DETERMINACIÓN DE VITAMINA B2 (RIBOFLAVINA) EN COMPLEJO B POR

ESPECTROFOTOMETRIA DE FLUORESCENCIA MOLECULAR

Marcillo, S. (1437547-2131), Peña, B. (1527430-2131), Trochez, J. (1526022-2131)

stefania.marcillo@correounivalle.edu.co; bryan.pena@correounivalle.edu.co;
julieth.trochez@correounivalle.edu.co
Universidad del Valle
Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Departamento de Química
Laboratorio de Análisis Instrumental
Docente: Harold Díaz Segura
Fecha de la práctica: Mayo 06 de 2017
Fecha de entrega: Mayo 22 de 2017

Resumen: Se determinó el contenido de riboflavina en complejo B mediante la técnica de espectrometría de fluorescencia

molecular. Se realizó una curva de calibración y para ello se preparó una solución patrón de riboflavina, tomando una alícuota de
20 ± 0.03 mL y diluyendo a 50 ± 0.06 mL a partir de una solución que contiene 7.3 ± 0.1 mg de patrón de riboflavina en 50 ± 0.06
mL. Cada solución fue enrasada con HCl 0.1 M. A partir de la solución patrón se prepararon soluciones estándares, tomando
alícuotas de 0.50, 1.0, 1.50, 2.0, 2.50, 4.0 y 4.5 mL y enrasando con HCl nuevamente. Para la preparación de la muestra se tomó
0.03 ± 0.00006 mL de complejo B y se diluyó en 50 ± 0.1 mL. De esta solución se tomó una alícuota de 5± 0.015 mL y se preparó
una solución de 10±0.01 mL para que la muestra entrará en la curva. En la medición de la fluorescencia se utilizó el estándar de
2.336±0.03 ppm para encontrar la longitud de onda de excitación y emisión, obteniendo 372.0±1.0 y 523.0±1.0 nm. El contenido
de riboflavina en el complejo B fue de (8.00 ± 0.50) ∗ 103 𝑚𝑔/𝐿 𝑅𝑖𝑏𝑜𝑓𝑙𝑎𝑣𝑖𝑛𝑎.

Palabras clave: Alícuota, curva de calibración, complejo B, riboflavina

1. DATOS, CÁLCULOS Y RESULTADOS 372.0±1.0 nm y la 𝜆 de emisión de 523±1.0 nm para la

riboflavina. El espectro se muestra a continuación:
Para la determinación de riboflavina por fluorescencia fue
necesario realizar una curva de calibración por patrón externo.
Primeramente, se preparó 500±0.25 mL de HCl 0.1 M a partir
de HCl al 37%. El cálculo fue el siguiente:
0.1 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝐻𝐶𝑙 36.46 𝑔 𝐻𝐶𝑙 100 𝑔 𝐻𝐶𝑙
500 𝑚𝐿 𝑠𝑙𝑛 × × × ×
1000 𝑚𝐿 𝑠𝑙𝑛 𝐻𝐶𝑙 1 𝑚𝑜𝑙 𝐻𝐶𝑙 37 𝑔 𝐻𝐶𝑙
1 𝑚𝐿
1.19 𝑔 𝐻𝐶𝑙
= 4.14 𝑚𝐿 𝐻𝐶𝑙

Con una pipeta graduada se tomaron 4.1±0.030 mL de HCl

concentrado.

Se pesó 7.3±0.1 mg del patrón de riboflavina y se disolvió en

un matraz ámbar de 50 ±0.06 mL con el HCl que se preparó.
De esta solución se tomó una alícuota de 20±0.03 mL y se llevó
a un matraz ámbar de 50± 0.06 mL con una concentración de
58.4 ppm. De ésta solución se tomó alícuotas para preparar
soluciones estándar (en matraces de 50±0.06 mL) con
concentraciones entre 1 y 5 ppm. Para la medición se utilizó el
estándar 4, se encontró la 𝜆 de excitación con un valor de
Figura 1. Espectro de la riboflavina
A partir de la selección de las longitudes de onda de excitación
y emisión se realizó la medición de cada estándar de la curva
de calibración, iniciando con el blanco el cual fue el solvente
(HCl).

1
Los datos para la realización y resultados de la curva se
encuentran a continuación: Reemplazando los valores en la ecuación 2 se tiene que:

Tabla 1. Datos para realización la curva de calibración. 𝑆𝑉̅ = 0.03 𝑚𝐿

Alícuota Concentración Intensidad En el caso de las concentraciones, estas se tuvieron que

tomada (mL) (ppm) ±0.0001 calcular a partir de la alícuota tomada, la incertidumbre se debe
hallar con la propagación del error aleatorio teniendo en cuenta
0.5±0.005 0.584±0.01 293.5856 el cálculo de las concentraciones. Este cálculo es generalizado
1±0.008 1.168±0.02 545.7587 ya que solo varia un factor, el cual es la alícuota tomada para
1.5±0.009 1.752± 0.03 814.5963 los estándares de la curva, entonces se tiene que:
2±0.01 2.336±0.03 1077.1963
7.3 𝑚𝑔 𝑟𝑖𝑏𝑜 20 𝑚𝐿 0.5 𝑚𝐿 1000 𝑚𝐿
2.5± 0.01 2.92±0.04 1337.5468 × × ×
50 𝑚𝐿 𝑠𝑙𝑛 𝑟𝑖𝑏𝑜 50 𝑚𝐿 50 𝑚𝐿 1𝐿
4±0.015 4.672±0.07 1947.0775 = 0.584 𝑝𝑝𝑚
4.5±0.02 5.256±0.08 2136.4864
Expresado en variables de manera general:
Algunas de las alícuotas que se han mencionado anteriormente
no fueron tomadas con una sola pipeta, sino por 2 para obtener 𝑚𝑅 × 𝐴1 × 𝐴2
[𝑠𝑙𝑛 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟] =
el volumen que se requería, por tanto, se debe de realizar la 𝑀1 × 𝑀2 × 𝑀3
propagación del error aleatorio. Tal es el caso para la alícuota Donde:
de 20 mL tomada para preparar la solución patrón de riboflavina
y algunas de la tabla 1. De manera general se muestra el cálculo 𝑚𝑅 : Riboflavina pesada
para la alícuota de 20 mL y de esa misma forma se calcula para 𝐴1 :Primera alícuota tomada
las alícuotas 1.5, 2,5 y 4,5 mL las cuales ya están en la tabla. 𝐴2 :Segunda alícuota tomada
Se define la ecuación a utilizar y sus variables: 𝑀1 , 𝑀2 , 𝑀3 :Soluciones de 50 mL

𝑉𝑡1 + 𝑉𝑡2 Como se dijo anteriormente solo un factor variara en la

𝑉̅𝐴 =
2 ecuación, y es 𝐴2 . Los demás resultados se encuentran en la
Ec. 1 tabla 1. Entonces para hallar las incertidumbres se realiza la
propagación del error aleatorio el cual corresponde a la
Para la solución estándar 1 se tiene que: multiplicación o división:
𝑋𝑌
𝑉̅ : Volumen promedio 𝑅=
𝑍
𝑉𝑡1 : Primer volumen tomado Ec.3
2 2 2 2
𝑉𝑡2 : Segundo volumen tomado 𝑆𝑅 𝑆𝑥 𝑆𝑦 𝑆𝑧
( ) =( ) +( ) +( )
𝑅 𝑥 𝑦 𝑧
Al ser el cociente una constante se utiliza la propagación del Ec.4
error aleatorio para sumas y restas logrando así la siguiente
ecuación. Se tiene que:

(𝑆𝑉̅ )2 = (𝑆𝑉𝑡1 )2 + (𝑆𝑉𝑡2 )2 𝑆[𝑠𝑙𝑛 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟] 2 𝑆𝑚 2 𝑆𝐴 2 𝑆𝐴 2

([𝑠𝑙𝑛 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟]) = ( 𝑚 𝑅 ) + ( 𝐴 1 ) + ( 𝐴 2 ) +
Ec. 2 𝑅 1 2
𝑆𝑀1 2 𝑆𝑀2 2 𝑆𝑀3 2
(𝑀 ) +(𝑀 ) +(𝑀 )
Las anteriores variables corresponden a las incertidumbres de 1 2 3

la ecuación 1.
Las incertidumbres de las variables son las siguientes:
Los valores para las variables son:
𝑆𝑚𝑅 = 0.1 𝑚𝑔
𝑉̅ = 10 𝑚𝐿 𝑆𝐴1 = 0.03 𝑚𝐿
𝑉𝑡1 = 10 𝑚𝐿 𝑆𝐴2 = 0.005 𝑚𝐿
𝑉𝑡2 = 10 𝑚𝐿 𝑆𝑀1 = 0.06 𝑚𝐿
𝑆𝑉𝑝1 = 0.02 𝑚𝐿 𝑆𝑀2 = 0.06 𝑚𝐿
𝑆𝑉𝑝2 = 0.02 𝑚𝐿 𝑆𝑀3 = 0.06 𝑚𝐿

2
Reemplazando se tiene que: Los valores son:

𝑆[𝑠𝑙𝑛 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟] = 0.01 𝑚𝐿 𝑆𝑥𝑥 = 18.3195794

𝑆𝑦𝑦 = 2858517.44
Según la tabla 1, se realizó la curva de calibración graficando 𝑆𝑅 = 51.12934471
intensidad vs concentración, se muestra a continuación:
Se calcula el error del intercepto y la pendiente
2.500,0000
y = 394,11x + 112,44 1 𝑥̅ 2
2.000,0000 R² = 0,9954 𝑆𝑏 = 𝑆𝑅 √ +
𝑛 𝑠𝑥𝑥
1.500,0000 Ec. 9
Intensidad

1.000,0000 Reemplazando se tiene que:

500,0000
𝑆𝑏 = 37.2899072

0,0000
Intervalo de confianza
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
𝑏 ± 𝑡𝑆𝑏
Concentración (ppm) Ec. 10
Gráfica 1. Curva de calibración.
𝑡 con n-2 grados de libertad al 95%: 2.57
La ecuación para la curva anterior fue de:
112.44 ± 95.8350
𝑦 = 394.11𝑥 + 112.44 𝑆𝑅
Ec. 5 𝑆𝑚 =
√𝑆𝑥𝑥
Ec. 11
Donde:
𝑚 = 394.11 Reemplazando se tiene
𝑏 = 112.44
𝑆𝑚 = 11.9457240
Se calcula 𝑆𝑥𝑥 , 𝑆𝑦𝑦 , 𝑆𝑅 con sus respectivas ecuaciones:
Intervalo de confianza
𝑆𝑥𝑥 = ∑(𝑥𝑖 − 𝑥̅ )2
𝑚 ± 𝑡𝑆𝑚
Ec. 6
Ec. 12
𝑆𝑦𝑦 = ∑(𝑦𝑖 − 𝑦̅)2
Ec. 7
𝑡 con n-2 grados de libertad al 95%: 2.57
𝑥̅ : La media de todos los valores de x
𝑦̅: La media de todos los valores de y 394.11 ± 30.7005

𝑥̅ = 2.669714286 𝑝𝑝𝑚 Se determinó el límite de detección y de cuantificación con la

𝑦̅ = 1164.6068 ecuación 13 y 14.

(𝑦𝐵 + 3𝑆𝑏 ) − 𝑏
𝑆𝑦𝑦 −𝑚2 𝑆𝑥𝑥 𝐿𝐷 =
𝑚
𝑆𝑅 = √ Ec. 13
𝑛−2
Ec. 8
Donde yB es la señal del blanco, Sb es la incertidumbre del
intercepto y b el intercepto
𝑛=7

3
 (4.6296 + 3 ∗ 37.2899072) − (112.44) Despejando x se obtiene:
𝐿𝐷 =
394.11
= 0.010300 𝑝𝑝𝑚 𝑦 − 112.44
𝑥=
394.11
(𝑦𝐵 + 10𝑆𝑏 ) − 𝑏 Ec.15
𝐿𝐶 =
𝑚 Al reemplazar la señal obtenida en la ecuación 1, se tiene que:
Ec. 14
𝑥 = 2.384490
(4.6296 + 10 ∗ 37.2899072) − (112.44)
𝐿𝐶 =
394.11 Posteriormente, se procede a hallar la incertidumbre de la
= 0.67263 𝑝𝑝𝑚 concentración obtenida anteriormente, dónde su principal
fuente de error se encuentra atribuida a la curva y a las
Resultados de la muestra desviaciones presentadas en esta, más no a su preparación.

Con el fin de garantizar que la lectura de la muestra se

𝑆𝑅 1 1 𝑦𝑜 − 𝑦̅ 2 1
encontrara dentro de la curva, fue necesario preparar una 𝑆𝑥𝑀 = ×√ + +( ) ×
solución de lectura cuya concentración fue de 3 mg/L de 𝑚 𝐷 𝑛 𝑚 𝑆𝑥𝑥
riboflavina. Se analizó una solución de complejo B inyectable, Ec. 16
la cual contenía 5000 mg/L de riboflavina, a continuación, se Donde:
muestran los cálculos realizados para llegar a la concentración
de la solución de lectura. 𝑆𝑅 : Desviación estándar de la regresión
𝐷: Número de lecturas de la muestra
𝜇𝐿 𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑛𝑒𝑐𝑒𝑠𝑎𝑟𝑖𝑜𝑠 = 50 𝑚𝐿 𝑠𝑙𝑛 𝐿𝑒𝑐 ∗ 𝑛: Número de datos (estándares de la curva)
3 𝑚𝑔 𝑅𝑖𝑏 103 𝑚𝐿 𝑠𝑙𝑛 𝑝𝑎𝑡𝑟ó𝑛 100 𝜇𝐿 𝑦𝑜 : Señal de la muestra
103 𝑚𝐿 𝑠𝑙𝑛 𝐿𝑒𝑐
∗ 5000 𝑚𝑔 𝑟𝑖𝑏
∗ 0.1 𝑚𝐿
𝑦̅: Promedio de señales de los estándares
𝜇𝐿 𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑛𝑒𝑐𝑒𝑠𝑎𝑟𝑖𝑜𝑠 = 30 𝑆𝑥𝑥 : Suma de los cuadrados de las desviaciones de las
concentraciones de los estándares con respecto a la media de
Al ser el volumen anterior uno muy pequeño, fue necesario estos
utilizar una micro pipeta de 10-100 𝜇𝐿. 𝑚: Pendiente de la curva
La medición de la señal en fluorescencia, para la muestra de Entonces, los valores para cada variable son las siguientes:
lectura, evidenció un valor superior al último punto de la curva,
por lo cual se decidió preparar una nueva solución de lectura a
𝑆𝑅 = 51.12934
partir de la anterior, esta vez realizando una dilución
𝐷=1
correspondiente con el fin de obtener una concentración teórica
𝑛=7
de 1,5 mg/L.
𝑦𝑜 = 1052.1915
𝑦̅ = 1164.6068
A continuación, se muestran los cálculos.
1,5 𝑚𝑔 𝑟𝑖𝑏 𝑆𝑥𝑥 = 18.31958
𝑚𝐿 𝑠𝑙𝑛 𝐿𝑒𝑐𝑡 1 = 10 𝑚𝐿 𝑠𝑙𝑛 𝑙𝑒𝑐𝑡 2 ∗ 103 𝑚𝐿 𝑠𝑙𝑛 𝑙𝑒𝑐𝑡 2 ∗ 𝑆𝑦𝑦 = 2858517.44
103 𝑚𝐿 𝑠𝑙𝑛 𝑙𝑒𝑐𝑡 1
𝑚 = 394.11
3 𝑚𝑔 𝑟𝑖𝑏
𝑥̅ = 2.66971 𝑚𝑔/𝐿
𝑚𝐿 𝑠𝑙𝑛 𝐿𝑒𝑐𝑡 1 = 5 𝑚𝐿
Reemplazando cada valor se obtiene que:
Una vez realizados los cálculos, se tomaron 5 mL de la solución
de lectura 1 (3 mg/L) y se aforaron con agua destilada a 10 mL,
𝑆𝑥𝑀 = 0.138960
obteniendo así una concentración teórica de 1.5 mg/L de
riboflavina, esta solución se llevó al espectrofluorímetro,
agitando suavemente antes de realizar la lectura Y se leyó, Con el fin de obtener la concentración final de la muestra o el
inyectable, se realizan los siguientes factores de conversión
arrojando así una señal de 1052.1915 ± 0.0001, a continuación
como se muestran a continuación.
se halla la concentración de la solución de lectura utilizando la
ecuación proporcionada por la regresión lineal. 2.384490 𝑚𝑔 𝑟𝑖𝑏 10 𝑚𝐿 𝑠𝐿2 50 𝑚𝐿 𝑠𝐿1
Se sabe que: [𝐼𝑛𝑦𝑒𝑐𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒] = ∗ ∗ 0.03 𝑚𝐿 𝑖𝑛𝑦 ∗
103 𝑚𝐿 𝑠𝐿2 5 𝑚𝐿 𝑠𝐿1
𝑦 = 394.11𝑥 + 112.44 103 𝑚𝐿
1 𝐿 𝑖𝑛𝑦

4
[𝐼𝑛𝑦𝑒𝑐𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒] = 7948.3 𝑆[𝐼𝑛𝑦𝑒𝑐𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒]
= 0.0584308444
[𝐼𝑛𝑦𝑒𝑐𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒]

Se sabe que:
𝑆𝐴𝑐𝑡 = 464.426 𝑚𝑔/𝐿
SL2 y SL1: solución de lectura 2 y 1 respectivamente.
“Iny”: solución inyectable de riboflavina. Expresando el resultado final con la incertidumbre adecuada,
se tiene que:
A continuación, se halla el porcentaje de error asociado al
resultado, teniendo en cuenta que la concentración reportada [𝐼𝑛𝑦𝑒𝑐𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒] = (8.00 ± 0.50) ∗ 103 𝑚𝑔/
en el producto inyectable fue de 5000 mg/L. 𝐿 𝑅𝑖𝑏𝑜𝑓𝑙𝑎𝑣𝑖𝑛𝑎.

La fórmula para calcular el porcentaje de error es la siguiente: El intervalo de confianza se expresa como

|𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑑𝑜 − 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜| [𝐼𝑛𝑦𝑒𝑐𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒] ± 𝑡𝑆[𝐼𝑛𝑦𝑒𝑐𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒]

%𝐸 = × 100
𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜
Ec.17 𝑡 con n-2 grados de libertad (5) al 95%: 2.57

Al sustituir los valores en la ecuación 2, se obtiene que: 𝑚𝑔

% 𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 = 59.0
Con el fin de hallar la incertidumbre asociada a la concentración
experimental de la solución inyectable de riboflavina en mg/L,
es necesario plantear su resultado en términos de las variables
fundamentales.
𝑥𝑚 ∗ 𝑉𝑇−𝑆𝐿2 ∗ 𝑉𝑇−𝑆𝐿1
[𝐼𝑛𝑦𝑒𝑐𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒] =
𝐴𝑆𝐿1 ∗ 𝐴𝑖𝑛𝑦𝑒𝑐𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒
Dónde:
𝑥𝑚 = Concentración de la solución de lectura 2. (2.384490
mg/L)
𝑉𝑇−𝑆𝐿2 = Volumen total de la solución de lectura 2. (10 mL)
𝑉𝑇−𝑆𝐿1 = Volumen total de la solución de lectura 1. (50 mL)
𝐴𝑆𝐿1 = alícuota tomada de la solución de lectura 1. (5 mL)
𝐴𝑖𝑛𝑦𝑒𝑐𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒 = alícuota tomada de la solución inyectable. (0.03
mL)
[𝐼𝑛𝑦𝑒𝑐𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒] = (8.00 ± 1.00) ∗ 103 𝑅𝑖𝑏𝑜𝑓𝑙𝑎𝑣𝑖𝑛𝑎
𝐿
2. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
El fenómeno de la fluorescencia consiste en la propiedad de
algunas sustancias de absorber la radiación electromagnética
en una longitud de onda (espectro de excitación) y de emitirla
de inmediato en forma de fotones, en otra longitud de onda más
larga (espectro de emisión). El espectro de emisión constituye
una característica intrínseca de cada sustancia y la intensidad
de emisión es proporcional a la concentración de la sustancia.1
Dicho de otra manera, las moléculas absorben fotones con una
determinada energía, y liberan fotones con menor energía. Este
proceso es casi inmediato. La luz es recibida y vuelta a emitir
en millonésimas de segundo, por lo tanto, se puede decir que
la fluorescencia dura tanto como el estímulo, ya que cuando
este cesa, también cesa el fenómeno de fluorescencia.2
Excitación (absorción)

Se realiza la propagación del error aleatorio el cual corresponde 𝑆0 + ℎ𝑣𝑒𝑥 → 𝑆1

a la multiplicación o división aplicando la ecuación 3 y 4. Ec. 18
2
𝑆𝑖𝑛𝑦𝑒𝑐𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒
2 𝑆𝑥 2 𝑆 2 𝑆𝑉
̅ Fluorescencia (emisión):
([𝑖𝑛𝑦𝑒𝑐𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒] ) = ( 𝑥 𝑀 ) + ( 𝑉𝑉𝑡𝑆𝐿2 ) + ( 𝑇𝑆𝐿1
𝑇̅𝑀
) +
𝑀 𝑇𝑆𝐿2
𝑆𝐴𝑆𝐿1 2 𝑆𝐴𝑖𝑛𝑦𝑒𝑐𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒 2 𝑆1 → 𝑆0 + ℎ𝑣𝑒𝑚
(𝐴 ) +(𝐴 ) Ec. 19
𝑆𝐿1 𝑖𝑛𝑦𝑒𝑐𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒

Las incertidumbres asociadas a cada variable son las

siguientes.

𝑥𝑚 = 0.138960 mg/L
𝑉𝑇−𝑆𝐿2 = 0.01 mL
𝑉𝑇−𝑆𝐿1 = 0.1 mL
𝐴𝑆𝐿1 = 0.015 mL
𝐴𝑖𝑛𝑦𝑒𝑐𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒 = 0.00006 Ml

Reemplazando se tiene que Figura 2. Fenómeno de Fluorescencia.

5
Una de las características más atractivas de los métodos de
fluorescencia es su sensibilidad inherente, la cual es, con
frecuencia, de uno a tres órdenes de magnitud mejor que las de
la espectroscopía de absorción. No obstante, los métodos de
fluorescencia se aplican mucho menos que los métodos de
absorción debido al número relativamente limitado de sistemas
químicos que se pueden hacer fluorescer.3
La fluorescencia tiene lugar en sistemas gaseosos, líquidos y
sólidos, tanto sencillos como complejos. El tipo más sencillo de
fluorescencia es el que presentan los vapores atómicos
diluidos. Para diferenciar la fluorescencia de otros fenómenos
de fotoluminiscencia, se requiere una revisión del spin del
electrón y de los estados singulete.4
El principio de exclusión de Pauli establece que en un átomo no
puede haber dos electrones con los cuatro números cuánticos
iguales. Esta restricción requiere que no haya más de dos
electrones en un orbital y, además, los dos deben tener los
estados de spin opuesto. Cuando esto ocurre, se dice que los
spines están apareados. Debido al apareamiento de spines, la
mayoría de las moléculas no presentan un campo magnético
neto y se dice, por tanto, que son diamagnéticas, es decir, no
son atraídas ni repelidas por campos magnéticos permanentes.
Un estado electrónico molecular en el cual todos los espines de
los electrones están apareados se llama singulete y cuando la
molécula se expone a un campo magnético no se produce un
desdoblamiento de niveles de energía. Cuando uno de los
electrones de una molécula es excitado a un nivel de energía
superior, se forma un estado singulete o triplete. En el estado
singulete excitado, el spin del electrón promocionado continúa
apareado con el electrón del estado fundamental.4
En el caso de la fluorescencia, sucede un proceso de relajación
de un estado singulete excitado de baja energía (S1) hacia el
estado fundamental (S0) mediante la emisión de un fotón.5
La velocidad a la cual se absorbe un fotón de radiación es
enorme, el proceso requiere una velocidad del orden de 10-15
a 10-14 s. Por otro lado, la emisión fluorescente tiene lugar a
una velocidad significativamente más lenta. El tiempo de vida
del estado excitado se relaciona inversamente con la
absortividad molar del pico de absorción correspondiente al
proceso de excitación.4
La mayor o menor capacidad fluorescente de una sustancia se
puede medir con la siguiente fórmula:
# 𝑓𝑜𝑡𝑜𝑛𝑒𝑠 𝑒𝑚𝑖𝑡𝑖𝑑𝑜𝑠
Φ=
# 𝑓𝑜𝑡𝑜𝑛𝑒𝑠 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑖𝑑𝑜𝑠
Ec. 20 Rendimiento cuántico de fluorescencia.
6
Al resultado de esta relación se le llama rendimiento cuántico
(ϕ). El máximo rendimiento sería del 100% cuando todos los
fotones absorbidos son reemitidos. Sustancias con un cociente
de 0.1 (es decir que de 10 fotones que absorben solo uno es
reemitido) aún se consideran bastante fluorescentes.2
La fluorimetría es la técnica espectrofotométrica que se basa en
la absorción de radiación por parte del analito a medir en una
muestra y su posterior emisión. Su fundamento es la
fluorescencia molecular. Al ser la longitud de onda de la
radiación emitida diferente de la longitud de onda de absorción,
puede utilizarse esta tanto para identificar como para cuantificar
sustancias.6
La principal ventaja de las técnicas fluorimétricas es su
sensibilidad, que permiten detectar cantidades de sustancias
del orden de ng. Las causas de esta mayor sensibilidad de la
fluorimetría con respecto a la espectrofotometría de absorción
radican en que las medidas de fluorescencia utilizan como
blanco un compuesto no fluorescente, que da una señal cero o
muy próxima a cero en el detector. En cambio, en el caso de las
medidas de absorción, el blanco transmite la mayor parte de la
radiación incidente y provoca una gran respuesta en el detector.
Por lo tanto, en los métodos fluorimétricos es posible aumentar
significativamente la sensibilidad del detector, permitiendo
medir con precisión cantidades muy pequeñas de radiación.6
Las moléculas tienen diferentes estados llamados niveles de
energía. La espectrometría de fluorescencia se refiere
principalmente a estados vibracionales y electrónicos. En
general, las especies objeto de examen tendrán un estado
electrónico basal (un estado de baja energía) de interés, y un
estado electrónico excitado de mayor energía. Dentro de cada
uno de estos estados electrónicos hay diferentes estados
vibracionales.7
En la espectroscopía de fluorescencia, primero se excita la
muestra mediante la absorción de un fotón de luz, desde su
estado electrónico basal a uno de los distintos estados
vibracionales del estado electrónico excitado. Las colisiones
con otras moléculas causan que la molécula excitada pierda
energía vibracional hasta que alcanza el estado vibracional más
bajo del estado electrónico excitado. La molécula desciende
luego a uno de los distintos niveles de vibración del estado
electrónico basal, emitiendo un fotón en el proceso. Como las
moléculas pueden caer a cualquiera de los diferentes niveles de
vibración en el estado basal, los fotones emitidos tendrán
diferentes energías y, por lo tanto, frecuencias. Así pues,
mediante el análisis de las diferentes frecuencias de luz emitida
por espectrometría de fluorescencia, junto con sus intensidades
relativas, se puede determinar la estructura de los diferentes
niveles de vibración.7
En un experimento típico, se miden las diferentes frecuencias El FP-8500 puede medir muestras que tienen picos agudos con
de luz fluorescente emitida por una muestra, manteniendo la luz alta resolución de ancho de banda espectral de 1,0 nm.8
de excitación a una longitud de onda constante. A esto se le
llama espectro de emisión. Un espectro de excitación se mide • Alta sensibilidad S / N> 5.000, RMS
mediante el registro de una serie de espectros de emisión • Adquisición rápida de datos
utilizando luz de diferentes longitudes de onda.7 • Escaneado de alta velocidad hasta 60.000 nm / min
• Filtro de corte automático para difracción de orden superior
Los equipos para la medición de la fluorescencia se denominan • Rango de longitud de onda, 200 a 750 nm (a 850 nm, opción)
fluorímetros. En general, el patrón de construcción es el • Accesorio de validación como estándar
siguiente:
Utiliza lámpara de xenón (150 W); fuente de luz para validación
1. Lámpara de arco de Hg o Xe. utiliza lámpara de mercurio de baja presión incorporada;
2. Lente de cuarzo o de vidrio. sistema fotométrico-ratio con luz monocromática para
3. Rendija. supervisar la salida de intensidad de la lámpara de Xe;
4. Filtro primario (longitud de onda de excitación). Monocromador: rejilla cóncava holográfica de montaje Rowland
5. Cubeta para la muestra. modificado; Detector utilizado para Ex: fotodiodo de silicio, Em:
6. Filtro secundario (longitud de onda de emisión). PMT; Gama fotométrica: -10.000 a 10.000; Selección de
7. Fotomultiplicador. sensibilidad: Alto, Medio, Bajo, Muy bajo, Manual, Auto SCS;
8. Galvanómetro. Compartimiento de la muestra: soporte rectangular de 10 mm,
purgable con nitrógeno.8
En línea recta con la lámpara, el filtro primario y la cubeta, se
sitúa una superficie de absorción de luz; el detector y el filtro
secundario están en una línea que forma un ángulo con la
anterior.1

Figura 4.

La vitamina B2 conocida también como riboflavina, pertenece al

grupo de pigmentos amarillos fluorescentes llamados flavinas,
descubierto a principios de 1879 y caracterizado a finales de
1932.

La vitamina B2 es una vitamina hidrosoluble, amarillenta,

Figura 3. Estructura básica de un equipo de fluorescencia. constituida principalmente por un anillo de isoaloxazina, el cual
posee dos grupos metilo y se une al ribitol, llamado así por ser
El equipo utilizado para el análisis de riboflavina fue el un alcohol derivado de la ribosa. Dichas uniones conforman la
espectrofluorímetro marca Jasco, referencia FP-8500. El FP- isoaloxazina, a continuación se muestra la molécula en
cuestión.
8500 es un equipo de rendimiento más alto que cubre el rango
de longitud de onda de 200 nm a 850 nm máximo. La
sensibilidad que es la más importante para la medida de la
fluorescencia es la relación señal/ruido de 5000:1 RMS y la
velocidad de exploración más rápida es de 60.000 nm / min. Los
espectros de alta calidad basados en alta resolución con ancho
de banda espectral de 1 nm, el filtro de corte automático para
difracción de orden superior y corrección espectral precisa
aseguran nuevas aplicaciones como la evaluación de
materiales avanzados La adquisición de datos de alta velocidad
permite la cómoda medida de espectros 3D y medición de
fosforescencia.
Figura 5. Molécula de riboflavina.
7
La riboflavina es caracterizada por ser fotosensible,
presentando así una descomposición de hasta el 50 % de la
cantidad de vitamina disponible, de encontrarse esta bajo
exposición solar durante aproximadamente 2 horas.
Es importante mencionar que la estabilidad de la riboflavina
aumenta significativamente en medio ácido, tanto su resistencia
al calor como la foto sensibilidad, razón por la cual fue necesario
preparar la solución madre de riboflavina en HCl 0.1 M. Ésta
vitamina en medio neutro es medianamente inestable y en
medio alcalino tiende a ser muy inestable, tanto que inclusive a
temperatura ambiente es capaz de hidrolizarse formando un
ácido oxocarbónico y urea.
El análisis por fluorescencia en la riboflavina es posible gracias
a que tiene una buena rigidez estructural. En este caso la
estructura molecular juega un papel importante, puesto que
esta determina en gran medida probabilidad de absorción. El
cruce intersistema, que supone un cambio de multiplicidad,
depende en gran medida de la interacción espín-órbita, la cual
está favorecida por la presencia de átomos pesados. El proceso
de conversión interna, transición no radiactiva entre estados
electrónicos de la misma multiplicidad, es inducido por los
términos de acoplamiento electrónico despreciados en la
aproximación de Born-Oppenheimer. Este proceso va seguido
de la relajación vibracional hasta el nivel vibracional más bajo
del estado electrónico.9 En la práctica se observó un % de error
bastante elevado, lo cual podría atribuirse principalmente a
errores sistemáticos, esto último debido a que fue necesario
tomar un volumen muy pequeño con el fin de preparar la
solución de lectura 1 (30 uL) y ya que el analista no conoce los
certificados de calibración de las micropipetas utilizadas, es
posible que hubiese una diferencia entre el volumen elegido y
el volumen tomado realmente, lo cual generaría un sesgo
positivo o negativo, según sea el caso. Haciendo a parte la
calibración de las micropipetas, es probable que el mecanismo
utilizado para tomar el volumen en la micropipeta se haya
presionado más de lo debido, esto haría que la micropipeta
tomase un volumen mayor al volumen estipulado en la misma,
lo que generaría un sesgo positivo en dicha solución y que
posteriormente se propagaría a la solución de lectura 2.
Una agitación inadecuada, es decir muy fuerte, puede producir
la desactivación de la molécula, generando una transferencia
de energía cinética entre ellas, y posiblemente su posterior
hidrolización, lo anterior evitaría la cuantificación puesto que no
sería posible producir la fluorescencia esperada, sin embargo
esto habría causado un sesgo negativo en el resultado y ya que
el sesgo obtenido fue bastante positivo, se asume que el error
principal proviene de la toma de la alícuota de la solución de
lectura 1, con la micro pipeta.
8
3. SOLUCIÓN AL CUESTIONARIO
a) Por qué la radiación se mide a 90° con respecto a la
radicación de la excitación?
Rta/ La fluorescencia se propaga desde la muestra en todas las
direcciones, pero lo más conveniente es observar la que forma
un ángulo recto con el haz de excitación. La geometría de
ángulo recto reduce al mínimo las contribuciones de la
dispersión y de la radiación intensa de la fuente.10
b) Explique claramente la diferencia instrumental entre un
fluorímetro y un espectrofluorímetro. Indique las ventajas y
desventajas de cada uno.
Rta/ Hay diferentes tipos de instrumentos de fluorescencia. Si
los dos selectores de longitud de onda son filtros, el instrumento
se llama fluorímetro. Si ambos selectores son
monocromadores, el instrumento se llama espectrofluorímetro.
Algunos instrumentos son híbridos y utilizan un filtro de
excitación junto con un monocromador de emisión. Los
instrumentos para fluorescencia pueden incorporar un diseño
de doble haz para compensar los cambios en la energía de la
fuente de radiación con el tiempo y la longitud de onda. Los
instrumentos que corrigen para la distribución espectral de la
fuente se denominan espectrofluorímetros corregidos. Las
fuentes de radiación para fluorescencia suelen ser más
poderosas que las fuentes para absorción típicas. En
fluorescencia, la energía de radiación emitida es directamente
proporcional a la intensidad de la fuente, pero la absorbancia es
esencialmente independiente de la intensidad de la fuente
debido a que está vinculada con la relación de energías
radiantes.11
A continuación, se muestra el diagrama de bloque general que
siguen todos los instrumentos de fluorescencia.
Figura 6. Diagrama básico de instrumentos de fluorescencia.
Ahora, se muestra un fluorímetro de filtro. Se puede notar que
la emisión se mide en ángulos rectos con respecto a la fuente,
que es una lámpara de arco de mercurio.
La radiación de fluorescencia se emite en todas direcciones, y
la geometría de 90 grados evita que el detector vea la fuente.11
Figura 7. Estructura de un fluorímetro de filtro.
Por último, se muestra un espectrofluorímetro, el cual usa dos
monocromadores de rejilla y también detecta la emisión en
ángulos rectos. Los dos monocromadores permiten el escaneo
de un espectro de excitación (longitud de onda de excitación
escaneada a una longitud de onda de emisión fija), espectros
de emisión (longitud de onda de emisión escaneada a una
longitud de onda de excitación fija) o espectros sincrónicos (se
escanean ambas longitudes de onda con un ajuste de
longitudes de onda fijo entre los dos monocromadores).11
Figura 8. Estructura de un espectrofluorímetro con dos
monocromadores.
c) ¿Cuál es la diferencia entra la fluorescencia y la
fosforescencia? ¿Existe alguna diferencia en la
instrumentación? ¿Es posible obtener medidas de
fosforescencia en un fluorímetro? ¿Bajo qué condiciones?
Rta/ Los términos fluorescencia y fosforescencia provienen de
las propiedades físicas que traen consigo el flúor y el fósforo ya
que, aunque otros elementos también tengan esta cualidad,
estos dos fueron los primeros.12
9
La fluorita es el mineral que tiene la característica de poseer
sustancias que emiten luz por consecuencia de la excitación en
sus radiaciones. Entonces, cuando se utiliza “fluorescente” o
“fosforescente”, se quiere decir que tiene la cualidad irradiar luz
sin ningún objeto que le haga fuerza, simplemente lo hace de
manera natural.12
Tanto la fluorescencia como la fosforescencia son fenómenos
de emisión de luz.13 Al referirse a las diferencias entre ambos
términos, se pueden citar varias. Algunas de las principales son
las explicadas a continuación.
La fluorescencia es la propiedad que tienen algunas sustancias
de absorber energía y luego emitir parte de esa energía en
forma de luz. La energía emitida en forma de luz es siempre
menor a la absorbida y la diferencia entre ambas es disipada en
forma de calor. En el mecanismo de fluorescencia típico, una
molécula absorbe un fotón de alta energía, sufre una excitación
electrónica y algunos de sus electrones son promovidos a
orbitales moleculares de mayor energía, luego estos electrones
excitados decaen nuevamente a orbitales de menor energía
emitiendo luz de onda más larga en el proceso. La diferencia de
energía entre los fotones absorbidos y los emitidos se disipa en
forma calor por medio de diferentes mecanismos de conversión
interna. Todo el proceso es muy breve, transcurre en tiempos
del orden de la millonésima de segundo, por lo que puede
considerarse prácticamente instantáneo. Es este tiempo tan
corto lo que diferencia a la fluorescencia de otro conocido
fenómeno luminoso, la fosforescencia. El mecanismo de
fluorescencia también se encuentra muy relacionado con el
proceso de quimioluminiscencia.13
La fosforescencia es el proceso en el cual ciertas sustancias
tienen la propiedad de absorber energía y almacenarla, para
emitirla posteriormente en forma de radiación. El mecanismo
físico que rige este comportamiento es el mismo que para la
fluorescencia; no obstante, la principal diferencia con esta es
que hay un retraso temporal entre la absorción y la reemisión
de los fotones de energía. En la fosforescencia, las sustancias
continúan emitiendo luz durante un tiempo mucho más
prolongado, aún después del corte del estímulo que la provoca,
ya que la energía absorbida se libera lenta (incluso muchas
horas después) y continuamente.2 La fosforescencia es el
fenómeno en el cual el fotón es absorbido, excitando un electrón
hacia un nivel de energía mayor y luego, al volver el electrón al
nivel de energía que le corresponde, libera el fotón. En este
caso, la energía aportada por el fotón trasladaría al electrón a
un estado de excitación de energía metaestable, en el cual
permanece por un cierto tiempo, ya que no puede regresar
inmediatamente a su estado de reposo. Cuando una
determinada cantidad de tiempo pasa, el electrón vuelve a su
estado original, emitiendo luz en el proceso.14
Además de los mecanismos de ambos fenómenos, también se
puede hablar de la diferencia entre fluorescencia y
fosforescencia desde el spin electrónico y el estado de
excitación.
La mayoría de las moléculas poseen un número par de
electrones y así los que se encuentren en cada orbital estarán
apareados. (estado basal, spines apareados. Momento
magnético nulo). Al excitarlos, uno de los electrones pasará a
un orbital de mayor energía.5
Un estado electrónico molecular en el cual todos los espines de
los electrones están apareados se llama singulete y cuando la
molécula se expone a un campo magnético no se produce un
desdoblamiento de niveles de energía.4
Cuando uno de los electrones de una molécula es excitado a
un nivel de energía superior, se forma un estado singulete o
triplete. En el estado singulete excitado, el spin del electrón
promocionado continúa apareado con el electrón del estado
fundamental; sin embargo, en el estado triplete los spin de los
dos electrones se han desapareado y, por tanto, están
paralelos.4
Figura 9. Configuración singulete y triplete en estado excitado.
En el caso de la fluorescencia, sucede un proceso de relajación
de un estado singulete excitado de baja energía (S1) hacia el
estado fundamental (S0) mediante la emisión de un fotón. Para
la fosforescencia, ocurre una relajación de un estado triplete
hacia el estado fundamental mediante la emisión de un fotón.
Este es un proceso más lento ya que, al estar los dos electrones
con el mismo spin, es una transición cuánticamente prohibida.5
Figura 10. Excitación y emisión de la fluorescencia y
fosforescencia.
10
El esquema de un espectrofluorímetro es el siguiente:
1. La luz procedente de una fuente de excitación pasa a través
de un filtro o un monocromador y golpea la muestra.
2. Una porción de la luz incidente es absorbida por la muestra
fluorescente.
3. La luz fluorescente es emitida en todas las direcciones.
4. Algunas de estas luces fluorescentes pasan a través de un
segundo filtro o monocromador y alcanzan un detector, el
cual es usualmente colocado a noventa grados de la
incidencia del haz de luz.14
Los instrumentos que se utilizan para estudios de
fosforescencia tienen diseños similares a los fluorómetros y a
los espectrofluorímetros. Únicamente difieren en que requieren
componentes adicionales. Uno de ellos, es un dispositivo que
irradia alternativamente la muestra y, después de un retraso en
el tiempo adecuado, mide la intensidad de fosforescencia. El
retraso en el tiempo es necesario para diferenciar la emisión
fosforescente de larga vida de la emisión fluorescente de corta
vida que podrían originarse en la misma muestra.14
Se utilizan dispositivos mecánicos y electrónicos y muchos
instrumentos de fluorescencia comerciales tienen accesorios
para medidas de fosforescencia.14
Figura 11. Tipo de dispositivo mecánico en un instrumento de
fosforescencia.
d) Dibuje la estructura de la riboflavina y explique por qué es
una molécula altamente fluorescente.
Rta/ La riboflavina (B2) es una vitamina hidrosoluble del
complejo B, cuyo aporte nutricional es imprescindible para el
buen funcionamiento del organismo. La leche es una de las
principales fuentes de riboflavina en la dieta humana, sin
embargo, en la mayoría de los alimentos se degrada durante
los procesos térmicos convencionales y en el
almacenamiento.15
En 1879 se identificó la importancia biológica de un pigmento
fluorescente verde-amarillento en la leche. En 1933 aislaron por
primera vez la riboflavina a partir de la leche y en 1935, se
sintetizó por primera vez.16
La sustancia matriz de los compuestos de la familia de la
riboflavina es la 7,8-dimetil-10(1 '-ribitil) isoaloxacina y a todos
los derivados se les aplica el nombre de flavinas.
Generalmente, se encuentra fosforilada integrando las
coenzimas flavin mononucleótido y flavin adenín dinucleótido;
las cuales funcionan como coenzimas de numerosas enzimas
flavina-dependientes que catalizan diversos procesos de
oxidación-reducción.15
Está formada por la combinación de una flavina con un
azúcar de 5 carbonos, que es la ribosa. En estado puro tiene
aspecto de cristales amarillos.13 Su estructura está formada
básicamente por un grupo de tres anillos, dos de ellos
heterocíclicos, unido a una cadena lineal de ribosa.17
A continuación, se muestra su estructura.
Figura 12. Estructura de la riboflavina.
4. CONCLUSIONES
 No todas las moléculas fluorescen ni mucho menos
fosforescen, puesto que los procesos para que sucedan
estos fenómenos son complicados ya que deben competir
en el proceso de relajación. Es más factible que una
molécula absorba, por esto, los métodos fluorescentes no
se utilizan mucho como un método de absorción.
 A pesar de que la muestra no tuvo que pasar por procesos
de extracción, maceración, pesado y otros en donde pueden
presentar muchas incertidumbres y errores sistemáticos se
puede concluir que el alto porcentaje de error se pudo
presentar al tomar un volumen pequeño eleva la
incertidumbre puesto que al momento de tomar la cantidad
requerida con una micropipeta se debía hacer
cuidadosamente.
11
 Se aplicó los conocimientos adquiridos sobre la
fluorescencia molecular como su diferencia entre la
fosforescencia, sus fuentes, la causa de que las moléculas
pueden fluorescer, la mayor sensibilidad que en absorción.
 Como se mencionó anteriormente, la toma de volúmenes
muy pequeños puede conllevar a tener incertidumbre a muy
grandes en dicha medida, ya que al ser un RSD constante,
la disminución del valor principal, aumentara
significativamente dicho RSD. Lo anterior se evidenció en el
gran porcentaje de error que se observó en la determinación
de riboflavina en azúcar de muestra. En aras de mejorar
dicha cuestión, para futuros análisis es menester realizar los
cálculos necesarios para tomar un volumen significativo del
analito, aunque esto implique preparar una mayor cantidad
de solución de lectura. Ya que se minimizaran los errores
mencionados anteriormente Una molécula como lo es la
riboflavina que es muy sensible a los cambios bruscos y a
la luz, se debe de tener mucho cuidado, puesto que se
puede desactivar. Es por esto que en el momento de
agitarse, se debe tener mucha precaución y realizarlo muy
cuidadosamente (por los estados susceptibles las colisiones
inactiva la molécula), asegurándose que haya
homogeneidad pero no daño a la solución de la molécula
fluorescente.
 Los fenómenos fotoluminiscentes se caracterizan por sus
amplios intervalos de linealidad, que son a menudo
significativamente mayores que los de los métodos de
absorción, esto se ve reflejado en el coeficiente de
correlación.
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[11] Skoog, D.A.; West, D.M.; Holler, F.J.; Crouch S.R.

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