Trabajo Práctico Nº 2 y 3: Microscopía

❖ Materia:​ Microbiología General.

❖ Profesores:​ Hollmann Axel - Silvia Amor.
❖ Integrantes:
■ Romina Gomez.
■ Elizabeth Pla.
■ Clara Agnello.
■ Antonella Basili.
■ Pablo Iapichello.
❖ Año:​ 2017 - 2° cuatrimestre
❖ Universidad Nacional de Quilmes

clostridium botulinum tinción de gram

RESUMEN
En el siguiente informe se detallan las actividades que se realizaron en los laboratorios 2 y 3 de
microscopía.
En dichos laboratorios se trabajó sobre la correcta utilización del microscopio óptico de campo claro y
en la aplicación de diferentes técnicas de tinción de bacterias.
Gracias a la metodología de trabajo, se observaron y diferenciaron agrupaciones, tamaños,
morfologías y estructuras de varios microorganismos.

INTRODUCCIÓN
El microscopio es indispensable dentro de la Microbiología para el estudio de la morfología y
estructura de los microorganismos, así como su reacción a diferentes colorantes, lo cual junto con
otros criterios, permitirá su identificación, por lo tanto, es importante conocer su manejo adecuado..
El microscopio óptico se utiliza para aumentar el tamaño de la imagen aparente de los objetos, lo cual
permite observar los detalles estructurales de los microorganismos. El microscopio óptico normal que
se usa para observar bacterias y otros organismos celulares es un microscopio compuesto, provisto
de una fuente luminosa, una lente condensadora de luz que la dirige hacia el objeto a observar y dos
juegos de lentes que ayudan a la amplificación de la imagen. A través de la refracción o reflexión de
los rayos luminosos mediante el sistema de lentes del microscopio, se forma la imagen amplificada
del objeto, permitiendo el examen de sus estructuras en detalle.

AMPLIFICACIÓN​: La capacidad amplificadora de un microscopio compuesto es el producto del

aumento individual de los oculares y los lentes objetivos. Un microscopio típico que se usa en
bacteriología tiene objetivos con poder de resolución de 10X, 40X y 100X y oculares de 10X, por lo
cual es capaz de amplificar la imagen de la muestra 100, 400 y 1000 veces, respectivamente.
En un aumento de 1000X, las bacterias y microorganismos grandes se pueden visualizar muy bien,
pero no los virus y muchos de los detalles finos de las estructuras bacterianas.

PODER DE RESOLUCIÓN: ​La resolución se define como el espacio de máxima aproximación entre
dos puntos en el que aún se pueden observar claramente como dos entidades independientes, es
decir, es la distancia entre dos entidades en la cual todavía se pueden observar como estructuras
separadas en la imagen amplificada. El poder de resolución de un microscopio está sujeto a la
longitud de onda de la luz y a la propiedad de las lentes conocidas como la apertura numérica (AN).
El poder de resolución de los microscopios ópticos se encuentra restringido por la AN que se obtenga
de los sistemas de lentes y las longitudes de onda del espectro de luz visible.

APERTURA NUMÉRICA: Indica la cantidad de luz que entra en un objetivo desde un punto del
campo del microscopio. La AN de una lente depende del índice de refracción (N) del medio que llena
el espacio entre el objeto y la parte frontal del objetivo, y del ángulo (μ) de los rayos de luz más
oblicuos que puedan entrar al objetivo. La fórmula para calcular la AN es: AN = N x sen μ/2 El aire
tiene un índice de refracción de 1.0, que limita la resolución que se puede obtener, pero se puede

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incrementar la AN poniendo aceite de inmersión entre el espécimen y el objetivo, aumentando así el
poder de resolución del microscopio. El aceite de inmersión tiene un índice de refracción de 1.5, lo
que aumenta considerablemente la AN y esto mejora el poder de resolución del microscopio.

PARTES DEL MICROSCOPIO

⎼ Base.
⎼ Soporte.
⎼ Bisagra de inclinación.
⎼ Brazo.
⎼ Cuerpo del tubo.
⎼ Tubo intercambiable.
⎼ Revólver.
⎼ Tornillo macrométrico.
⎼ Tornillo micrométrico.
⎼ Platina y Pinzas de la platina.
⎼ Fuente de luz.
⎼ Condensador.
⎼ Diafragma.
⎼ Objetivo.
⎼ Oculares.

MÉTODOS DE MICROSCOPIA
Examen de organismos vivos:​ La forma más simple de examinar las bacterias y otros
microorganismos vivos es suspenderlos en agua u otro líquido, colocar una gota de esta suspensión
en un portaobjetos ordinario y encima un cubreobjetos. Existen otros métodos como son el de gota
pendiente y el micro cultivo.

Examen de bacterias teñidas:​ La forma y estructura de las bacterias se revelan con más claridad
cuando son desecadas sobre un portaobjetos y son coloreadas o examinadas contra un fondo teñido.
Existen diversas técnicas de tinción.

CLASIFICACION BACTERIANA
Las bacterias pueden clasificarse según su capacidad de retención de diferentes tinciones, por
ejemplo, de Gram o Ziehl-Neelsen; por su morfología (cocos, bacilos, espirilos), por su agrupamiento
(estafilos, estrepto, sarcinas, etc.), tamaño, forma de colonias, entre otros parámetros.

TINCIONES
Pueden clasificarse en simples, diferenciales y especiales. Todas excepto la tinción negativa deben
realizarse luego de la fijación de la muestra al portaobjetos.

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Un colorante es un compuesto químico que posee grupos cromóforos capaces de absorber y emitir
luz en el rango visible del espectro. La acción de un colorante está determinada según su afinidad
para con el sustrato a teñir dependiendo de las diferencias de las cargas eléctricas de ambos.

Tinciones simples:
El extendido bacteriano se colorea con un único reactivo para poder observar la morfología y
disposición de las células. Las formas bacterianas básicas son: Bacilos, cocos y espirilos y pueden
disponerse en forma individual o agrupados de a dos (diplo), de a cuatro (tétradas), en cadenas
(estreptos) o en racimos (stafilos). Un tipo de tinción simple es la negativa, donde se utiliza un
colorante ácido, que está cargado negativamente al igual que la superficie celular para que el fondo
queda coloreado y las células no.

Tinciones diferenciales
Es un método que divide a las bacterias en dos clases y requieren al menos de dos colorantes y un
decolorante para llevarse a cabo. Dentro de este grupo se encuentran entre otras, las tinciones de
Gram y las BAAR.
La tinción de Gram es un método de diferenciación de bacterias Gram positivas de Gram negativas;
en base a las diferencias estructurales en su pared.
En primer lugar se utiliza cristal violeta para colorear todas las células presentes en la muestra. Luego
se utiliza lugol para formar un complejo insoluble de cristal violeta dentro de las células que evita su
difusión al medio. Posteriormente se decolora con alcohol y así se obtiene una muestra con células
Gram positivas color violeta y Gram negativas decoloradas, esto se debe a la presencia de una
gruesa capa de peptidoglicanos en la pared de las Gram positivas que evita que el alcohol
desestabiliza la membrana y forman poros por donde pueda salir el colorante. La exposición a alcohol
debe ser breve para que este no deshidrate la gruesa capa de peptidoglicanos de las Gram positivas
y si en las Gram negativas (debido a que es mucho más delgada). Para esto se lava con agua
destilada luego de transcurridos quince segundos de la aplicación del decolorante. Por último, para
poder visualizar ambos tipos de células se hace uso de un segundo colorante color rosado: safranina.
Este tiñe todas las células, pero no tapa el violeta intenso de las Gram positivas, por lo cual se podrán
diferenciar.
Las tinciones para BAAR (Ziehl-Neelsen) constan de la aplicación de carbol fucsina y luego calor,
para que el colorante pueda ingresar dentro de las células de gruesa pared cerosa de micobacterias,
tiñendo todas las células de la muestra de color rosado. Luego se decolora con ácido alcohol, lo cual
desteñirá solo las células que no posean estas paredes. Finalmente para distinguir ambos tipos de
células se usa un contra colorante: azul de metileno, que no es capaz de colorear las BAAR ya que se
aplica en frío. Las BAAR quedarán color fucsia mientras que el resto de las bacterias contenidas en la
muestra serán de color azul.

Tinciones especiales
Son utilizadas para distinguir determinadas estructuras especiales subcelulares. Existen varios tipos
de tinciones especiales, entre otras se encuentran tinciones de esporas, de cápsula y de ácidos

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nucleicos. Hay dos técnicas de tinción de esporas, que permiten determinar la morfología y
localización de la espora. Estas pueden ser esféricas o elípticas con localización central, terminal o
subterminal con diámetros menores, iguales o mayores a la célula vegetativa original.
La tincion de Schaeffer-Fulton utiliza verde de malaquita con calor húmedo (vapor) para que tiña todas
las células y pueda penetrar la cubierta de las esporas y luego se decolora con agua para obtener las
esporas color verde y las células vegetativas decoloradas. Finalmente para poder distinguir estas
células vegetativas se colorearon con safranina quedando rosadas y verdes las esporas. La técnica
de Dorner emplea carbol fucsina con calor húmedo para colorear todas las células incluyendo las
esporas, luego se decolora con agua y se utiliza nigrosina como contracolorante, con lo cual se
obtendrán las esporas color rosado y las células vegetativas incoloras con un fondo negro. La tinción
de cápsula se realiza utilizando cristal violeta como colorante primario. Se enjuaga con sulfato de
cobre que es absorbido por la cápsula quedando de color verde sobre un fondo oscuro. La tinción de
ácidos nucleicos se realiza con naranja de acridina y se observa en un microscopio de fluorescencia
con luz UV. Este colorante, al intercalarse en el ADN, fluoresce de color naranja, y si se une a ARN,
por el cual tiene afinidad, lo hace de color verde.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se siguió el protocolo de los trabajos prácticos número 2 y 3 de Microbiología general de la

Universidad Nacional de Quilmes.

Materiales
● Anza.
● Portaobjetos.
● Mechero Bunsen.
● Recipiente para tinción.
● Papel de filtro.
● Lugol.
● Solución de alcohol - acetona.
● Agua destilada.
● Colorantes: ​cristal violeta, azul de metileno, tinta china, safranina y verde de malaquita.
● Cultivos: ​Bacillus cereus,​ ​Escherichia coli ​(cultivo sólido y líquido), ​Pseudomona aeruginosa​,
Enterococcus faecalis​, ​Staphylococcus aureus,​ ​Bacillus thuringiensis ​(cultivo líquido)​, ​y Bacillus
sphaericus ​(cultivo líquido).

Métodos

➔ Tinciones simples: ​Se prepararon extendidos de cada uno de los microorganismos, y,

excepto en el caso del extendido al que se le practicó tinción negativa, los mismos fueron

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 fijados al calor. Posteriormente se realizó la coloración de los mismos,y transcurrido el tiempo
indicado para cada colorante, se los lavó con agua destilada para retirar el exceso del mismo.
En el caso de la tinción negativa, se aplicó el colorante y se extendió utilizando un segundo
portaobjetos. Las tinciones se realizaron de la siguiente manera:
● Staphylococcus aureus ​y ​Escherichia coli:​ Azul de metileno.
● Pseudomona aeruginosa,​ ​Enterococcus faecalis ​y ​Bacillus cereus:​ Cristal violeta.
● Bacillus cereus j​ unto con ​Staphylococcus aureus:​ tinción negativa con tinta china.
➔ Tinciones diferenciales: ​Se prepararon dos extendidos de microorganismos, y se fijaron al
calor. Se les realizó a ambos una tinción de Gram.
● 1er extendido:​ ​Pseudomona aeruginosa y​ ​Staphylococcus aureus.​
● 2do extendido:​ ​Escherichia coli ​y ​Bacillus cereus.
➔ Tinciones especiales: ​Se preparó un extendido de ​Bacillus cereus​, ​Bacillus thuringiensis y​
Bacillus sphaericus (todos ellos Gram +, y esporulantes). Al mismo se le realizó una tinción de
esporas mediante la técnica Schaeffer - Fulton.

DISCUSIÓN Y RESULTADOS
Todas las observaciones fueron realizadas con aumento de 100X, a excepción de la muestra
de levadura observada en el microscopio de fluorescencia con aumento de 40X.

Tinciones Simples
Cristal Violeta:​

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Azul de Metileno:

Tinción negativa:

En cuanto a la morfología de las muestras se observan formas de bastones en ​Escherichia coli​,

Pseudomona aeruginosa y ​Bacillus cereus,​ mientras que ​Enterococcus Faecalis y ​Staphylococcus
aureus​ presentan forma de esferas.
En cuanto al agrupamiento, ​Bacillus cereus se encuentra formando cadenas en las dos tinciones
observadas. En cambio, ​Staphylococcus aureus​ se observa en forma de racimos.
Pseudomona aeruginosa ​se observa en pequeños bacilos . Lo mismo puede apreciarse en
Escherichia coli,​ salvo que estos bacilos son más cortos.
En ambas tinciones de ​Bacillus cereus se puede apreciar la presencia de esporas sin teñir, ya que
estas no tienen afinidad con el colorante empleado.
Enterococcus faecalis​ se observa en forma de cadenas.

Tinciones diferenciales
Tinción de Gram:​

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Se observan las muestras de microorganismos gram negativos (E coli y Pseudomonas aeruginosa) de
color rosado y las muestras de microorganismos gram positivos (Bacillus cereus y Staphylococcus
aureus) de color violeta.

Tinción de BAAR:

Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que
se utiliza azul de metileno como tinción de contraste​.

Tinción de esporas - técnica Schaeffer - Fulton:

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Bacillus cereus,​ son bacilos Gram positivos que forman cadenas cortas.
Se observaron esporas cilíndricas subterminales, ademas de gran cantidad de bacterias esporuladas.

Tinción de Ácidos Nucleicos

CONCLUSION

A través del trabajo en el laboratorio se pudo determinar que el microscopio de campo claro es una
herramienta muy útil a la hora de observar objetos muy pequeños como células procariotas o
eucariotas, pero que para su correcta visualización se debe hacer uso de las distintas tinciones.

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Debido a que los colorantes son moléculas cargadas positivamente (cationes) y las paredes celulares
tienen carga levemente negativa, estos se unen a las paredes con intensidad, pudiendo realizar las
tinciones simples tanto con cristal violeta como con azul de metileno, y una tinción negativa con tinta
china, para observar sus morfologías y disposiciones en el espacio de los microorganismos. Por
ejemplo, Bacillus cereus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis y
Pseudomonas aeruginosa.
Las tinciones simples resultan ineficaces para observar las esporas. Estas poseen unas cubiertas
gruesas que hacen que aparezcan en el microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil
tinción. Esta característica de las esporas, no permite absorber el colorante y no se observan.
Es por ello que se utilizaron técnicas especiales de tinción que aplican calor para generar poros que
permiten el ingreso de las sustancias coloreadas a las esporas y así poder observarlas.
Las células vegetativas tienen afinidad por el agua, por lo que, al lavar las muestras sometidas a
colorantes y calor, destiñen, mientras que las esporas quedan coloreadas y pueden ser observadas
fácilmente al microscopio.
Con la tinción de Gram se lograron visualizar y diferenciar a las células Gram positivas de las Gram
negativas. Esta diferenciación se da partiendo desde el fundamento teórico de la composición de las
membranas y de la pared de cada bacteria.
La diferenciación se da de acuerdo al grosor de la capa de peptidoglicanos que tiene la capacidad de
retener el colorante por más tiempo, por lo tanto, las Gram positivas absorbieron el colorante primario
y no fueron decoloradas, no así como las Gram negativas que fueron decoloradas y luego
nuevamente teñidas con un colorante secundario para así poder distinguirlas.
La tinción diferencial de BAAR tiene un fundamento similar a la tinción especial de esporas: hay que
aplicar calor para generar poros en las gruesas paredes de micobacterias para que los colorantes
puedan ingresar. En este caso se utilizó carbol fucsina, de color rosado que tiñó todas las bacterias
presentes en la muestra, pero luego al decolorar con ácido-alcohol, todas excepto las ácido - alcohol
resistentes fueron decoloradas y luego re coloradas con un colorante secundario para poder
diferenciarlas de las BAAR.
Finalmente se utilizó Naranja de acridina que tiene la capacidad de intercalarse con el ADN de las
células para que, al ser irradiado con luz UV, se torne fluorescente y puedan verse estos ácidos
nucleicos en el microscopio de fluorescencia. Se pudo observar que la muestra tenía mayor cantidad
de ARN que de ADN.
En conclusión, se deben utilizar técnicas de tinción específicas para lograr observar objetos tan
pequeños en el microscopio óptico, como son las estructuras de microorganismos procariota. Las
tinciones son herramientas elementales, vigentes y de uso universal que contribuyen al diagnóstico
microbiológico.

Bibliografía

● Madigan, Martinko, Parker, Brock. Biología de los Microorganismos, 10°edición,

Pearson-Prentice Hall, Madrid, 2004

9
● Harley, Klein, McGraw, Prescott. Microbiología, 8° edición, Hill Interamericana, Madrid,1999

● Apuntes para las clases teóricas y prácticas de"Microbiología general"

● http://www.revistabiomedica.org

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