Criterios de selección de columnas para HPLC – resumen

Tema 5.- Criterios de Selección de Columnas para HPLC. Aplicaciones Analíticas.

COLUMNAS CROMATOGRÁFICAS Y FASES ESTACIONARIAS

La columna es el lugar donde ocurre la separación. Es la parte esencial del cromatógrafo de líquidos ya que
en ella, a través de diferentes mecanismos (adsorción, partición, cambio iónico, exclusión, etc.), tiene lugar la
separación o discriminación entre analitos e interferentes.

Las columnas de HPLC han mejorado significativamente. El material de empaquetamiento es más uniforme
y el tamaño de las partículas menor, lo que implica un aumento de la presión de trabajo. Las fases estacionarias se
encuentran químicamente enlazadas al soporte. Los métodos de preparación han mejorado significativamente.

COMPONENTES DE UNA COLUMNA

 Material de Empaque
 Naturaleza de la superficie del empaque (esta puede ser modificada física o
químicamente)
 Tamaño de la Partícula
 Forma de la Partícula

 Contenedor del Empaque

 Longitud
 Diámetro
 Material

Soportes

Originalmente estos eran sílica y alúmina de formas irregulares. Hoy en día están disponibles una serie de
soportes sintéticos de formas muy regulares.

- porosos: presentan canales a través del soporte

- de superficie porosa: presentan una superficie áspera
- de superficie lisa: su superficie es esférica

Tamaño de partículas

En la medida que se reduce el tamaño de la partícula, aumenta la eficiencia, así como los requerimientos
de presión.

FASES ESTACIONARIAS

En la actualidad se emplean cuatro grandes categorías:

- sílica o alúmina
- fases enlazadas químicamente a sílica o alúmina
- geles
- vidrio o sílica con tamaño de poro controlado

Fases de adsorción

1. Alúmina:

Las fases móviles comunes son: hexano, cloroformo, 2-propanol.

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2. Sílice:

Las partículas de sílice utilizadas en cromatografía de adsorción poseen una cierta abundancia de grupo
silanol (Si-OH), anclados en una superficie. Estos grupos son químicamente activos y pueden aprovecharse como
punto de partida que permita la filación de radicales orgánicos (Si-R) en la superficie de la sílice. Si se consigue un
grado de funcionalización suficiente de la superficie, el resultado puede asemejarse al conseguido por una simple
impregnación.

Las fases móviles comunes son: hexano, cloroformo, 2-propanol.

Columnas y rellenos en Cromatografía de reparto

Los soportes para casi todos los rellenos con fases enlazadas se preparan con sílice rígida o
composiciones constituidas básicamente por sílice. Estos sólidos están formados por partículas mecánicamente
resistentes, porosas y uniformes, con diámetros de 3, 5 o 10 µm. La superficie de la sílice totalmente hidrolizada (por
calentamiento con HCI 0,1 M durante uno o dos días) está constituida por grupos SiOH químicamente reactivos.

Los recubrimientos de fase enlazada más utilizados son los siloxanos, que se forman por reacción de la
superficie hidrolizada con un organoclorosilano. La letra “R” representa un grupo alquilo o un grupo alquilo sustituido.

Los grupos SiOH que no han reaccionado, imparten una polaridad indeseable a la superficie, lo que origina
picos con cola en especial con los solutos básicos. Para reducir este efecto, los rellenos de siloxano muchas veces
se desactivan por reacción con clorotrimetilsilano, el cual, debido a su pequeño tamaño, puede unirse químicamente
a los grupos SiOH que no habían reaccionado.

* En cromatografía en fase normal, el componente menos polar se eluye primero, debido a que es más
soluble en la fase móvil; un aumento de la polaridad de la fase móvil provoca una disminución del tiempo
de elución.

En los rellenos de fase enlazada en fase normal el recubrimiento unido químicamente contiene grupos
funcionales polares. En la estructura del siloxano, “R” es un grupo funcional polar como es el
caso de los grupos...

... ciano (-C2H4CN)

... diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH)
... amino (-C3H6NH2)
... dimetilamino [-C3H6N(CH3)2].

Las polaridades de estos materiales de relleno varían en un gran intervalo, siendo el tipo ciano el menos
polar y el tipo amino el más polar. Los rellenos de diol son de una polaridad intermedia.

La elución se realiza con disolventes relativamente no polares, tales como el etiléter, cloroformo y n-
hexano.

* En la cromatografía en fase inversa, los componentes más polares eluyen primero; un aumento de la
polaridad de la fase móvil aumenta el tiempo de elución.

En los rellenos de fase enlazada en fase inversa el recubrimiento tiene un carácter no polar. Por lo
general, el grupo “R” del siloxano en estos recubrimientos es una cadena C8 (C-8; RP8), una
cadena C18 (C-18; RP18). En estas preparaciones, los grupos de hidrocarburo de cadena larga
se alinean el uno junto al otro y en perpendicular a la superficie de la partícula, dando un
recubrimiento enlazado se puede tratar como si fuera un líquido convencional retenido
físicamente.

La elución se lleva a cabo con una fase móvil de elevada polaridad como es el caso de una solución
acuosa conteniendo concentraciones diversas de disolventes como metanol, acetonitrilo (ACN) o
tetrahidrofurano (THF). Se ha de procurar que el pH sea menor de 7,5 porque si no puede tener
lugar la hidrólisis del siloxano, lo que originaría la degradación o destrucción del relleno.

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Rellenos de intercambio iónico

Históricamente, en cromatografía de intercambio iónico se han empleado pequeñas partículas esféricas

porosas que se forman en la copolimerización del estireno y del divinilbenceno emulsionados. La presencia de
divinilbenceno (8%) origina una polimerización entrecruzada que imparte estabilidad mecánica a las bolitas. Con
objeto de activar el polímero frente a los iones, a la estructura se le unen químicamente grupos funcionales ácidos o
básicos. Los grupos más comunes son el ácido sulfónico y las aminas cuaternarias. La polimerización entrecruzada
mantiene juntas las cadenas lineales de poliestireno.

Las partículas poliméricas porosas no resultan del todo adecuadas como rellenos cromatográficos debido a
la baja velocidad de difusión de las moléculas de los analitos a través de los microporos de la matriz polimérica, y
también debido a la compresibilidad de la matriz. Para solventar este problema, se han desarrollado dos nuevos
tipos de rellenos que se utilizan más que el tipo de polímero poroso,

* Uno es el relleno de partícula pelicular en el que la superficie relativamente grande (de 30 a 40 µm) de
una partícula, esférica y no porosa, de vidrio o polimérica se recubre con una resina sintética de
intercambio iónico.

* Un segundo tipo de relleno se prepara recubriendo micropartículas porosas de sílice, tal como las que
se utilizan en la cromatografía de adsorción, con una delgada película del intercambiador.

Con cualquiera de ellas, se obtiene un aumento de la eficacia debido a que la difusión en el polímero es
más rápida. Por otra parte, la capacidad de carga de estos rellenos es menor, especialmente los de tipo pelicular.

Las fases móviles en cromatografía de intercambio iónico suelen ser disoluciones acuosas que pueden
contener cantidades moderadas de metanol u otros disolventes orgánicos miscibles con el agua; estas fase móvil, a
menudo contienen especies iónicas en forma de disolución reguladora. La fuerza eluyente y la selectividad se
determinan por el tipo y concentración de esos ingredientes añadidos. En general, los iones de la fase móvil
compiten con los iones del analito por los puntos activos del relleno del intercambiador iónico.

Rellenos de columna cromatografía de exclusión

La selección se hace con base en los requerimientos de presión y el rango de tamaño que aplica a los
analitos. Se encuentran dos tipos de rellenos - partículas poliméricas y partículas de sílice - con diámetros de
partícula que oscilan de 5 a 10 µm. Los últimos tienen la ventaja de:

- una gran rigidez, lo que facilita el empaquetamiento;

- una mayor estabilidad, lo que permite el uso de una gran variedad de disolventes incluyendo el
agua;
- una equilibración más rápida al cambiar el disolvente;
- y una buena estabilidad a elevadas temperaturas.

Los inconvenientes de las partículas de sílice son su tendencia a retener solutos por adsorción, y su
capacidad para catalizar la degradación de las moléculas del soluto.

La cromatografía de exclusión por tamaños se llevó a cabo fundamentalmente utilizando copolímeros de

estireno-divinilbenceno . El tamaño de poro en estos polímeros se controla por el grado de entrelazamiento entre las
cadenas poliméricas y por tanto con la cantidad relativa de divinilbenceno presente en la fabricación. Los geles de
estireno-divinilbenceno son hidrofóbicos y de este modo sólo pueden utilizarse con fases móviles no acuosas. Sin
embargo, en la actualidad se dispone de geles hidrofílicos, que hacen posible el uso de disolventes acuosos para la
separación de moléculas grandes solubles en agua. Estos geles hidrofílicos son por lo general polímeros de
estireno-divinilbenceno con grupos sulfónicos, o poliacrilamidas.

Las partículas de vidrio y de sílice porosas, que se comercializan actualmente, tienen tamaños promedio de
poro que oscilan entre 40 y 2500 Å. A fin de reducir la adsorción, las superficies de estas partículas se modifican por
reacción con sustituyentes orgánicos.

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TIPOS DE RELLENOS DE LA COLUMNA

En cromatografía líquida se utilizan dos tipos básicos de rellenos, pelicular y de partícula porosa:

* El relleno pelicular consiste en bolas de vidrio o de polímero, no porosas y esféricas con unos
diámetros característicos de 30 a 40 µm. En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada y
porosa de sílice, alúmina o de una resina de intercambio iónico. Para algunas aplicaciones se aplica un
recubrimiento adicional, constituido por una fase estacionaria líquida que se mantiene fija por adsorción.
Las bolas también se pueden tratar químicamente para obtener una capa superficial orgánica. Por lo
general, los rellenos peliculares se utilizan ampliamente en las precolumnas y no en las columnas
analíticas.

* Los típicos rellenos de partículas porosas de cromatografía líquida están formados por micropartículas
porosas con diámetros entre 3 y 10 µm. Las partículas son de sílice, alúmina o resinas de intercambio
iónico, aunque la sílice es el material más común. Las partículas de sílice se sintetizan aglomerando
partículas de sílice de tamaños inferiores al micrón en unas condiciones tales que se forman partículas
mayores con diámetros muy uniformes. Las partículas que resultan se recubren muchas veces con
películas orgánicas, que se unen química o físicamente a la superficie.

TIPOS DE COLUMNA

- columnas convencionales
- empaquetamiento pelicular
 por recubrimiento
 porosidad superficial
- empaquetamiento de micropartículas porosas

- microcolumnas
- microtubulares abiertas
- microcapilares parcialmente empaquetadas
- microcolumnas totalmente empaquetadas

Se observa una distinción básica entre las convencionales y las microcolumnas (en relación con su
diámetro.

Características Cromatografía líquida de alta resolución

Cromatografía
geométricas e Empaquetamiento
líquida clásica Microparticular Microcolumnas
hidrodinámicas de película
Columna
Diámetro (mm) 20 – 70 1–3 2–6 0.05 – 1
Longitud (cm) 20 – 100 50 – 100 10 – 50 103 – 5x103
Partícula
Diámetro (m) 150 30 – 70 5 – 10 5 – 30
Presión (atm) 1 30 – 50 100 – 200 150 – 250
Caudal (ml/min) 0.1 0.5 – 5 1–2 10-4 – 5x10-2

Dentro de las columnas HPLC convencionales, son las de empaquetamiento de película las primeras que
se usaron. El material (fase estacionaria) consiste en bolitas esféricas regulares (30 – 70 m) de un sólido no
poroso, generalmente vidrio, que están recubiertas de una capa (1 –3 m) de material activo cromatográfico poroso,
de naturaleza polimérica. La distribución cromatográfica entre fase móvil y estacionaria es más asequible que si se
tratase de partículas porosas de igual tamaño. No obstante, la capacidad y eficacia de las columnas con este tipo de
empaquetamiento en HPLC aumenta considerablemente cuando se sustituye el recubrimiento posterior por un
tratamiento especial de las bolitas de vidrio (30 – 60 m) para que adquieran una microzona porosa externa (1 – 3
m), también de vidrio, para que pueda actuar de sólido activo en cromatografía de adsorción, o bien como soporte
de la fase estacionaria líquida (enlazada o no). El volumen de poro de estas bolitas es muy pequeño, lo que origina
una rápida difusión de los solutos en ambos sentidos, por lo que son adecuadas para cuando se requiere una gran
velocidad de determinación.

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El empaquetamiento microparticular comporta importantes ventajas: mayor capacidad y eficacia. No

obstante, también conllevan un mayor grado de empaquetamiento, lo que implica un aumento de la presión de
trabajo y una gran dificultad de empaquetamiento adecuado y homogéneo en el laboratorio, por lo que casi siempre
se adquieren en el comercio. Al ser el área activa mucho mayor, éstas son aptas para separaciones cromatográficas
difíciles y complejas (solutos de propiedades muy parecidas o un elevado número de solutos). Al reducir el tamaño
de estas micropartículas porosas, disminuye la profundidad de los poros, por lo que se aumenta la eficacia.

Las columnas para cromatografía líquida se construyen de ordinario con tubo de acero inoxidable de
diámetro interno uniforme, aunque en algunas ocasiones se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes.
Estas últimas sólo se utilizan a presiones menores de unos 600 psi.

Las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o más columnas.

Recientemente, se han empezado a fabricar columnas de alta resolución más rápidas, las cuales tienen
menores dimensiones que las anteriormente descritas. Presentan la ventaja de la rapidez (unos segundos) y del
mínimo consumo de disolvente.

Las microcolumnas en HPLC suponen una reducción sustancial del diámetro de las mismas y un aumento
considerable de la longitud. Las características técnicas de la HPLC miniaturizada llevada a cabo en la modalidad
“microcolumna” son tres:

1. pequeño diámetro interno de la columna (0.05 a 1 mm, según tipo)

2. gran longitud (20 – 30 m), lo que implica la necesidad de enrollarse en forma de serpentín de
configuración ancha
3. pequeño caudal (1 – 50 l/min)

Las ventajas que comporta el empleo de microcolumnas en HPLC:

1. aumento de la eficacia: especialmente aptas para la separación de mezclas complejas y

difíciles
2. reducción drástica del consumo de la fase móvil
3. aumendo de la sensibilidad de ciertos detectores

Pueden distinguirse tres tipos básicos de microcolumnas en HPLC:

- Las microtubulares abiertas tienen el material activo cromatográfico (líquido depositado

mecánicamente o sólido soporte inerte o activo) recubriendo homogeneamente la pared interna de
un microtubo (diámetro de 50 m o menor) de gran longitud. Existe una zona central neta libre sin
empaquetar. La difusión radial es muy pequeña por lo que la transferencia másica se favorece
considerablemente. El caudal característico de trabajo es de 0.1 l/min.
- Las microcapilares con empaquetamiento parcial tienen un diámetro interno algo superior a las
anteriores (70 m). Las partículas del sólido activo o soporte (30 m) no son esféricas y una gran
parte de las mismas está retenida mecánicamente en la pared interna, siendo su distribución
uniforme a lo largo de la columna. Son típicamente impermeables. El caudal de trabajo normal es
de 1 l/min.
- Las microcolumnas totalmente empaquetadas no difieren sustancialmente de la configuración
de las columnas HPLC convencionales, salvo el diámetro pequeño. El caudal ordinario empleado
en las mismas es de 40 – 50 l/min.

Las características generales de un cromatógrafo deben adaptarse a la miniaturización y, por tanto,

reducirse drásticamente:

- El volumen interno del sistema de inyección

- El volumen de la célula de flujo del detector
- Los volúmenes muertos de las conexiones

Además, las condiciones técnicas son diferentes para cada tipo de microcolumna.

Para aumentar la vida de la columna analítica, se coloca delante una precolumna que elimina la materia en
suspensión y los contaminantes de los disolventes. La precolumna sirve para saturar la fase móvil con la fase
estacionaria y así minimizar las pérdidas de ésta en la columna analítica. La composición del relleno de la
precolumna debe ser semejante al de la columna analítica; sin embargo, el tamaño de partícula es por lo común
mayor para minimizar la caída de presión.

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Termostatación

En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura, y las columnas trabajan a

temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces controlando la temperatura de la columna en unas pocas
décimas de grado centígrado, se obtienen mejores cromatogramas. La temperatura en HPLC afecta a la solubilidad
de los solutos en la fase móvil, a la difusión de los mismos y a la viscosidad de la fase móvil. El tiempo de retención
es el parámetro que más se afecta por un cambio de temperatura; así, incrementos de 5 – 6 ºC pueden originar una
reducción del 25 – 30 % en los tiempos de retención. Por ello, es conveniente un control preciso de la temperatura,
en especial de la columna cromatográfica, al objeto de obtener resultados reproducibles.

El sistema de termostatación es por aire en unas cámaras denominadas “hornos, para las columnas que
controlan la temperatura de la columna a las décimas de grado ( 0.3 – 0.5 ºC). La temperatura normal es de 25 ºC,
aunque para cietos tipos de cromatografías, como la de exclusión por tamaños, en determinados casos, son
necesarias temperaturas del orden de 200 °C.

Son escasos los sistemas HPLC con programación de temperatuar durante el proceso cromatográfico. Una
dificultad importante estriba en que la máxima temperatura tiene que ser al menos 20 ºC inferior al punto de
ebullición de la fase móvil; por ello, la capacidad de incremento de la resolución cromatográfica empleando una
variación de temperatura es mucho menor que la de variación de la composición de la fase móvil. Se: reducción de
los tiempos de retención de picos que salen muy lentamente y mejora de la resolución al principio y al final del
cromatograma.

EFICACIA DE LA COLUMNA

Hay tres fenómenos que explican este ensanchamiento en la HPLC.

El efecto del tamaño de partícula del relleno se realiza mediante un examen del coeficiente de
transferencia de masa de la FM de la ecuación de Van Deemter (C) observando que C es función del cuadrado del
diámetro dp de las partículas que constituyen el relleno. La eficacia de una columna de HPLC debería mejorar mucho
cuando disminuye el tamaño de partícula.

En cromatografía líquida, tiene lugar a veces un ensanchamiento de banda significativo fuera del relleno de
la columna. Este ensanchamiento de banda extracolumna, tiene lugar cuando se transporta el soluto a través de
tubos como los que se utilizan en los sistemas de inyección, en los detectores y en los tubos que conectan los
distintos componentes del sistema. El ensanchamiento proviene de la diferente velocidad de flujo que hay entre las
capas de líquido adyacentes a las paredes del tubo y las del centro. Como consecuencia, la parte central de una
banda de soluto se mueve con más rapidez que la periferia.

Todos los esfuerzos han de orientarse a la reducción del radio de los tubos del sistema externos a la
columna.

Existe, por último, un efecto del tamaño de muestra en la eficacia de la columna. Los rellenos de fase
enlazada en fase inversa, comparados con otros tipos de rellenos, presentan una HETP muy baja y casi constante.

FACTORES QUE AFECTAN LA EFICIENCIA DE UNA COLUMNA

 Longitud de la Columna
 Diámetro de la Columna (1/4", 1/8", 1/16" de diámetro externo)
 Tamaño de las partículas del relleno
 Naturaleza de las fases
 Cantidad de fase estacionaria
 Temperatura de la columna
 Velocidad del gas portador
 Cantidad de muestra inyectada
 Material del cual está elaborada la columna

APLICACIONES
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APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA DE REPARTO

Los rellenos con fases unidas químicamente, cuando se utilizan en fase inversa en combinación con
disolventes muy polares (a menudo acuosos) se aproximan al sistema ideal y universal para la cromatografía líquida.
Para investigar la separación de nuevos tipos de muestras, estos son los rellenos que se utilizan en primer lugar.

Algunas aplicaciones típicas de la HPLC de reparto son: productos farmacéuticos, bioquímica, productos
alimentarios, productos de la industria química, contaminantes, química forense, medicina clínica.

En algunos casos, es conveniente la formación de derivados, o sea, transformar los componentes de una
muestra en otros compuestos antes, o a veces después, de proceder a la separación cromatográfica. Puede ser
necesario,

(1) para reducir la polaridad de las especies y de este modo poder utilizar columnas de reparto y
no de intercambio iónico,
(2) para aumentar la respuesta del detector para todos los componentes de la muestra y
(3) para aumentar selectivamente la respuesta del detector para determinados componentes de la
muestra.

Las aplicaciones de la cromatografía de pares iónicos con frecuencia se superponen con las de la
cromatografía iónica. Para la separación se pequeños iones inorgánicos y orgánicos se prefiere la cromatografía
iónica a no ser que haya un problema de selectividad.

Las fases estacionarias quirales (CSPS) para separar isómeros ópticamente activos (enantiómeros) tanto
por cromatografía de gases como líquida, aunque se adapta mejor a la HPLC.

Actualmente se comercializan más de una docena de fases estacionarias quirales. Todas ellas son
recubrimientos sobre soportes de gel de sílice. El recubrimiento por lo general consiste en un material polimérico al
cual se le ha unido un isómero ópticamente activo.

APLICACIONES ORGÁNICAS Y BIOQUÍMICAS DE LA CROMATOGRAFÍA IÓNICA

La cromatografía de intercambio iónico se ha aplicado a una variedad de sistemas orgánicos y bioquímicos

incluyendo drogas y sus metabolitos, sueros, conservantes de alimentos, mezclas de vitaminas, azúcares y
preparaciones farmacéuticas.

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN

Los métodos de exclusión por tamaños se subdividen en:

* cromatografía de filtración en gel: se utilizan disolventes acuosos y rellenos hidrofílicos

* cromatografía gel permeable (GPC): los métodos se basan en disolventes no polares y en
rellenos hidrofóbicos

Separan las moléculas de alto peso molecular de productos naturales de las especies de bajo peso
molecular y de las sales. También es útil en la separación de homólogos y oligómeros. Otra gran aplicación es la
determinación rápida de los pesos moleculares, o de la distribución de pesos moleculares en los grandes
polímeros o en los productos naturales.