que se incorpora al vegetal en un momento dado, esto es:
Fotosíntesis neta = fotosíntesis - respiración - fotorrespiración
El dióxido de carbono atmosférico difunde a los espacios intercelulares de la hoja a
través de las estomas, mientras estos están abiertos, igualmente el vapor de agua
puede difundir fácilmente de los tejidos vegetales internos que se encuentran turgentes
hacia el exterior (transpiración). El Analizador de Gases Infrarrojo (IRGA) permite la
medición de ambos. Se basa en la propiedad de ambos gases de absorber luz infrarroja
de manera proporcional a su concentración. Debido a que ambos gases presentan picos
de absorción en el espectro infrarrojo en zonas próximas o solapadas, el equipo
incorpora filtros específicos al evaluar las concentraciones de cada uno. La
cuantificación considera un gas de referencia de concentración conocida.

Los componentes básicos del IRGA son: la cámara foliar y una consola con teclado,
pantalla y memoria (figura 1). Los "sistemas abiertos" modernos de fotosíntesis también
incorporan un cilindro de gas comprimido pequeño y tuberías de suministro de gas. Esto
es porque el aire exterior tiene fluctuaciones naturales en el contenido de CO 2 y vapor
de agua, lo que puede introducir “ruido” de medición. Eliminan el CO2 y el vapor de agua
por el paso a través de cal sodada (soda lime) y silica gel o Drierite, luego añade CO2 a
una velocidad controlada para obtener una concentración estable de CO2, de tal manera
que cuantifica la diferencia de concentraciones en CO2 y vapor de agua en el aire entre
la entrada y salida de la cámara.

Adicionalmente algunos sistemas cuentan con control de temperatura y una unidad

extraíble de luz, por lo que también se puede medir el efecto de estas variables
ambientales. La consola puede tener una ranura para tarjetas PC. Los datos
almacenados pueden verse en la pantalla LCD, o enviados a un PC. Algunos sistemas
de fotosíntesis permiten la comunicación por internet usando protocolos estándar de
comunicación de internet.

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En la cámara foliar (figura 2) contiene, (1) una fuente de radiación infrarroja de bajo
voltaje que usualmente es una espiral de aleación níquel-cromo o tungsteno que se
calienta a aproximadamente a 800ºC, (2) una celda de análisis de gas con una entrada
y una salida de gases a través de la cual pasa el haz de radiación infrarroja, y (3) un
detector de radiación infraroja de estado sólido hace pasar el flujo que atravesó la
cámara con la muestra y el flujo de referencia alternadamente a través de la celda de
análisis por períodos de 2 segundos cada uno. La radiación infrarroja que atraviesa la
celda es filtrada siendo finalmente la señal incrementada y almacenada. Una bomba
interna en el instrumento hace pasar el flujo que atravesó la cámara con la muestra y el
flujo de referencia alternadamente a través de la celda de análisis por períodos de 2
segundos cada uno. Posteriormente es comparada con la señal recibida en ciclos
posteriores y en función de las diferencias entre muestra y referencias se calculan las
variables de interés.

También están diseñados para medir la temperatura de las hojas, temperatura de aire
de la cámara, PAR (radiación fotosintéticamente activa), y presión atmosférica. Estos
sistemas pueden calcular la eficiencia del uso del agua (A/E), la conductancia
estomática (gs), eficiencia de uso de agua intrínseca (A/gs) y concentración de CO2 sub-
estomática (IC). Temperaturas de la Cámara y hoja son medidas con un sensor
termistor. Algunos sistemas también están diseñados para controlar las condiciones
ambientales.

OBJETIVO. -
Determinar la tasa fotosintética foliar y transpiración de varias especies, herbáceas,
arbustivas o arbóreas en el periodo de máxima radiación.

MATERIAL.-

• especies, herbáceas, arbustivas o arbóreas presentes en la C.U.

• Analizador de Gases Infrarrojo (IRGA) marca Li-Cor modelo modelo Li-6400XT-R

PROCEDIMIENTO. -
1. Se transporta el IRGA a campo (con sumo cuidado)
2. Elegir la especie a evaluar

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Consola con pantalla,

teclado y memoria

Cámara foliar y otros

componentes

Figura 1 Sistema Portátil de medición de fotosíntesis. Marca LI-COR, modelo Li-

6400XT-R

Figura 2. Esquema básico mostrando las diferentes partes de la cámara foliar en un

sistema IRGA modelo Li-6400XT-R y la trayectoria del haz de radiación infrarroja
dentro del sistema.

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3. Determinar la hoja a ser evaluada. Se recomienda que sea la primera hoja adulta
más próxima al ápice.
4. Colocar la cámara foliar cuidadosamente de tal manera que encierre la hoja a
ser medida manteniendo su posición original. Registrar el valor de la tasa de
fotosíntesis.
5. En caso de haber estado en otra posición, colocarlo en posición perpendicular a
la incidencia de la radiación solar y registrar el valor de la tasa. Registre los datos
que muestra la Pantalla de cristal líquido en la consola.
6. Evaluar la transpiración de plantas que crecen en sobra, a luz expuesta, y en
condiciones de laboratorio
7. En el laboratorio, en caso de haber almacenado la información en la memoria del
equipo, descargar la información y proceder a analizarla

RESULTADOS.-

- Llene la ficha que se adjunta. Realice gráficos de transpiración Vs temperatura

del aire, conductancia estomática por cada especie evaluada
- Compare la tasa de fotosíntesis y otras variables evaluadas para las especies
estudiadas (Planta C3, C4, condiciones de luz directa, de sombra etc. Realice
los análisis estadísticos de las observaciones realizadas. Presentar los
resultados mediante gráficos y/ tablas. Discutir los resultados obtenidos.

CONCLUSIONES.-
Considerando los resultados obtenidos y la bibliografía existente, justifique los
resultados obtenidos.

REFERENCIAS.-
María Elena Fernández, Javier E. Gyenge. 2010. Técnicas en medición en
ecofisiología vegetal: conceptos y procedimientos / editores – Buenos Aires: Ediciones
INTA, 2010.140 p.

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Ficha de evaluación

Fotosíntesis neta Conductancia Temperatura

Especies Transpiración
(μmol m-2 s-1) estomática del aire

Especie 1

Especie 2

Especie 3

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