“PCR”

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) transformó radicalmente la ciencia

biológica desde el momento en que se descubrió, permitió la detección específica y la
producción de grandes cantidades de ADN, estrategias que han impulsado grandes
esfuerzos científicos como el Proyecto del Genoma Humano. La técnica es ampliamente
utilizada por clínicos e investigadores con la finalidad de diagnosticar enfermedades,
clonar y secuenciar genes, así como llevar a cabo sofisticados estudios genómicos y
cuantitativos de manera rápida y muy sensible.

PCR en tiempo real (Q-PCR)

La PCR cuantitativa, o PCR en tiempo real, (qPCR) utiliza la linealidad de la amplificación

de ADN para determinar cantidades absolutas o relativas de una secuencia conocida en
una muestra. Al usar un indicador fluorescente en la reacción, es posible medir la
generación de ADN en el ensayo de qPCR.

En qPCR, la amplificación de ADN se monitoriza en cada ciclo de PCR. Cuando el ADN se

encuentra en la fase lineal de registro de la amplificación, la cantidad de fluorescencia
aumenta por encima del fondo. El punto en el cual la fluorescencia se vuelve medible se
llama el ciclo umbral (CT), por sus siglas en inglés o punto de cruce. Al usar múltiples
diluciones de una cantidad conocida de ADN estándar, se puede generar una curva
estándar de concentración logarítmica contra CT. La cantidad de ADN o ADNc en una
muestra desconocida se puede calcular a partir de su valor de CT.
La PCR en tiempo real también se presta a ensayos para determinar cantidades relativas
de ADN. Se puede realizar una reacción utilizando cebadores únicos para cada región
objetivo para amplificarlos y etiquetarlos con diferentes colorantes fluorescentes.
Varios termocicladores cuantitativos disponibles comercialmente incluyen múltiples
canales de detección.

Se utilizan dos tipos de detección química para el análisis de PCR en tiempo real.

Agentes intercalantes: Utilizan un agente intercalante que se incorpora en el ADN de

doble cadena, el SYBR® Green I se utiliza más comúnmente. Este método de detección
es adecuado cuando se está estudiando un solo amplicón, ya que se intercalará en
cualquier ADN de doble cadena generado. Este sistema de detección tiene la ventaja de
ser menos costoso que las sondas específicas y mayor facilidad de manipulación. Su
principal desventaja es su poca especificidad, ya que se unen de manera indistinta a
productos generados inespecíficamente o a dímeros de cebadores, muy frecuentes en
la PCR.

Sondas de hibridación específica: El proceso se basa en la transferencia de energía

fluorescente mediante resonancia (FRET) entre un donor y un aceptor, dos tipos de
fluorocromos con los que vienen marcados las sondas. Las más utilizadas son TaqMan®,
Molecular Beacons y las sondas FRET.

El oligonucleótido está marcado con un tinte fluorescente y un extintor. El

oligonucleótido en sí no tiene una fluorescencia significativa, pero presenta
fluorescencia cuando se recuece a la plantilla (como en Molecular Beacons) o cuando el
tinte se recorta del oligo durante la extensión (como en las sondas TaqMan).
Retro transcriptasa PCR (RT PCR)

El proceso de síntesis de ácido desoxirribonucleico (ADN) a partir de una plantilla de

ácido ribonucleico (ARN) se denomina “transcripción inversa” debido a que invierte el
flujo de información genética (de ARN a ADN, en lugar de hacerlo de ADN a ARN que se
encuentra en la transcripción normal).

La reacción de transcripción inversa (RT) se lleva a cabo mediante un ADN polimerasa

retroviral denominada transcriptasa inversa. La transcriptasa inversa es la enzima de
replicación dentro del retrovirus que convierte su ARN genómico monocatenario en
ADN.

En los laboratorios de biología molecular, la transcriptasa inversa es una enzima

polimerasa de ADN dependiente de ARN utilizada para transcribir ARN monocatenario
en ADN complementario monocatenario (ADNc). Durante el proceso de transcripción
inversa, los cebadores oligonucleotídicos complementarios a la cadena de ARN se
reasocian al molde de ARN y se extienden en presencia de desoxinucleótidos (dNTP) y
condiciones óptimas de pH y sal para producir ADNc. La transcriptasa inversa nativa es
una enzima multifuncional.

Además de su actividad de polimerasa de ADN dependiente de ARN, también posee:

 Una actividad de polimerasa de ADN dependiente de ADN débil que carece

actividad exonucleasa de 3’→’5.
 Una actividad de ARNasa que degrada la plantilla de ARN a partir de hebras
híbridas de ARN / ADN a medida que avanza la síntesis de ADNc.
PCR Inversa (I PCR)

La PCR inversa (IPCR) se diseñó para amplificar regiones anónimas de ADN genómico
flanqueantes. Esta técnica involucra la digestión del ADN fuente, la circulación de
fragmentos de restricción y la amplificación utilizando oligonucleótidos que ceban la
síntesis de ADN dirigida desde la región central de una secuencia conocida, es decir,
opuesta a la dirección de los cebadores utilizados en la PCR normal o estándar. Antes de
la invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la adquisición de un
fragmento de ADN específico generalmente implicaba la construcción y selección de
bibliotecas de ADN, y el tradicional "caminar" en fragmentos de ADN flanqueantes
implicaba el sondeo sucesivo de bibliotecas con clones obtenidos en La proyección
previa. Estos procedimientos que consumen mucho tiempo podrían ser reemplazados
por IPCR. Debido a que el IPCR se puede usar para amplificar de manera eficiente y
rápida las regiones de secuencia desconocida que flanquean cualquier segmento
identificado de ADNc o ADN genómico, los investigadores no es necesario construir y
seleccionar bibliotecas de ADN para obtener información adicional sobre la secuencia
de ADN no identificada utilizando esta técnica. Algunos fagos o plásmidos
recombinantes pueden ser inestables en bacterias y las bibliotecas amplificadas tienden
a perderlos. IPCR elimina este problema.

El método en sí se basa en la utilización de cebadores divergentes, cuyos extremos 3'

OH se ubiquen hacia el exterior de la secuencia conocida. Una reacción PCR estándar no
funciona con cebadores de este tipo. En la I PCR, el ADN es tratado con una enzima de
restricción de manera que la región deseada quede comprendida en un pequeño
fragmento de restricción, que se circularizará por complementariedad de los extremos
cohesivos. Una vez circularizado el fragmento, procede la reacción de PCR estándar
utilizando los cebadores divergentes, que ahora sí permiten que se desarrolle la
reacción.

Nested PCR

Nested PCR es una modificación de la PCR que fue diseñada para mejorar la sensibilidad
y la especificidad, implica el uso de dos conjuntos de cebadores y dos reacciones de PCR
sucesivas. El primer conjunto de cebadores está diseñado para ser acoplado a
secuencias aguas arriba del segundo conjunto de cebadores y se utiliza en una reacción
de PCR inicial. Los amplicones resultantes de la primera reacción de PCR se utilizan como
plantilla para un segundo conjunto de cebadores y una segunda etapa de amplificación.

La sensibilidad y la especificidad de la amplificación de ADN pueden mejorarse

significativamente con esta técnica. Sin embargo, el potencial de contaminación por
arrastre de la reacción también suele aumentar debido a la manipulación adicional de
los productos de amplicón. Para minimizar el arrastre, las diferentes partes del proceso
deben estar físicamente separadas unas de otras. Los amplicones de los ensayos de
Nested PCR se detectan de la misma manera que en la PCR anterior.
RFLP PCR
El análisis basado en el polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción por PCR
(RFLP), también conocido como secuencia polimórfica amplificada escindida (CAPS), es
una técnica popular para el análisis genético. Se ha aplicado para la detección de
intraespecies, así como la variación entre especies.
El primer paso en un análisis de PCR-RFLP es la amplificación de un fragmento que
contiene la variación. A esto le sigue el tratamiento del fragmento amplificado con una
enzima de restricción apropiada. Dado que la presencia o ausencia del sitio de
reconocimiento de la enzima de restricción da como resultado la formación de
fragmentos de restricción de diferentes tamaños, la identificación de los alelos se puede
realizar mediante resolución electroforética de los fragmentos.

Las ventajas importantes de la técnica de PCR RFLP incluyen el bajo costo y el escaso
requerimiento de instrumentos avanzados. Además, el diseño de los análisis de PCR-
RFLP en general es fácil y se puede lograr utilizando programas públicos disponibles. Las
desventajas incluyen el requisito de endonucleasas específicas y las dificultades para
identificar la variación exacta en el caso de que varios SNP afecten al mismo sitio de
reconocimiento de enzimas de restricción. Además, dado que PCR-RFLP consta de varios
pasos que incluyen un paso de separación electroforética, requiere bastante tiempo.
Finalmente, la técnica no es adecuada para el análisis simultáneo de un gran número de
SNP diferentes debido al requisito de un par de cebadores y una enzima de restricción
específicos para cada SNP. Esto limita su utilidad para el análisis de alto rendimiento.

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