Nombres: Myriam Abad y Nathaly Cruz Asignatura: Biotecnología Animal

NRC: 4755 Fecha: 17/04/2019

INFORME DE LABORATORIO N°1
TEMA: Extracción de DNA genómico con un kit comercial en muestras de sangre de ganado
bovino.
OBJETIVOS
• Conseguir DNA genómico con alta pureza utilizando como muestras la sangre de bovinos.
• Aplicar un método comercial de extracción de DNA, de tal forma que garantice la
obtención de un buen extracto.
• Valorar la calidad de DNA usando electroforesis.
INTRODUCCIÓN
Aislar DNA en grandes cantidades, puro, concentrado y sin contaminación favorece al posterior
desarrollo de técnicas como PCR y electroforesis, además de que los resultados van a tener una
mayor confiabilidad (Psifidi & Dovas, 2015). En el área de investigación animal se utiliza por
ejemplo para analizar animales con diferentes tipos de enfermedades ya sean infecciosas o
genéticas (Checa, 2018).
Existen diversas fuentes para la adquisición de DNA, pero la que más se utiliza son las muestras
de sangre completa. Existen diferentes protocolos para ejecutar la extracción de ácidos nucleicos
que van desde técnicas muy básicas, kits, hasta protocolos automatizados. Sin embargo, para fines
específicos se requiere un gran conocimiento para la elección del mejor método ya que se debe
tener en consideración varios factores (Chacon & Griffiths, 2014).
La sistemática de extracción de DNA tiene elementos comunes: lisis, separación del DNA de los
otros elementos celulares y aislamiento del DNA. La lisis puede ser llevada a cabo por calor, SDS
o DTT. Para retirar de los otros materiales celulares incluidas las proteínas y lípidos se utiliza
generalmente la centrifugación o usando disolventes orgánicos. Los procedimientos de extracción
que se usan más son: método orgánico (variaciones de fenol / cloroformo), inorgánico (Chelex o
sílice), en fase sólida (DNA IQ de Promega) y extracción diferencial (Elkins, 2013).
La electroforesis permite separar fragmentos de macromoléculas como DNA, RNA o proteínas
por su tamaño y carga. Las moléculas se trasladarán a desiguales velocidades en el gel por lo que
se irán separando (Fierro, 2017). Si colocamos además un marcador podemos determinar el tamaño
de cada fragmento que se haya obtenido en el revelado. Esta técnica sirve también para evaluar el
rendimiento del DNA (Promega, 2019).
PROCEDIMIENTO
Extracción de DNA
Se colocó en un tubo pequeño 500 uL de sangre entera (muestra #7), se le agregó 1 mL de
agua libre de nucleasas, se homogeneizó, después se puso a incubar por 5 min y se centrifugó
durante otros 5 min a 7000 rpm. Se resuspendió el pellet en 200 uL de PBS. Se adicionó 20 uL de
solución proteinasa K, se mezcló con agitación, se aumentó 400 uL de solución lisis y se combinó
de nuevo en vórtex. Se incubó a 56°C durante 10 min con movimiento en un shaker pequeño, se
sumó 200 uL de etanol y se mezcló por pipeteo.
La mezcla anterior se transportó a una columna (que ya venía en el kit), se centrifugó por
un tiempo de 1 min a 8000 rpm, se retiró el tubo colector y se colocó la columna en un nuevo tubo.
Se añadió 500 uL de tampón de lavado WB I, se centrifugó durante 1 min a 10000 rpm, se separó
el líquido colectado y se puso la columna otra vez en el tubo colector. Posteriormente se aumentó
500 uL de tampón de lavado II a la columna, se hizo centrifugar a 14 000 rpm por 3 min. Se vació
el tubo de recogida y se ubicó la columna purificante de vuelta en el tubo. Esto se sometió a
centrifugación a 14 000 rpm durante 1 min, se rechazó el contenido del tubo de recolección y se
transfirió la columna a un tubo de 1,5 mL. Se adicionó 100 uL de tampón de elución en la columna
(específicamente en la membrana), se incubó por 2 min y se centrifugó a 10000 rpm durante 1
min. Se eliminó la columna y se procedió inmediatamente a correr el DNA en electroforesis.
Electroforesis
Preparación del gel de agarosa. Se preparó un gel de agarosa al 0,8%, para ello se pesó
0,32g de agarosa en 40 mL de volumen de gel. Se mezcló la agarosa con buffer TBE 1X en un
vaso de precipitación, se fue agitando y calentando en un microondas la veces que fueran
necesarias hasta que la mezcle quedase totalmente homogénea, se dejó enfriar hasta una
temperatura de 55°C y se añadió 1,5 uL de SYBER safe. Se agregó la solución de agarosa al molde
y se dejó solidificar protegido de la luz. El gel ya solidificado se sacó con cuidado y se colocó
sobre la cámara de electroforesis con los pocillos orientados al polo negativo, se llenó la cámara
con buffer TBE 1X hasta cubrir el gel y se cargó las muestras.
Carga de muestras y revelado de bandas. Se mezcló 8 uL de muestra con 2 uL de buffer
de carga. El volumen de muestra cargado fue de 10 uL y del marcador de peso molecular de 1 kb,
5 uL, en el gel. Se pasó corriente de 100 V durante 1h y se observó las bandas con luz UV.
RESULTADOS
Observación de marcador molecular (1) de 1kb, y banda única en la parte superior en la totalidad
de las muestras de DNA de sangre de bovino (2-6), tras electroforesis en gel de agarosa al 0,8%.
 Figura 1. Bandas de DNA genómico obtenidas de sangre bovina (Sempertegui,2019).

DISCUSIÓN
Para la extracción de DNA comúnmente se usan resinas costosas, o por fenol-cloroformo, siendo
tóxicas o llevando mucho tiempo; por ello actualmente el uso de kits comerciales aseguran un alto
rendimiento y pureza de DNA, a menor tiempo y costo (Thermo Scientific ™, 2018). Se utilizo
sangre bovina recolectada en tubos morados con EDTA (muestra #07) y el kit comercial “GeneJET
Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit” , un método rápido y eficaz que aseguro la
obtención de DNA no degradado, libre de RNA e inhibidores, gracias a sus columnas con
membranas de sílice; permitiendo visualizar una banda clara y definida en la electroforesis (figura
1).
La electroforesis permite separar el DNA en bandas y observarlas en geles de acrilamida o agarosa,
quedando los fragmentos grandes en la parte superior, mientras que a la parte inferior se van los
más pequeños; y conocer su tamaño al compararlos con un marcador molecular (Fierro,2017). En
el laboratorio se elaboró un gel al 0,8% de agarosa siendo este un porcentaje bajo y por tanto el
tamaño de bandas que se obtuvieron fueron grandes; esto se confirmó al comparar con el marcador
molecular usado (1kb), donde se vio que las bandas obtenidas se ubicaron solo en la parte superior
del gel, correspondiente al DNA genómico.
A demás para la observación de bandas y estimación de la cantidad relativa de DNA en el gel,
colorantes como el bromuro de etidio, SYBR Gold, SYBR Green, cristal violeta, entre otros, son
utilizados (Fierro & Gutiérrez, 2001). En el laboratorio se usó SYBR Safe, ya que posee una buena
sensibilidad y no es cancerígeno como el bromuro.
Para la corrida del gel es necesaria una solución amortiguadora con sales, que permita pasar la
corriente y movilice el DNA, estos son los buffers de electroforesis, tris-borato- EDTA o tris-
acetato EDTA (Lee, 2012). Se utilizó TBE (1x) ya que en comparación con el TAE tiene mejor
capacidad de amortiguación por períodos largos.
CONCLUSIONES
➢ En la investigación y diagnóstico de enfermedades es imprescindible trabajar con una
buena calidad de DNA, que dependerá del proceso de extracción y verificación por técnicas
como electroforesis.
➢ Se obtuvo DNA puro y libre de inhibidores a partir de sangre bovina con un kit comercial
basado en columnas de membranas de sílice, que aseguraron la adhesión del DNA a la
membrana.
➢ Se obtuvo DNA genómico, al observar una banda de tamaño mayor a 1kb, en la parte
superior del gel de electroforesis.

RECOMENDACIONES
➢ Al momento de utilizar SYBER safe hacerlo con mucha precaución.
➢ No descartar ningún tubo ni líquido hasta haber terminado la práctica.
➢ No olvidar la agitación en vórtex para homogeneizar las mezclas.
➢ Los guantes que se usen en el área de Biología Molecular deben ser desechados en la misma
área.

BIBLIOGRAFÍA

Aaij, C., & Borst, P. (1972). The gel electrophoresis of DNA. En Biochimica and Biophysica (págs. 30-
34).

Chacon, D., & Griffiths, L. (2014). Methods for genomic DNA extracting from whole blood
samples. Dovepress.
Checa, A. (2018). Extracción de ADN. Retrieved from Conogasi:
http://conogasi.org/articulos/extraccion-de-adn-2/
Elkins, K. (2013). DNA Extraction. Forensic DNA Biology.
Fierro, F. (2017). Retrieved from Electroforesis:
https://micrositios.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/electroforesis.pdf
Fierro, F., & Gutiérrez, J. (2001). Karyotyping of fungi by Pulsed Field Gel Electrophoresis. . Recent
Research Developments in Genetics (1), 105-125.
Lee, P. Y. (2012). Electroforesis en gel de agarosa para la separación de los fragmentos de ADN.
University of California Los Angeles.

Promega. (2019). Retrieved from How do I determine the concentration, yield and purity of a
DNA sample?: https://worldwide.promega.com/resources/pubhub/enotes/how-do-i-
determine-the-concentration-yield-and-purity-of-a-dna-sample/
Psifidi, A., & Dovas, C. (2015). Comparison of Eleven Techniques for DNA Extraction . Plos
One.
Thermo Scientific ™. (2018). Mini kit de purificación de ADN genético de sangre entera GeneJET.
Obtenido de https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K0782