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CURITIBA
2002
CRISTINA MARIA MONTEIRO MACHADO
CURITIBA
2002
Ao Fred, com todo meu amor
i
AGRADECIMENTOS
Aos professores Dr. Carlos Gontarski, Dr. Eduardo Dechechi, Dr. Flávio Faria de
Moraes, Dra. Luciana Vandenberghe e Dra. Maria Helena Santana, pela participação na
banca de avaliação deste trabalho e sugestões para o aprimoramento do mesmo.
Á Embrapa Hortaliças, na figura de seu chefe geral Dr. Ruy Rezende Fontes pela
compreensão da importância do término deste trabalho. Ao Chefe Adjunto de Pesquisa e
Desenvolvimento Dr. Welington Pereira, ao pesquisador Dr. Warley Marcos Nascimento e ao
técnico do laboratório de sementes Karlão, pelas sugestões e auxílio no experimento de
bioensaios com o produto fermentado.
E finalmente, aos meus pais, sogros, irmãs, sobrinhos e cunhados, pelas orações,
hospedagens e constante estímulo, mesmo à distância. Amo vocês!
ii
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ............................................................................................................................................ii
SUMÁRIO............................................................................................................................................................. iii
LISTA DE TABELAS............................................................................................................................................vi
LISTA DE FIGURAS............................................................................................................................................vii
RESUMO................................................................................................................................................................xi
ABSTRACT ..........................................................................................................................................................xii
INTRODUÇÃO .......................................................................................................................................................1
1. ÁCIDO GIBERÉLICO....................................................................................................................................4
1.1 HISTÓRICO..................................................................................................................................................4
1.2 PROPRIEDADES FÍSICAS, QUÍMICAS E BIOLÓGICAS ......................................................................................5
1.2.1 Interações com plantas ......................................................................................................................6
1.2.2 Interações com o microrganismo produtor ........................................................................................6
1.2.3 Utilização comercial e potencial .......................................................................................................7
1.3 EFEITOS FISIOLÓGICOS DE GIBERELINAS EXÓGENAS NAS PLANTAS .............................................................7
1.3.1 Floração.............................................................................................................................................7
1.3.2 Expressão sexual ...............................................................................................................................7
1.3.3 Partenocarpia.....................................................................................................................................8
1.3.4 Senescência e abcisão........................................................................................................................8
1.3.5 Germinação e quebra de dormência ..................................................................................................8
1.3.6 Crescimento.......................................................................................................................................8
1.4 PROCESSOS DE PRODUÇÃO..........................................................................................................................9
1.4.1 Fermentação em superfície líquida....................................................................................................9
1.4.2 Fermentação Submersa......................................................................................................................9
1.4.3 Outros tipos de fermentação............................................................................................................10
1.5 GIBBERELLA FUJIKUROI............................................................................................................................10
1.6 ROTAS DE BIOSSÍNTESE ............................................................................................................................11
1.7 FISIOLOGIA DA FORMAÇÃO DE GA3 NO PROCESSO FERMENTATIVO ..........................................................13
1.8 CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO .................................................................................................................14
1.8.1 Razão C:N .......................................................................................................................................14
1.8.2 Sais minerais e elementos-traço ......................................................................................................15
1.8.3 pH....................................................................................................................................................15
1.8.4 Temperatura ....................................................................................................................................16
1.8.5 Aeração ...........................................................................................................................................16
1.9 ANÁLISE DE GIBERELINAS ........................................................................................................................16
2. FERMENTAÇÃO NO ESTADO SÓLIDO ..................................................................................................17
iii
2.3 PARÂMETROS DE CONTROLE DA FES........................................................................................................21
2.4 ESTIMATIVA DA BIOMASSA.......................................................................................................................21
2.4.1 Estimativa direta.............................................................................................................................22
2.4.2 Componentes da biomassa ..............................................................................................................22
2.4.3 Medida metabólica da biomassa......................................................................................................22
2.5 FES EM COLUNAS AERADAS .....................................................................................................................23
2.6 FES EM BIORREATORES EM ESCALA PILOTO .............................................................................................24
2.7 CÁLCULOS CINÉTICOS ..............................................................................................................................24
2.8 CÁLCULOS RESPIROMÉTRICOS ..................................................................................................................27
3. SUBSTRATOS .............................................................................................................................................31
5. MICRORGANISMO E SUBSTRATOS.......................................................................................................41
iv
9.2 BIOENSAIO................................................................................................................................................52
RESULTADOS E DISCUSSÃO ...........................................................................................................................53
CONCLUSÃO .......................................................................................................................................................86
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................................................................89
v
LISTA DE QUADROS
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Composição química média de partes do café (em base seca). ..............................................35
vi
LISTA DE FIGURAS
vii
FIGURA 31 - Produção de ácido giberélico .......................................................................................77
viii
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ix
MR: marca registrada
MS: matéria seca
P: quantidade de produto
PDA: ágar batata dextrose
ppm: partes por milhão
Q: interação quadrática
Qr: coeficiente respirométrico
Rf: relação de frente
rpm: rotações por minuto
S: quantidade de substrato
SEAB: Secretaria do Abastecimento do Estado do Paraná
T: temperatura
t: tempo
TECPAR: Instituto de Tecnologia do Paraná
UFPR: Universidade Federal do Paraná
US$: dólares americanos
X: quantidade de biomassa
YP/S: rendimento produto/substrato consumido
YP/X: rendimento produto/biomassa
YX/S: rendimento biomassa/substrato consumido
x
RESUMO
A casca de café e o bagaço de mandioca são resíduos agroindustriais muito abundantes no Brasil e
constituem um grave problema ambiental para este país. Por sua rica composição, estes resíduos
constituem-se de substratos potenciais para a produção de inúmeros bioprodutos celulares de interesse
comercial. Neste trabalho comprovou-se a possibilidade de se produzir a baixos custos um metabólito
de alto valor agregado com eficiência similar ao produto comercial importado, aproveitando os
resíduos agroindustriais acima citados. O ácido giberélico (GA3) é um hormônio natural em plantas e
importante promotor e regulador de seu crescimento. É produzido comercialmente apenas por grandes
indústrias multinacionais por fermentação submersa, com altos custos de produção e valor de venda. A
técnica de fermentação no estado sólido (FES) é conhecida pela produção de metabólitos na maioria
dos casos em níveis muito maiores que a fermentação submersa. Além disso, é caracterizada por
processos de custos menores, uma vez que possibilita o aproveitamento de resíduos agroindustriais.
Neste trabalho foram estudados diferentes sistemas para a produção de GA3 por FES do fungo
Gibberella fujikuroi em um substrato misto constituído de casca de café e bagaço de mandioca, numa
razão 7:3. Em colunas de aeração forçada atingiu-se uma produção de 0,925 g GA3.(kg MS)-1 após seis
dias de fermentação, com uma aeração nas primeiras 72 h de 0,24 l ar.h-1.(g MS)-1 e após este período
de 0,72 l ar.h-1.(g MS)-1. A partir da respirometria do processo foi possível determinar-se uma
correlação logarítmica entre o CO2 e a biomassa produzidos ao longo da fermentação. Uma correlação
semelhante foi obtida na fermentação no reator em escala piloto. Neste sistema atingiu-se uma
produção de 1,19 g GA3.(kg MS)-1 após cinco dias de fermentação, utilizando-se o mesmo substrato,
com umidade e pH iniciais de 77% e 5,2, respectivamente, e vazão de ar inicial de 0,12 l ar.h-1.(g MS)-
1
, e após três dias, de 0,48 l ar.h-1.(g MS)-1. Fez-se um bioensaio em mudas de tomateiro para
comparação da eficiência do GA3 produzido por FES e o produto comercial. Não foi constatada
diferença significativa na altura das mudas após quatro e oito dias de aplicação.
Palavras-chave: ácido giberélico, fermentação no estado sólido, casca de café, bagaço de mandioca,
respirometria
xi
ABSTRACT
Coffee husk and cassava bagasse are two of the most important byproducts of Brazilian agriculture
industrialization and constitute an environmental problem for this country. Because of its rich
composition they are potential substrates for the production of many cellular bioproducts of
commercial interest. In this work, it was proved that is possible to produce, at low cost, a high valued
metabolite as efficient as the commercial imported product. The gibberellic acid (GA3) is a natural
plant growth hormone used extensively in agriculture, nurseries, greenhouses, viticulture etc. It is
traditionally produced by multinational industries using submerged fermentation process, with high
production costs and prices. The solid-state fermentation (SSF) technique has shown economic
advantages over the submerged fermentation for the production of microbial metabolites. In addition,
SSF is known for its cheaper processes and the possibility of using agroindustrial residues. In this
work, different fermentative systems were studied for the production of GA3 by SSF of the fungus
Gibberella fujikuroi, using a mixture of coffee husk and cassava bagasse as substrate. In aired
columns, a production of 0.925 g GA3.(kg substrate)-1 was achieved after 6 days of fermentation, with
an aeration rate of 0.24 l air.h-1.(g substrate)-1, in the first three days, and of 0.72 l air.h-1.(g substrate)-1
in the remaining period. With the respirometric data, a logarithmic correlation between CO2 and
biomass production was determined. The pilot-scale bioreactor yielded the same kind of correlation.
This system showed the best results, reaching 1.19 g GA3.(kg substrate)-1, with an initial moisture of
77% and pH 5.4. Initial air flow was 0.12 l air.h-1.(g substrate)-1, and after three days, 0.48 l air.h-1.(g
substrate)-1. A bioassay using tomato seedlings was carried out in order to compare the GA3 produced
by SSF to the commercial product. No significant difference in the height of the seedlings was
observed.
Key-words: gibberellic acid, solid state fermentation, coffee husk, cassava bagasse, respirometry
xii
1
INTRODUÇÃO
O ácido giberélico (GA3) é um hormônio natural em plantas e importante promotor e
regulador de seu crescimento. Nos últimos anos este metabólito tem sido produzido apenas
por grandes indústrias multinacionais pelo processo de fermentação submersa (FSm), com
alto custo de produção (KUMAR & LONSANE, 1989). Assim, apesar de possuir um grande
número de aplicações, sua utilização ainda é limitada principalmente por seu preço (US$ 1 a
3/grama dependendo da pureza e potência). A redução deste valor levará suas diversas
aplicações a uma utilização mais extensa trazendo benefícios econômicos à agricultura. Uma
possibilidade de diminuição dos custos está na pesquisa de novas técnicas de fermentação.
A técnica de fermentação no estado sólido (FES) é conhecida pela produção de
metabólitos na maioria dos casos em níveis muito maiores que a fermentação submersa. Além
disso, é caracterizada por processos mais baratos, além da possibilidade de aproveitamento de
resíduos agro-industriais. De fato, nos últimos anos estudos deram origem a uma série de
novos processos, bem como muitas publicações científicas demonstrando as vantagens desse
método de fermentação, especialmente quando se trabalha com fungos filamentosos
(SOCCOL, 1997a, 1997b; SOCCOL & VANDENBERGHE, 2002).
O Brasil é o maior produtor mundial de café, tendo produzido na safra 2001/02, 33,7
milhões de sacas (ABECAFÉ, 2002). A casca de café é o principal resíduo de seu
processamento, representando cerca de 50% em massa do mesmo. Esse resíduo, praticamente
não é aproveitado, sendo deixado em pilhas perto das fazendas e causando um grande
problema ambiental. Uma possibilidade de aproveitamento da casca de café é como meio de
cultivo para microrganismos, na produção de diferentes metabólitos ou biomassa (SOARES,
1998; LEIFA, 1999; WOICIECHOWSKI, 1999; SOCCOL, 2002).
A mandioca constitui um dos principais alimentos energéticos para cerca de 500
milhões de pessoas sobretudo nos países em desenvolvimento. Além da destacada
importância na alimentação humana e animal, as raízes de mandioca são também utilizadas
como matéria-prima em inúmeros produtos industriais (EMBRAPA, 2002). O bagaço de
mandioca é um dos resíduos de seu processamento e possui atualmente poucas aplicações. Por
sua composição (contém entre 40 e 70% de amido), constitui-se um substrato interessante
para processos fermentativos, tendo sido estudado para produção de ácido cítrico, ácido
fumárico, aromas, cogumelos, entre outros produtos (BEUX, 1996; BRAMORSKI et al.,
2
1998a; MEDEIROS, 1998; CARTA, et al., 1999; PANDEY et al., 2000; SOCCOL &
VANDENBERGHE, 2002.
Em trabalhos anteriores, (MACHADO et al., 2002; MACHADO et al., 2001;
MACHADO, 2000) demonstrou-se que a mistura de casca de café e bagaço de mandioca é
uma alternativa viável para a produção de GA3 por FES utilizando-se o fungo Gibberella
fujikuroi LPB-06. A tecnologia desenvolvida empregando frasco erlenmeyer como biorreator
alcançou bons resultados, tendo inclusive, sido patenteada pelos autores (SOCCOL et al.,
2000).
A melhor produção alcançada foi de 494,3 mg GA3kg-1substrato, utilizando-se como
substrato uma mistura de bagaço de mandioca e casca de café pré-tratada em proporção 3:7,
adicionada de solução salina constituída de 30 mg FeSO4 e 10 mg de (NH4)2SO4/100 ml de
H2O. As condições de fermentação foram temperatura 29 ºC, pH 5,3 e umidade de 77%
(MACHADO, 2000; SOCCOL et al., 2000).
Uma vez que a produção de GA3 apresentada foi a maior encontrada na literatura para
FES conduzida em frascos erlenmeyer e que os substratos utilizados são resíduos agro-
industriais abundantes no país, considerou-se de grande importância que houvesse
continuidade no trabalho desenvolvido.
Esta tese trata, portanto, do estudo da produção de GA3 por FES em biorreatores de
colunas aeradas em escala de laboratório (20 g substrato/coluna) e em biorreator escala piloto
(3 kg substrato). Também são feitos estudos cinéticos e respirométricos do processo em
diferentes sistemas fermentativos e bioensaios com o produto obtido, para comprovação de
sua eficiência.
3
OBJETIVO GERAL
Estudo da produção de ácido giberélico em diferentes sistemas fermentativos,
utilizando-se o fungo Gibberella fujikuroi, num processo de fermentação no estado sólido
(FES), empregando-se a mistura casca de café – bagaço de mandioca como substrato.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Otimização do processo de fermentação no estado sólido em colunas de aeração
forçada, a partir das condições utilizadas em frasco erlenmeyer (MACHADO,
2000) variando-se aeração e umidade inicial do meio de cultivo;
b) Determinação da cinética de crescimento microbiano a partir de cálculos cinéticos
e de respirometria do processo otimizado, comparando-o com dados existentes para
Fermentação Submersa e FES com diferentes substratos;
c) Estudos cinéticos e respirométricos do processo de fermentação no estado sólido
em biorreator escala piloto com variação do modo de alimentação e da aeração, e
comparação com o sistema em colunas de aeração forçada;
d) Determinação da eficiência do bioproduto obtido através de ensaios biológicos do
extrato bruto da fermentação.
4
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1. ÁCIDO GIBERÉLICO
As giberelinas (GAs) constituem uma grande família de ácidos diterpenóides
estreitamente relacionados, representando um grupo importante de potentes hormônios de
crescimento de plantas. As giberelinas conhecidas se identificam pelos números subscritos
GAn, onde n é o número que corresponde, aproximadamente, à ordem cronológica em que
foram descobertas (HILL, 1977; ARTECA, 1995).
Todas as giberelinas possuem um esqueleto ent-giberelano, e são divididas em dois
grupos baseados no número de carbonos. Um grupo possui 19 carbonos e o outro, 20.
Entretanto, a estrutura básica de todas as giberelinas e a numeração é similar, como mostrado
na figura 1 (KUMAR & LONSANE, 1989).
1.1 HISTÓRICO
A primeira publicação científica sobre as giberelinas deu-se em 1898 com um artigo
de Shotaro Hory sobre a doença “bakanae”, ou “doença da plantinha boba”. Esta é uma das
mais antigas enfermidades que afetam o arroz no oriente, especialmente no Japão. As plantas
doentes tornam-se mais delgadas e longas e com uma cor amarelada nas partes afetadas. Após
um crescimento muito rápido, as plantas infectadas morrem. Hory demonstrou que os
5
1.3.1 Floração
As giberelinas podem induzir floração em plantas mantidas em condições não
indutivas. Assim, elas podem substituir uma condição específica do meio ambiente, sem a
qual uma espécie pareceria vegetativa. Os maiores efeitos são encontrados em dois tipos de
planta, as que precisam de dias longos (DL) para indução floral, e as que requerem em
período de frio (vernalização) (TAKAHASHI, 1986; METIVIER, 1979; WEAVER, 1972).
terceira fileira poderá ser pulverizada com GA3 que promoverá a formação de um número
suficiente de flores masculinas para polinizar a cultura (TAKAHASHI, 1986; METIVIER,
1979; GALSTON & DAVIES, 1972).
1.3.3 Partenocarpia
As giberelinas, assim como as auxinas, podem induzir a formação de frutos sem o
processo normal de fecundação. Isto está provavelmente relacionado ao fato de que ocorre um
grande aumento da giberelina endógena no embrião e no endosperma após a fertilização e que
este alto nível é mantido através do desenvolvimento do fruto e da semente. O tamanho e a
forma do fruto também podem ser afetados pela aplicação de giberelina à planta-mãe ou ao
fruto isolado (GALSTON & DAVIES, 1972; METIVIER, 1979; TAKAHASHI, 1986).
1.3.6 Crescimento
Os efeitos mais conhecidos das giberelinas aparecem no crescimento, especialmente
no alongamento do caule. O desenvolvimento foliar também pode ser aumentado. Em muitos
capins e pastagens, quando as temperaturas estão baixas, o crescimento é restrito e o gado tem
que ser alimentado com feno armazenado. A aplicação de giberelinas pode, entretanto,
9
na disposição das águas. Além disso, o custo da separação das células por centrifugação ou
microfiltração envolve entre 48 e 76% do custo total de produção do metabólito por FSm.
(JEFFERYS, 1970; KUMAR & LONSANE, 1989).
terminais, uma vez que quando são alimentadas à culturas de G. fujikuroi, os substratos são
recuperados sem modificação alguma (BRÜCKNER & BLECHSCHMIDT, 1991).
A principal giberelina produzida pelo Gibberella fujikuroi é o ácido giberélico. A
quantidade das outras 24 diferentes giberelinas identificadas depende de constituição genética
do fungo e condições do meio de cultivo, tais como pH e quantidade de nitrogênio inorgânico.
Dessas, 15 também são encontradas nas plantas superiores e 10 estão restritas ao
microrganismo (BRÜCKNER & BLECHSCHMIDT, 1991).
Nesta fase é que ocorre a maior produção de giberelinas. Exceto para a continuação
de absorção da fonte de carbono, nenhum outro nutriente é absorvido pela célula e o peso seco
do micélio permanece constante. Mesmo após a exaustão da fonte de carbono no meio, a
produção de GAs continua até a reserva de gordura ser reduzida ao nível que havia na fase
balanceada.
f) Fase terminal
Há um aumento dos vacúolos, perda do conteúdo celular até a decomposição das
células miceliais, devido à não disponibilidade de fonte externa e interna de carbono
utilizável. Consequentemente, isto leva a um retorno da amônia, potássio, magnésio e fosfato
para o meio. O pH do meio também aumenta e leva a um decréscimo no peso micelial seco.
1.8.3 pH
A variação do pH é um dos fatores mais influentes na seleção da giberelina a ser
produzida. Para produção de GA3 o valor inicial de pH geralmente empregado está na faixa de
3,5 – 5,8. O aumento do pH levará a uma maior produção de GA4,7 e meios fortemente ácidos
(pH < 3,5) levam a um aumento na produção de GA1 (KUMAR& LONSANE, 1989).
Em FES a medida de pH é complexa. Desta forma, existem poucos registros na
literatura descrevendo os valores utilizados para a produção de GA3. GELMI et al.(2000),
utilizando suporte inerte de amberlite, estabeleceram para o sistema estudado um pH inicial
16
1.8.4 Temperatura
O efeito da temperatura sobre a produção de GA3 usando G. fujikuroi ou F.
moniliforme é dependente da cepa empregada (BRÜCKNER & BLECHSCHMIDT, 1991).
Mas, segundo JEFFERYS (1970), ao revisar diversos trabalhos, pode-se considerar que a
temperatura ótima para reprodução das cepas está entre 31 e 32 oC, enquanto que para a
produção de GA3 utiliza-se uma temperatura máxima de 29 ºC.
1.8.5 Aeração
É bem reconhecido que um contínuo suprimento de oxigênio é requerido para
produção de GA3, uma vez que sua biossíntese progride através de compostos de crescentes
níveis de oxidação. Uma vez que a taxa de consumo de oxigênio para a produção de micélio
na fase logarítmica deve permanecer constante, a demanda por oxigênio aumenta
aproximadamente de forma exponencial (TUDZYNSKI, 1999). JEFFERYS (1970) sugere
que a aeração deva ser a mais vigorosa possível, existindo notícias de rotações entre 150 e
1400 rpm, em fermentação submersa. Em FES, BANDELIER et al. (1997) utilizaram uma
vazão de ar de 0,9 l.(h.kg MS)-1 em reator batelada-alimentada, TOMASINI et al. (1997) de
0,42 l.(h.kg MS)-1 e GELMI, et al. (2000) 0,46 l.(h.kg MS)-1 em reator de colunas.
O modo de crescimento dos fungos, sua boa tolerância a baixas aw e altas pressões
osmóticas os fazem eficientes e competitivos com a microflora natural para bioconversão de
substratos sólidos. O crescimento por hifas dá aos fungos uma maior vantagem sobre os
microrganismos unicelulares na colonização do substrato sólido e utilização dos nutrientes
disponíveis, dando ao fungo filamentoso, o poder de penetrar no substrato sólido. A ligação
da parede celular aos filamentos e o micélio proporcionam uma estrutura firme e sólida. As
enzimas hidrolíticas são excretadas nas hifas sem grande diluição como ocorre na FSm, o que
faz com que sua ação seja muito mais eficiente, permitindo a penetração no substrato e
aumentando a acessibilidade de todos os nutrientes disponíveis nas partículas.
(RAIMBAULT,1997)
Tanto substâncias sintéticas como naturais podem ser utilizadas nos processos de FES.
Na natureza a maioria dos materiais orgânicos disponíveis é de estrutura polimérica, tais
como polissacarídeos, proteínas e ligninas, conferindo determinadas propriedades de sólido
ao substrato. Em geral, todos podem ser utilizados pelos microrganismos como fonte de
nutrientes, bem como serem utilizados como suporte inerte no qual carbono e fontes de
energia (açúcares, lipídios, ácidos orgânicos) são adsorvidos. (HESSELTINE, 1972).
No Laboratório de Processos Biotecnológicos da UFPR diversos resíduos
agroindustriais, celulósicos ou amiláceos têm sido utilizados para a produção de biomassa ou
metabólitos em FES. Alguns exemplos são mostrados no quadro 5, a seguir:
Na maioria dos casos estes resíduos utilizados como substrato são formados por
estruturas complexas que geralmente são pouco acessíveis ao ataque microbiano. Assim, a
preparação e o pré-tratamento representam etapas necessárias para converter um resíduo em
forma passível de uso, incluindo redução de tamanho por moagem e/ou seleção; hidrólise
físico-química ou enzimática das grandes cadeias de açúcares para torná-los acessíveis aos
microrganismos; suplementação com nutrientes (fósforo, nitrogênio, sais) e adequação do pH
21
b) Metabolismo de respiração
O consumo de O2 e CO2 é o resultado da respiração, o processo metabólico pelo qual
os microrganismos aeróbios retiram a maior parte de sua energia de crescimento. Essas
23
atividades metabólicas são, portanto, associadas ao crescimento e podem ser utilizadas para a
biossíntese de biomassa. À medida que os compostos de carbono são metabolizados, eles são
convertidos em biomassa e dióxido de carbono. A produção de CO2 causa a diminuição do
peso do substrato fermentado ao longo do crescimento, e a quantidade de perda de peso pode
ser correlacionada com o crescimento que ocorreu. A estimativa do crescimento baseada na
produção de CO2 ou consumo de O2 assume que o metabolismo destes dois componentes é
completamente associado ao crescimento, o que significa que a quantidade de biomassa
produzida por unidade de gás metabolizado é constante. Isso, no entanto, não é
completamente correto uma vez que existem modificações em diferentes etapas do
crescimento, como germinação, crescimento vegetativo, metabolismo secundário, esporulação
e degeneração do micélio (RAIMBAULT, 1997).
A medida do metabolismo dos gases é mais eficiente se for considerado um modelo de
correlação. A aplicação destes modelos envolvendo predição do crescimento a partir de
determinações das taxas de O2 e CO2 requer o uso de técnicas numéricas para resolver
equações diferenciais. Dessa forma, o uso de computador e software adequado, é essencial.
Se há disponibilidade de equipamento de monitoramento e computacional estes modelos de
correlação são uma ferramenta poderosa de estimativa de biomassa uma vez que medidas
contínuas on-line podem ser feitas. Outra vantagem do monitoramento de concentrações de
gás efluente com analisadores paramagnéticos e infravermelhos, inclui a habilidade de
monitorar o quociente respiratório para assegurar uma ótima oxidação do substrato, a
habilidade de incorporar controle de retroalimentação automatizada sobre a taxa de aeração e
a natureza não destrutiva do procedimento de medida (RAIMBAULT, 1997).
Onde:
X: concentração de biomassa (gbiomassa.l-1 ou gbiomassa.kg-1);
t: tempo (h);
S: substrato ((g MS).l-1 ou (g MS).kg-1);
T: temperatura (ºC)
O primeiro termo na equação (1) é a velocidade ou termo cinético. Ele representa a
variação de concentração de biomassa em relação ao tempo. A partir da representação gráfica
desta equação podem-se determinar parâmetros como a concentração máxima de células
obtida na fermentação, tempo de crescimento de biomassa no reator, substrato consumido no
processo e relação biomassa/substrato obtida no processo.
MONOD (1942) foi um dos primeiros cientistas a descrever matematicamente um
processo fermentativo. Ele propôs um modelo que correlaciona a síntese da biomassa com o
substrato consumido. Este modelo é:
S
µ = µ max (2)
KS + S
26
Onde:
µ: taxa de crescimento específico (h-1);
µmax : taxa de crescimento específico máximo (h-1);
S: concentração de substrato (g.l-1);
Ks : constante de afinidade biomassa/substrato.
No modelo proposto por Monod (eq. 2), o tempo não está explícito, mas é incluído no
termo chamado taxa de crescimento específico, que é independente do processo e definido
por:
1 dX
µ= (3)
X dt
Onde:
X : concentração da biomassa em um determinado tempo (g.l-1).
A taxa de crescimento específico definida pela expressão (3) permitiu a representação
do padrão cinético de crescimento microbiano por diferentes fases, conhecidas como: fase de
crescimento: fase Lag (µ ≈ 0); fase de crescimento acelerado (µ > 0); fase de crescimento
exponencial (µ = µmax) fase de crescimento desacelerado (µmax >µ >0), fase de crescimento
estacionário (µ = 0) e fase de taxa negativa de crescimento (µ < 0).
A fase de crescimento logarítmico ou exponencial é a mais importante de uma
fermentação. É caracterizada pela taxa de crescimento constante e máxima. Aplicando-se a
função (3) para essa fase, e estabelecendo-se que na fase exponencial µ = k, onde k é uma
constante, tem-se que:
X dX t
∫
X0 X
= ∫ µdt
0
(4)
para a concentração de biomassa dobrar. Então, para seu cálculo, considera-se na equação (5),
que: x = 2X0 e t0 = 0. Assim:
ln 2
td = (6)
µ max
Outro parâmetro importante que pode ser obtido em função de µ., é a produtividade da
biomassa (P), dada em gbiomassa.h-1, e definida por:
P = µx (7)
O último parâmetro diretamente relacionado com µ, é o rendimento biomassa /
substrato consumido (YX/S):
XS − X0
YX / S = (8)
S0 − St
Onde:
YX/S : rendimento biomassa/substrato consumido (adimensional);
S0: concentração inicial do substrato (g.l-1);
S : concentração final do substrato (g.l-1);
X0: concentração inicial de biomassa (g.l-1);
X : concentração inicial de biomassa (g.l-1).
Uma vez que o rendimento biomassa/substrato é adimensional, costuma-se representá-
lo em percentagem.
confiáveis. De fato, este método pode ser considerado uma medida direta da cinética do
processo. A seguir, serão demonstradas as principais equações envolvidas na respirometria de
um processo fermentativo, segundo Pandey et al., 2001.
Assumindo que no fermentador entra ar puro, pode-se considerar que a sua
composição em porcentagem volumétrica é de 21 e 79% respectivamente para O2 e N2. As
vazões volumétricas de O2 e N2 são dados pelas expressões:
21
VO2e = Fe (9)
100
79
VN 2e = Fe (10)
100
Onde:
VO2e : vazão volumétrica de oxigênio na entrada do fermentador (l.h-1);
VN2e : vazão volumétrica de nitrogênio na entrada do fermentador (l.h-1);
Fe : vazão de ar na entrada do fermentador (l.h-1).
O cálculo das vazões volumétricas de saída dos gases do fermentador é baseado na
composição centesimal em O2 e CO2 que os mesmos apresentam. Considerando que na
corrente de saída só estão presentes O2, CO2 e N2:
%O2 s
VO2 s = FS (11)
100
%CO2 s (12)
VCO2 s = FS
100
100 − %O2 s − %CO2 s (13)
VN 2 s = FS
100
Onde:
VO2s : vazão volumétrica de oxigênio na saída do fermentador (l.h-1);
VCO2s: vazão volumétrica de gás carbônico na saída do fermentador (l.h-1);
VN2s: vazão volumétrica de nitrogênio na saída do fermentador (l.h-1);
Fs : vazão de ar na saída do fermentador (l.h-1).
Fazendo o balanço de massa para o O2 e relacionando-o com as equações 9 e 11 tem-
se a expressão da vazão volumétrica de oxigênio consumido na reação
21 %O2 s (14)
VO2c = Fe − FS
100 100
29
0,79%CO2
VCO2 s = Fcorr (19)
(100 − %O 2 − %CO )
2
3. SUBSTRATOS
3.1 CAFÉ
O cafeeiro pertence ao grupo das plantas Fanerógamas, classe Angiosperma, subclasse
Dicotiledônea, ordem Rubiales, Família das Rubiáceas, gênero Coffea. É uma planta de porte
arbustivo, caule lenhoso, lignificado, reto e quase cilíndrico. Pode chegar naturalmente de 10
a 12 metros, mas na sua cultura é mantido a 2 ou 3 metros para facilitar a colheita dos frutos.
Suas folhas são opostas, inteiras, tendo coloração verde mais escura e brilhante na parte
superior do limbo, e mais clara e opaca, com nervuras salientes, na parte inferior. Nos ramos
laterais e nas axilas das folhas, são formadas as gemas florais, que dão origem à floração e
frutificação. As flores são normalmente brancas, podendo ser amareladas e rosa claro,
apresentando 5 pétalas em Coffea arábica. (MATIELLO, 1991; COMITÉ FRANÇAIS DU
CAFÉ, 1997).
O fruto do café é uma drupa elipsoidal com três eixos: um longitudinal mais comprido
e dois transversais de diferente dimensão, devido à posição das duas sementes plano convexas
que contém. É constituído pelo pericarpo, onde podem se distinguir três camadas de tecidos:
as duas mas externas (epicarpo e mesocarpo), que em conjunto se designam comumente por
“polpa”, constituem uma zona suculenta e facilmente desintegrável do fruto; a mais interna,
chamada “pergaminho” é uma camada dura de fibras amareladas que envolve cada uma das
sementes (figura 4). No cafeeiro arábica, polpa e pergaminho separam-se facilmente, no
robusta, aderem mais. (MATIELLO, 1991; CARDOSO, 1994).
32
SAFRAS 2001/02
Uganda
12,25 Costa do Marfim
Etiópia
11,00 33,70
Guatemala
5,98 Índia
México
4,70 Indonésia
Colômbia
4,65
Vietnam
3,83 Brasil
3,303,25 24,31
3,77 Outros
2002). O café é responsável por significativa geração de divisas para o país, da ordem de 2,5
bilhões de dólares por ano. Ele tem, ainda, efeito multiplicador na forma de taxas e impostos
arrecadados pelos governos dos Estados e dos municípios e resulta em renda e empregos para
os setores de comércio e indústria (MATIELLO, 1991).
O café colhido é lavado, resultando em duas frações: o café chamado “bóia” e o café
“miúdo”. As duas frações são, então, secas separadamente. Então o café vai uma etapa de
beneficiamento, na qual os grãos são separados de impurezas através de peneiras vibratórias.
O café limpo sofre então o descasque, em descascadores de percussão ou fricção. Nestas
máquinas o café “coco” é impulsionado violentamente pela rotação de um cilindro horizontal
contra lâminas de aço. Dessa forma, os tecidos secos do epicarpo mesocarpo e endocarpo que
o envolviam são quebrados e, em conseqüência, separam-se das sementes. A separação das
cascas é feita por ventilação que as lança para fora em montes ou depósitos próprios fora do
armazém. Esta casca constitui o principal resíduo da industrialização do café, representando
cerca de 50% em massa, do mesmo. O café descascado é selecionado, embalado e enviado
para a indústria de torrefação e de fabricação de café solúvel (MATIELLO, 1991;
CARDOSO, 1994, MASSON, et al., 1984 a; 1984 b).
produção anual superior de um milhão de toneladas no Brasil. Esse resíduo praticamente não
é aproveitado, sendo deixado em pilhas perto das fazendas e causando um grande problema
ambiental.
Apesar de seu potencial poluente e de sua riqueza nutricional (composição próxima à
do grão), existem poucos trabalhos na sua caracterização e possível utilização como matéria
prima para a indústria. A maioria dos trabalhos existentes foram feitos por pesquisadores de
países da América Latina como México, Cuba, Guatemala e tratam do aproveitamento da
polpa, uma vez que este é o principal resíduo gerado no processamento por via úmida, feito
por esses países. A casca do café é formada pela polpa (epicárpio + mesocárpio) e o
pergaminho (endocárpio), a primeira representando cerca de 75%. Dessa forma, a composição
química e as possíveis utilizações são semelhantes (tabela 1).
4. MANDIOCA
A mandioca é uma planta pertencente à família das euforbiáceas. O gênero “Manihot”
apresenta várias espécies que são cultivadas no Brasil e, dependendo do teor de ácido
cianídrico em suas raízes, ela pode ser chamada brava ou mansa. Sua cultura adapta-se às
condições ecológicas mais variadas, podendo ser cultivada em áreas de altas precipitações
pluviais, superiores a 2000 mm/ano, clima equatorial como em áreas de clima semi-árido,
com precipitações inferiores a 1000 mm/ano. O Brasil é considerado o maior centro de
difusão da sua cultura, seguido da América Central (CARIOCA e ARORA, 1984, BEZERRA,
2000).
É uma planta arbustiva lenhosa perene, de 1,3-5 m de altura, semeada através de
estacas retiradas das ramas, as quais demonstram uma forte dominância apical, que leva ao
desenvolvimento de raízes laterais armazenadoras de grande quantidade de amido (figura 7).
37
Cada planta pode produzir de 5 a 10 tubérculos, e cada tubérculo chega a atingir de 20-80 cm
de comprimento e 5-10 cm de diâmetro. O peso seco dos tubérculos varia de algumas
centenas de gramas a 5 quilogramas. A tabela 4 abaixo mostra a composição média dos
tubérculos (BEZERRA, 2000; PANDEY et al., 2001; PANDEY et al., 2000).
MATERIAL E MÉTODOS
A parte experimental do presente trabalho foi toda desenvolvida no Laboratório de
Processos Biotecnológicos da UFPR, exceto pelos ensaios biológicos que foram feitos na
Embrapa Hortaliças em Brasília.
5. MICRORGANISMO E SUBSTRATOS
5.1 MICRORGANISMO
A cepa de Gibberella fujikuroi LPB-06, é pertencente à micoteca do LPB e foi isolada
de uma planta infectada. O fungo é repicado em tubos inclinados contendo ágar dextrose-
batata (BDA), incubado a 32 ºC, por um período de 8 dias e conservado à 4 ºC durante o
período máximo de 90 dias. O procedimento para preparo da solução-semente utilizada como
inóculo na FES é mostrado na figura 10, a seguir (BANDELIER, et al., 1996, MACHADO,
2000).
5.2 SUBSTRATOS
A casca de café utilizada foi cedida pelo Instituto Tecnológico do Paraná (TECPAR),
chegou ao LPB em sacas de 10 kg. O bagaço de mandioca foi proveniente da indústria Lorenz
(Quatro Pontes, PR). No laboratório ambos os substratos foram triturados em moinho de disco
(ALPHA) e selecionados em peneiras, sendo utilizadas, nesta tese, as partículas entre 0,8 e
2,0 mm.
O meio sólido consiste em casca de café pré-tratada (CC) com solução alcalina KOH
0,25% em autoclave a 100 ºC por 45 minutos e bagaço de mandioca (BM) na razão 7:3. O
pré-tratamento da casca de café é necessário para a remoção de componentes como ácidos
caféico, clorogênico e tânico presentes neste resíduo e que são inibidores da biossíntese de
GA3. A adição de BM ao meio de cultivo é feita para um deslocamento da razão C:N natural
da casca de café, conforme mostrado no item 1.8.1.
O pH (entre 5,0 e 5,4) e a umidade foram ajustados pela adição de solução salina
constituída por 30 mg de FeSO4 e 10 mg de (NH4)2SO4 /100 ml H2O Este meio foi então
esterilizado em autoclave a 121 oC por 20 minutos. O pré-tratamento, a razão CC:BM, o pH
e a solução salina utilizados foram otimizados em trabalhos anteriores (MACHADO, 2000;
SOCCOL, 2001).
6. ANÁLISES DO FERMENTADO
As análises físico-químicas efetuadas no material fermentado foram: umidade,
nitrogênio real, açúcares solúveis totais, não redutores e redutores, pH, atividade de água,
perda de peso do substrato e produção de ácido giberélico, segundo as metodologias descritas
a seguir:
a) Umidade: método termogravimétrico: 100 –105 ºC (IAL, 1985);
b) Atividade de água (aw): medidor de aw marca Aqualab, modelo CX-02;
c) pH: uso de potenciômetro (LABSTORE, PL-800) em uma suspensão obtida após
homogeneização por agitação de 5g de amostra diluída em 50 mL de água destilada.
d) Perda de peso do substrato: diferença de peso percentual entre as colunas
empacotadas antes e após a fermentação
e) Proteína real: precipitação da proteína real pelo método de Stutzer (VERVACK,
1973) e posterior quantificação de nitrogênio pelo método de Kjeldahl (IAL,1985);
f) Açucares solúveis totais, redutores e não redutores: método espectrofotométrico de
Somogyi-Nelson (NELSON, 1944; SOMOGYI, 1945);
43
ONDE: 1. injeção de ar com pressão regulada; 2. banho de água com temperatura controlada;
3. fermentadores em coluna; 4. tubos com sílica-gel; 5. amostrador de gás;
6. injetor de gás; 7. cromatógrafo gasoso; 8. computador
FONTE: SAUCEDO-CASTAÑEDA et al. (1994)
Para o melhor ajuste das variáveis foram necessários três experimentos, todos
completos 3(2-0), com duas repetições do ponto central, resultando em 11 colunas (ensaios).
Após sete dias de fermentação as colunas foram retiradas e analisadas quanto ao seu conteúdo
de GA3.
No planejamento e verificação dos resultados utilizou-se o programa Statística da
Statsoft. Além da produção de ácido giberélico, determinou-se após sete dias de fermentação a
perda de peso do substrato, umidade, atividade de água e pH finais do mesmo.
A taxa de crescimento específico máximo (µmax) é calculada pela mesma equação (22),
sendo considerado o intervalo de tempo onde há crescimento exponencial. A taxa de
crescimento específico global ( µ ) foi calculada como a média das taxas de crescimento
específico diárias.
47
O consumo horário máximo de substrato (rSmax) é calculado pela mesma equação (24),
no período linear de maior consumo de substrato. O consumo horário global de substrato rS é
dado pela média dos valores de rS diários.
c) Produção horária de GA3 (rP)
É calculado de forma similar ao rS, fazendo-se as mesmas considerações para a
produção horária máxima (rPmax) e global ( rP ) de GA3 (equação 25).
P2 − P1
rP = (25)
t 2 − t1
onde: P = concentração de GA3 (g.(kg MS)-1);
t = tempo (h);
rP = produção horária de GA3 (g.(kg MS.h)-1).
7.4 RESPIROMETRIA
Na mesma fermentação onde foi feita a cinética do crescimento microbiano e
produção de metabólito também se fez a análise da respiração dos microrganismos
(respirometria). Para tanto, foram acopladas quatro colunas de fermentação ao cromatógrafo
gasoso, que injetava automaticamente a cada 15 minutos uma amostra da corrente gasosa de
saída das mesmas. Os resultados obtidos foram considerados como uma quadruplicata e fez-se
a média dos mesmos para análise dos dados.
48
A agitação foi feita periodicamente através de pás paralelas ao casco, numa velocidade
muito baixa (5 rpm). Dessa forma, a agitação é por tombamento do material e não por
cisalhamento do mesmo.
Em todas as fermentações as condições foram: umidade inicial do meio – 77%; pH
inicial entre 5,0 e 5,4, temperatura desejada 29 ºC, inóculo de 15% massa:volume de solução-
semente ao meio sólido, tempo de fermentação de 6 dias.
50
8.4 RESPIROMETRIA
As análises respirométricas feitas em reator escala piloto foram realizadas da mesma
forma que em colunas de aeração forçada, exceto pela não existência de repetição de cada
ponto estudado. Foram usadas duas colunas, com corridas de 30 minutos. Em uma delas
passava o ar de saída do reator e em outra, ar ambiente (sem CO2). Assim, os pontos para
análise foram coletados de hora em hora.
Foram plantadas em solo comercial sementes de tomate em três caixas-teste com 128
células. Após 14 dias de emergência aplicou-se Pachlobutrazol 100 CEMR, numa diluição de
0,2% em água. Este produto, fabricado por Jianhu Pesticide Factory (China), é um regulador
de crescimento vegetativo por inibição da síntese de giberelinas na planta. Após três semanas
desta aplicação quando já havia um desenvolvimento das plantas foram retiradas ao acaso 15
52
mudas de cada caixa para controle da homogeneidade entre amostras e nas plantas
remanescentes foi feito o bioensaio com GA3 (figura 15).
9.2 BIOENSAIO
Cada uma das caixas foi considerada um tratamento. No primeiro, a testemunha, fez-se
aspersão de água. No outro grupo foi feita aspersão de 200 mg GA3.(l H2O)-1, usando-se ácido
giberélico P.A., da marca Sigma Aldrich com 95% de pureza. No terceiro tratamento,
aplicou-se o extrato bruto em tampão fosfato pH 7,4 da fermentação. Diluiu-se o mesmo de
modo que a concentração de GA3 fosse a mesma que no tratamento com o produto comercial.
Após 4 e 8 dias da aplicação foram retiradas ao acaso 15 mudas de cada tratamento.
Estas foram lavadas e em seguida feitas medidas de comprimento da planta, peso da raiz, peso
da parte aérea das amostras. Foram reunidas as amostras de raiz e parte aérea de cada
tratamento, os grupos foram pesados e secos em estufa com circulação de ar por 48 h a 55ºC
para o cálculo do peso seco da raiz e parte aérea de cada tratamento.
53
RESULTADOS E DISCUSSÃO
(1)Umidade(L) 5,843132
1Lpor2L -2,81334
Umidade(Q) 2,185949
(2)Aeração(L) -1,50763
1Qpor2L 1,491009
1Qpor2Q ,8223833
1Lpor2Q -,519584
Aeração(Q) ,0746061
-1 0 1 2 3 4 5 6 7
Efeito estimado (valor absoluto)
chega-se ao ponto ótimo quando a resposta desejada (superior ou inferior, conforme o caso)
aparecer inteiro no centro da superfície, sugerindo que o aumento ou diminuição de qualquer
fator irá afetar negativamente a variável resposta. Como observado na figura 17, neste
experimento ainda não se conseguiu que o ponto ótimo (neste caso o nível mais alto –
vermelho escuro) ficasse limitado na superfície. Assim, faz-se necessária uma nova
otimização.
Uma maneira de se avaliar o modelo obtido é considerar a análise de variância –
ANOVA (tabela 9). O procedimento usual de avaliação do desempenho de um modelo
começa pela análise dos desvios das observações em relação à média global. Esta análise é
representada pelo coeficiente de determinação (R2). O valor R2 pode ser interpretado como a
proporção da variância em y que pode ser atribuída à variância em x, que varia entre 0 e 1. O
melhor valor para R2 é 1, e ele só ocorrerá se não houver resíduo algum, e portanto, toda a
variação em torno da média for explicada pela regressão (BARROS NETO, SCARMINIO &
BRUNS, 1996).
Outros termos estatísticos utilizados na ANOVA são a razões F (F-value) e p (p-
value). A primeira mede quão grande é o coeficiente em relação ao erro padrão. Assim, uma
maior razão F em módulo relaciona-se a um fator mais significativo na variável resposta. A
razão p é a probabilidade que um determinado fator tem de aumentar sua razão F, ou seja, de
ter maior influência na variável resposta. Dessa forma, valores menores da razão p
relacionam-se com grandes razões F, pois isso implica que a razão F é muito maior que o erro
padrão (HAALAND, 1989).
Como já havia sido observado no diagrama de Pareto, o fator com maior influência é
a umidade linear, seguida pela interação entre as variáveis lineares e a umidade quadrática.
57
Segundo HAALAND (1989) para um modelo ser adequado, o R2 deve ser no mínimo 0,75.
Valores acima de 0,90, como o obtido nesta otimização, são considerados muito bons.
p=,05
(1)Umidade(L) 11,96322
(2)Aeração(L) -4,11933
1Lpor2L 3,245807
Aeração(Q) 1,889122
Umidade(Q) -1,49496
1Lpor2Q 1,185441
1Qpor2L -1,15377
1Qpor2Q ,8731006
-2 0 2 4 6 8 10 12 14
(IHLWRHVWLPDGRYDORUDEVROXWR
58
7HUFHLUDRWLPL]DomRHPFROXQDVDHUDGDV
9DULiYHOUHVSRVWDPJ*$
NJVXEVWUDWR
RQGH/ LQWHUDomROLQHDUH4 LQWHUDomRTXDGUiWLFD
p=,05
(1)Umidade(L) -3,78272
Aeração(Q) 2,163604
(2)Aeração(L) 1,768161
Umidade(Q) ,8863632
1Qpor2Q -,74795
1Lpor2L -,718094
1Lpor2Q -,689201
1Qpor2L -,270524
-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
(IHLWRHVWLPDGRYDORUDEVROXWR
No contorno de resposta (figura 21) tem-se a área ótima de aeração limitada entre 0,4 e
0,7 l ar.(h.g MS)-1. Apesar do nível mais alto da variável resposta não estar fechado quanto ao
eixo x (umidade) pode-se considerar que a otimização quanto a esta variável também está
finalizada, uma vez que níveis menores já foram testados nos experimentos anteriores e não
foram obtidos melhores resultados.
60
Na tabela 12 acima, são apresentados os dados utilizados nos cálculos dos parâmetros
cinéticos da fermentação. A produção máxima de GA3 se deu após 144 horas de fermentação.
Desta forma, o tempo máximo de fermentação usado nos cálculos foi 144 horas.
3,5
3,0
2,5
ln X (g/kg MS)
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0 24 48 72 96 120 144 168
tempo (h)
100
90 redutores totais não redutores
80
Concentração (g/kg MS)
70
60
50
40
30
20
10
0
0 24 48 72 96 120 144 168
tem po (h)
1,0
0,8
GA3 (g/kg MS)
0,6
0,4
0,2
0,0
0 24 48 72 96 120 144 168
tempo (h)
Por este critério, produziu-se, entre 0 e 144 horas 44,8 mg de GA3 .(g biomassa.)-1.
Existe uma certa dificuldade de comparação da produtividade com outros autores, uma
vez são utilizados substratos, cepas e reatores diferentes. Porém, parâmetros como o
crescimento específico máximo (µmax) e a conversão biomassa:produto são facilmente
calculados e podem ser fatores de confronto eficientes entre diferentes cepas e sistemas
fermentativos.
Em colunas de aeração forçada, GELMI et al. chegaram a 0,760 g GA3.(kg MS)-1 em
um suporte inerte de vermiculite, com solução nutriente após 5 dias de fermentação da cepa
G. fujikuroi ATCC 12616. O crescimento específico máximo (µmax) da cepa foi de 0,046 h-1
entre 0 e 48 horas. A conversão biomassa:produto (YP/X) foi de 65 mg de GA3 .(g biomassa)-1,
valor 40% maior que o obtido neste trabalho. Isso confirma a informação dada pelos autores
que a cepa utilizada é hiperprodutora de GA3. Por outro lado, percebe-se baixa eficiência do
sistema fermentativo utilizado, uma vez que houve pouca produção de biomassa, e por
conseguinte, de produto. TOMASINI et al. (1997) obtiveram 0,24 g GA3.(kg MS)-1 após 3
dias de fermentação utilizando farinha de mandioca como substrato e a cepa G fujikuroi
NRRL 2278. O µmax obtido foi de 0,033 h-1 entre 0 e 48 horas, com uma conversão
biomassa/produto de 50 mg GA3 .(g biomassa)-1, revelando uma cepa com produtividade
semelhante à LPB-06, porém um sistema de produção menos eficiente que o estudado neste
trabalho.
10.3 RESPIROMETRIA
Os cálculos respirométricos foram feitos de acordo com o discutido na revisão de
literatura (cap.2.7). Assim, foram calculados g CO2 produzido.(h.g MS)-1 e g O2 consumido.
h-1. (g MS)-1, a cada ponto analisado (de hora em hora).
66
dX X
= µX 1 − (32)
dt X m
Æ
Xm Xm
X = β= −1 (33)
1 + βe − µ mt X0
onde: X = concentração da biomassa (g.(kg MS)-1) em um tempo t (h);
t = tempo (h);
µmax = taxa de crescimento específico máximo (h-1);
Xmax = concentração máxima de biomassa (g.(kg MS)-1);
X0 = concentração inicial de biomassa (g.(kg MS)-1)
Dessa forma, a qualidade do modelo matemático proposto pode ser avaliada, além do
coeficiente de determinação (R2), pelos valores de Xmax, X0 e µmax obtidos.
Feita a regressão dos dados de biomassa experimental da fermentação em colunas de
aeração forçada (tabela 12, no item 10.2), utilizando-se o programa Statistica da StatSoft,
obteve-se as seguintes constantes (R2 = 0,996):
a = Xmax = 24, 38
67
b = X0 = 1,171
c = µmax = 0,037
Comparando-se com os valores experimentais (Xmax = 24, 18 g.(kg MS)-1, X0 = 1,122
g.(kg MS)-1 e µmax = 0,0522 h-1) com as constantes da regressão acima, percebe-se uma
adequação satisfatória do modelo.
25
R2 = 0,9654
20
X estimada
15
10
0
0 5 10 15 20 25
X experim ental
determinada de acordo com o modelo de Monod. O µmax também entre 24 e 48 horas, e ficou
4 % menor. Já a taxa de crescimento média calculada entre 0 e 144 h de fermentação foi 10%
maior que a obtida com os valores experimentais. Porém esta diferença se dá, quando o µ
experimental é calculado entre 0 e 168 horas. Se o intervalo utilizado for o mesmo que o
utilizado para a biomassa estimada, tem-se um µ igual.
µmax = 0,0520 h-1 ou 1,25 dia-1 (entre 24 e 48 horas)
µ = 0,0206 h-1 ou 0,49 dia-1 (entre 0 e 144 h)
3,5
3,0
2,5
2,0
ln X
1,5
1,0
0,5
experimental estimada
0,0
0 24 48 72 96 120 144
tempo (h)
70
3,0
2,5
2,0
ln X
1,5
1,0
0,5
experimental estimada
0,0
0 24 48 72 96 120 144
tempo (h)
1,0
0,8
P (g/kg MS)
0,6
0,4
0,2
0,0
0 24 48 72 96 120 144
tempo (h)
3,0
R2 = 0,9935
2,5
2,0
ln X estimada
1,5
1,0
0,5
0,0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
ln X experim ental
3,0
2,5
2,0
ln X estimado
1,5
1,0
0,5
0,0
0 24 48 72 96 120 144
tem po (h)
O valor de µmax foi muito maior que para colunas e reator em batelada. Já a taxa de
crescimento específico global foi um pouco menor que a obtida nas outras fermentações, uma
vez que a estabilização do crescimento se deu também mais rapidamente.
Também para fermentação submersa o que ocorre neste tipo de fermentação é uma
produção muito rápida e intensa de biomassa nos primeiros instantes de fermentação, quando
há uma grande quantidade de inóculo em relação ao substrato existente. Depois há uma
estabilização do sistema, após terminar a alimentação de substrato. Se o objetivo dessa
fermentação fosse a produção de biomassa ou metabólito associado ao crescimento, quatro
dias seria o tempo ideal de fermentação. Esse recurso, em escala industrial seria muito útil,
minimizando em 50 % o tempo de fermentação em batelada, diminuindo sensivelmente os
custos de produção.
horas de fermentação, uma vez que o GA3 é produzido em maior quantidade no momento de
diminuição da fonte de nitrogênio.
Provavelmente, com um tempo maior de fermentação houvesse um aumento da
produção do metabólito, como o observado por BANDELIER, RENAUD & DURAND
(1997). Estes autores obtiveram uma produção de aproximadamente 3 g GA3 . (kg MS)-1, em
um sistema batelada alimentado, após 10 dias de cultivo. Esta produção alta deu-se a partir de
144 h de fermentação
0,70
0,60
0,50
P (g/kg MS)
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
0 24 48 72 96 120 144
tempo (h)
taxa de crescimento específico global foi baixa, provavelmente pelo o crescimento ter sido
prejudicado com o aquecimento do meio de cultivo pela energia não dissipada.
3,0
2,5
2,0
ln X estimada
1,5
1,0
0,5
0,0
0 24 48 72 96 120 144
tempo (h)
0,35
0,3
0,25
P (g/kgsubst)
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0 24 48 72 96 120 144
Tempo (h)
80
0,4 0,2
colunas reator condições colunas 0,18
0,35
0,16
0,3
g CO2 /g MS (colunas)
g CO2 /g MS (reator)
0,14
0,25 0,12
0,2 0,1
0,15 0,08
0,06
0,1
0,04
0,05
0,02
0 0
0 24 48 72 96 120 144
tempo (h)
81
0,18
0,16 reator condições colunas
reator batelada-alimentada
0,14
reator baixa aeração
0,12
g CO2/g MS
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0 24 48 72 96 120 144
tempo (h)
20
18
16
14
12
mg X/g MS
10
8
6 colunas
reator condições colunas
4
reator batelada-alimentada
2
reator baixa aeração
0
0 24 48 72 96 120 144
tempo (h)
1,2
colunas
1,0 reator condições colunas
reator batelada-alimentada
reator baixa aeração
0,8
g GA3/kg MS
0,6
0,4
0,2
0,0
0 24 48 72 96 120 144
tempo (h)
Em colunas este decaimento foi detectado após 144 horas de fermentação. No reator
com baixa aeração a produção foi baixa, e já com 96 horas de fermentação houve decréscimo
na concentração de GA3.
83
24
T E S T E MUNH A COME R CIAL F E R ME NT ADO 22,65
23
22,01
22
18 17,45
17,05
17
16
15
4 8
tem po (dias)
Quanto ao peso seco da raiz e parte aérea das mudas, como demonstrado na tabela 17
e figura 40 a seguir, não houve diferença significativa entre os tratamentos (inclusive a
testemunha). De fato a raiz mostrou um peso maior para a testemunha nos dois tempos. Este
resultado é esperado uma vez que o ácido giberélico tem efeito no crescimento apical da
planta e não no acúmulo ganho de peso da mesma. Inclusive, produtos inibidores da síntese de
giberelinas como o PachlobutrazolMR são utilizados justamente para que a muda ganhe mais
peso facilitando assim seu transplante e adaptação ao campo.
T E S T E M . R AÍZ C OM . R A Í Z F E R M . R A ÍZ
5 T E S T E M . A ÉR E A C OM . A É R E A F E R M . A ÉR E A
4 ,5
4
3 ,5
peso seco (g)
3
2 ,5
2
1 ,5
1
0 ,5
0
4 8
D ia
85
CONCLUSÃO
Neste trabalho foram estudadas as condições da produção de ácido giberélico em
diferentes sistemas fermentativos, utilizando-se o fungo Gibberella fujikuroi, num processo
de fermentação no estado sólido da mistura casca de café – bagaço de mandioca e teste da
eficiência biológica do metabólito obtido.
Com relação às otimizações feitas para determinação das condições adequadas para
produção de GA3 em colunas de aeração forçada, houve uma influência significativa da
umidade, com os melhores resultados obtidos entre 76 e 78%. Uma aeração alta (maior que
0,18 l ar.(h.g MS)-1) nos primeiros dias de fermentação exerce um efeito negativo no
crescimento do microrganismo, porém após 72 horas de fermentação faz-se necessária uma
aeração maior – entre 0,5 e 1, l ar.(h.g MS)-1.
A maior produção obtida em reator escala piloto foi de 1,19 g GA3.(kg MS)-1 após 120
h de fermentação, uma produção 28% maior que a obtida em colunas com 144 h. Condições:
umidade e pH iniciais do meio de cultivo 77% e 5,1, respectivamente, temperatura entre 28,5
e 30 ºC e aeração de 0,12 l ar.(h.g MS)-1nas primeiras 72 h, e após esse período, de 0,48 l
ar.(h.g MS)-1.
A fermentação com aeração baixa e constante no reator escala piloto foi inadequada
para a produção do metabólito, pelo alto calor produzido, que impediu o crescimento
adequado do microrganismo e degradou o ácido giberélico após 96 horas de fermentação,
quando havia atingido uma concentração de 0,323 g GA3.kg substrato-1.
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