||UNIVERSIDAD

NACIONAL MAYOR
DE SAN MARCOS

Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Facultad de Ing. Geológica, Minera, Metalúrgica, Geográfica y Civil

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE METALUGICA

Informe Biometalurgia N°1

 PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES

Objetivos:

 Conocer los principios generales de las técnicas de esterilización de materiales de vidrio

y medios de cultivo de uso común en Microbiología.
 Observar el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la contaminación
microbiana en el laboratorio.

Introducción:

Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cambios de condiciones
ambientales y en la medida en que se han podido adaptar a estos cambios, se han distribuido
en una gran diversidad de hábitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de tipo
físico y químico.

Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y esterilización para limitar su

presencia o eliminarlos. La esterilización es un método de eliminación de organismos y asegura
la ausencia de cualquier forma viviente, mientras que la desinfección solamente elimina formas
vegetativas de los microorganismos

La esterilización con calor seco y húmedo son los procedimientos de mayor utilización en
Microbiología. El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los microorganismos por
oxidación. Estos métodos se aplican principalmente en la esterilización de asas de inoculación y
todo tipo de material de vidrio y quirúrgico.

Cuestionario

1) ¿Cuáles son los métodos de esterilización más utilizados en Microbiología?

Métodos físicos
Los métodos físicos son aquellos que no involucran el empleo de sustancias letales para los
microorganismos, sino procedimientos físicos como la radiación ionizante, el calor o
la filtración de soluciones con membranas que impiden el paso de microorganismos, incluyendo
virus.

 Calor húmedo (en autoclave de vapor)

 Calor seco (en horno de esterilización)
 Incineración
 Aire caliente
 Pasteurización
 Ebullición
 Vapor
 Tindalización
 Radiación
Métodos químicos
Los métodos químicos de esterilización son aquellos que involucran el empleo de sustancias
letales para los microorganismos, tales como el óxido de etileno y el peróxido de hidrógeno. El
uso de este método es muy limitado para la Industria Alimentaria pero muy utilizado en otras
industrias como la farmacéutica.

 Alcoholes
 Aldehídos
 Fenoles
 Óxido de etileno
 Peróxido de hidrógeno

Métodos térmicos
Los métodos térmicos suelen englobar todos los procedimientos que tienen entre sus fines la
destrucción de los microorganismos por el calor. Los métodos son tanto la pasteurización como
la esterilización, cuya finalidad principal es la destrucción microbiana, como al escaldado y a la
cocción, procesos en los que también se consigue una cierta reducción de la flora microbiana,
pero que sus objetivos principales son la variación de las propiedades físicas.

2) ¿Para qué tipo de materiales se aplica cada uno de ellos?

3) ¿Cuáles son las diferencias entre los procesos de esterilización, desinfección y asepsia?

Esterilización

Se define como la destrucción de todos los microorganismos (bacterias, virus) y esporas de algún
elemento. Dichos elementos se refieren a objetos que entran en contacto con tejidos durante
el acto quirúrgico: instrumental, paños de campo, suturas, batas de cirugía, guantes, gasas, etc.
Hay varias formas de esterilización que se exponen a continuación:

 Con calor seco (estufas).

 Con vapor (autoclave).
 Química fría (glutaraldehído 2%).
  Plasmática (iones reactivos, electrones).
 Ionizante (cobalto 60).
 Química (óxido de etileno).

Sólo las tres primeras son viables en la Medicina Veterinaria habitual. Las otras son formas de
esterilización industrial o de grandes hospitales.

Desinfección

Es la destrucción de la mayoría de los microorganismos patógenos de objetos inanimados. Con

este procedimiento no se logra matar o inactivar a todos los microorganismos incluso
utilizándolo correctamente. En la clínica diaria, desinfectamos mobiliario, suelos y algún material
que no puede ser esterilizado por sus características. Generalmente la desinfección implica el
uso de productos líquidos como:

 Alcohol.
 Hipoclorito (desinfección suelos, mostradores).
 Compuestos iodados al 7,5% (suelos y mostradores de color oscuro).
 Glutaraldehído al 2% (lentes e instrumental delicado).

Antisepsia

Es la destrucción de la mayoría de los microorganismos patógenos de objetos vivos. Se utilizan

antisépticos cuando se prepara la piel del paciente y se hace el lavado quirúrgico. Hay que
tener muy claro que la piel no se puede esterilizar y se utiliza la antisepsia como recurso. Los
antisépticos utilizados son:

 Iodo (povidona jabonosa 7,5%, povidona iodada 10%).

 Alcohol isopropílico (IP) al 70%.
 Clorexidina.
 Combinaciones (iodo + alcohol IP, clorhexidina + alcohol IP).

4) ¿Cómo se relacionan estos procedimientos con la pasteurización?

La pasteurización o pasterización1 es un proceso térmico que es realizado

en líquidos (generalmente alimentos) con la intención de reducir la presencia de agentes
patógenos (como por ejemplo ciertas bacterias, protozoos, mohos, levaduras, etc.) que puedan
contener. Debido a las altas temperaturas la gran mayoría de los agentes bacterianos mueren.
En la pasteurización, el objetivo primordial no es la «eliminación completa de los agentes
patógenos» sino la disminución sustancial de sus poblaciones, reduciéndolas a niveles que no
causen intoxicaciones alimentarias a los humanos (siempre que el producto pasteurizado se
mantenga refrigerado correctamente y que se consuma antes de la fecha de
caducidad indicada)
 FIJACION Y COLORACION SIMPLE DE FROTIS

Objetivos

 Aprender las técnicas de preparación de frotis, de fijación y coloración más utilizadas en

el estudio microscópico de cultivos bacterianos, obtenidos de medios sólidos y líquidos.
 Identificar las principales formas bacterianas y la importancia de las funciones simples
en la caracterización morfológica de estos microorganismos.

Introducción

Debido al pequeño tamaño de la mayoría de los microorganismos, se requiere de un microscopio

óptico, ya sea de campo claro o de campo oscuro para hacer la descripción morfológica de éstos.
El microscopio de uso más comunes el de campo claro, en el que la observación de células vivas
es ilimitada debido a que las células son incoloras y permiten el de una gran cantidad de luz.

La observación de frotis teñidos es más recomendable, El frotis se prepara haciendo una

extensión de los microorganismos sobre una superficie transparente, en la cual se fijan y tiñen
los microorganismos. De acuerdo al número de soluciones colorantes y a los objetivos de
estudio se pueden realizar diferentes tipos de tinciones como son: simple, diferencial, negativa
y selectiva. Los frotís de cultivos líquidos se deberán fijar con alcohol para evitar residuos del
medio, que al quemarse darán Interferencias en las observaciones y los de colonias de medios
sólidos se fijan generalmente con calor. Después de la fijación, los frotis son teñidos con
diferentes colorantes sintéticos derivados de anilina. Los colorantes más utilizados son sales
formadas por iones coloridos cargados conocidos como cromóforos. Por ejemplo:(Cromóforo Cl
metileno de Azul metileno de Azul de Cloruro) Si el cromóforo es un ion positivo el colorante es
de tipo básico pero si la carga es negativa será de tipo ácido. La mayoría de las bacterias son
teñidas por colorantes básicas, que permean la pared celular y se adhieren por enlaces iónicos
débiles a moléculas con cargas negativas de la célula bacteriana. La tinción de las bacterias con
azul de metileno, es un ejemplo de tinción simple que facilita la observación de forma, tamaño
y arreglo de las células.

Cuestionario

1. Investigue cuales con las estructuras celulares o moléculas responsables de la tinción simple
realizada. De ejemplos de otros colorantes que podrían utilizarse.

La tinción simple se basa en la afinidad del colorante por los componentes celulares. La tinción
puede ser uniforme o presentar algunos gránulos en su interior. Utiliza un solo colorante (violeta
de genciana, azul demetileno, fuscina diluida).La tinción simple se utiliza para destacar el
microorganismo completo para que se vean las formas y lasestructuras celulares básicas. En las
tinciones simples se usa un único reactivo, que preferentemente es de tipo básico y contiene un
cromógeno (compuesto que da color al tinte) con carga positiva, ya que la pared celular de las
bacterias posee componentes con carga negativa que atraen y enlazan el cromógeno. Se utilizan
solamente para incrementar el contraste; todas las células absorberán el colorante y quedarán
teñidas del mismo color.

 Azul de metileno: El azul de metileno se utiliza para teñir células animales, para hacer más
visibles sus núcleos. Es también utilizado para teñir los extendidos de sangre para ser utilizados
en citología y como colorante vital en el recuento de reticulocitos.
 Azul Nilo: Tiñe los núcleos de color azul. También puede ser utilizado para teñir células vivas.
 Cristal violeta: El cristal violeta, al ser combinado con un mordiente adecuado, tiñe las paredes
celulares de color púrpura. El cristal violeta es un componente importante en la coloración de
Gram.
 Eosina: La eosina se utiliza más frecuentemente como contra coloración de la hematoxilina,
impartiendo un color que va del rosado al rojo al material citoplasmático, membrana celular, y
algunas estructuras extracelulares. Además imparte un fuerte color rojo a los eritrocitos. La
eosina puede ser utilizada también en algunas variantes de la coloración de Gram, y en muchos
otros protocolos de tinción.
 Safranina: La safranina es un colorante nuclear. Colorea los núcleos celulares de rojo, y se utiliza
principalmente como contracoloración. También puede ser utilizada para darle una coloración
amarilla al colágeno.
 Verde de metilo: El verde de metilo se utiliza frecuentemente en microscopia de campo claro,
para teñir la cromatina de las células y facilitar así su visualización.

2. ¿Por qué se recomienda fijar de cultivos líquidos con alcohol y no con calor? ¿Por qué se
deben poner varias veces muestras del cultivo líquido y solo una muestra de cultivos sólidos
al preparar el frotis?

Los frotis de cultivos líquidos se deberán fijar con alcohol para evitar residuos del medio que al
quemarse darán interferencias en las observaciones y los de colonias de medios sólidos se fijan
generalmente con calor.

3. ¿Cuáles son las principales precauciones de manejo del microscopio y por qué se debe
utilizar el aceite de inmersión al hacer el estudio microscópico de bacterias?

 Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de
observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la
misma y dejarlo cubierto con su funda.
 Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para
evitar que se ensucien y dañen las lentes.Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar
en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.
 Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un
papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.
 No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio
  No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina,
revólver y condensador).
 El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación
para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por
el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular.
 Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo
con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol.
 Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al acabar
el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos.

Los objetivos de mayor aumento, tienen una distancia focal muy pequeña y además la primera
lente del objetivo es de pequeño diametro. Los rayos que desde la muestra se dirigen al objetivo
atraviesan el vidrio del cubre objeto y al pasar al aire se separan de la normal. Algunos rayos
incluso sufren reflexión total en la interfase vidrio-aire Solo llega al microscopio una pequeña
parte de la luz que parte de la muestra, con el problema que conlleva para la visión. Al intercalar,
entre el objetivo y el cubreobjeto una gota de aceite de cedro, de índice de refracción casi igual
al vidrio, los rayos emergentes ya no se apartan de la normal, sino que continúan su camino sin
desviación, consiguiendo así que una mayor cantidad de luz llegue al objetivo, mejorando
notablemente la visión.

4. ¿Cuáles son las desventajas o limitaciones de la tinción simple?

 Las células se mueren y no se pueden ver en su actividad.

 Se necesita microscopio
 Se usa un solo colorante

5. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la preparación del frotis?

Los errores pueden ser:

 Error humano
 El contacto con la sepa bacteriana
 Mala esterilización de la placa donde se desarrollara el frotis
 Mal ataque de la bacteria
 Mala coloración
 Falta de fijación
 Mal secado
 Quemar la muestra
 METODOS DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS

Objetivos:

 Conocer las diferentes técnicas de aislamiento en medios de cultivo sólido para la

obtención de cultivos puros de bacterias.
 Preparar medios de cultivo en función a las necesidades del estudio y pudiendo ser par
el aislamiento, adaptación y/o crecimiento en población.

Introducción:

Las bacterias deben ser cultivadas en medios de cultivo de laboratorio para caracterizar su
crecimiento, hacer su identificación y determinar sus actividades metabólicas. Un medio de
cultivo es una solución acuosa de diferentes compuestos que contiene todos los elementos
indispensables que requieren los microorganismos para crecer. Generalmente las bacterias son
inoculadas o introducidas en medios líquidos (caldos) o solidificados con agar para su
propagación y/o conservación, así como para estudiar sus características de crecimiento. Es
importante recordar que la inoculación de los microorganismo en los medios de cultivo, siempre
deberán realizarse en zona aséptica (cerca del mechero o en campana de flujo laminar),
condiciones que limitan la presencia de microorganismos indeseables o contaminantes.

Las técnicas de aislamiento, permiten la obtención de microorganismos a partir de muestras

complejas (suelo. agua, alimentos, etc.) en las que hay una gran diversidad microbiana, así como
para comprobar la pureza en los cultivos obtenidos, los cultivos puros están formados por un
soto tipo de microorganismo; y son indispensables para conocer las características morfológicas,
propiedades de tinción, actividad bioquímica e identificación de especies microbianas.

En el primer caso se considera que cada célula bacteriana que se separa dará origen a una
población que formara una colonia característica, visible a simple vista. La limitación principal
de estas técnicas de dilución, es que no es práctica para el aislamiento a partir de mezclas donde
el microorganismo de interés se encuentra en pequeñas cantidades, donde solamente se
obtendrán las bacterias dominantes.
Cuestionario

1. ¿Qué es el agar y de donde se obtiene? ¿Cuáles son los nutrimentos que proporciona a los
microorganismos?

Agar-agar

El agar o agar-agar es una sustancia gelatinosa, un polisacárido sin ramificaciones obtenido de

la pared celular de varias especies de algas de los géneros Gelidium, Eucheuma y Gracilaria,
entre otros, resultando, según la especie, de un color característico

El agar nutritivo contiene normalmente:

 0,5% de peptona;
 0,3% de extracto de carne/extracto de levadura;
 1,5% de agar;
 0,5% de cloruro de sodio;
 agua destilada;
 pH casi neutro (6,8) a 25 °C

2. ¿Por qué el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de bacterias? Proponga
algunas sustancias que se agregarían para hacerlo selectivo para bacterias Gram negativas.

La carga neutra y el bajo grado de complejidad química de la agarosa hacen poco probable que
interactúe con biomoléculas, como proteínas y ácidos nucleicos. Los geles a base de agarosa
purificada tienen un tamaño de poro relativamente grande, siendo útiles para la separación
basada en el tamaño molecular de complejos de proteínas o proteínas mayores a 200 kDa y
fragmentos de ADN mayores a 100 pares de bases. La agarosa se puede utilizar para la
separación electroforética en la electroforesis de gel de agarosa o para la cromatografía de
exclusión molecular.

Los ingredientes necesarios para este medio son los siguientes: sales biliares (medio inhóspito
para el crecimiento de bacterias Gram positivas, excepto Enterococcus y algunas especies de
Staphylococcus), colorante cristal violeta (inhóspito para cierto tipo de bacterias Gram-positivo),
indicador rojo neutro (el cual marca microorganismos que fermenten la lactosa), lactosa,
peptona y cloruro sódico.

3. ¿Cuáles la información que se obtiene de las siembras de cultivos bacterianos en tubos con
agar inclinado y en tubos con agar solidificado en forma recta?

Los tubos inclinados son útiles para el cultivo de aerobios y anaerobios facultativos. Las
características del cultivo tales como pigmento son fáciles de observar en este tipo de cultivo.
Los procedimientos para inocular caldos, tubos inclinados y por picadura serán demostrados
antes de que se lleven a cabo.
 METODOS DE CULTIVO Y DESCRIPCION MORFOLOGICA DE

ACIDITIOBACILLUS FERROOXIDANS

Objetivo

 Conocer las características morfológicas (macroscópicas y microscópicas) de la bacteria

Acidithiobacillus Ferrooxidans.

Introducción

Acidithiobacillus ferrooxidans es una proteobacteria, cuya característica principal es su

capacidad para metabolizar sustancias como el hierro y el azufre presentes en los depósitos de
pirita, tranformándolos en ácido sulfúrico.

Gram negativa y con forma de bastón, esta bacteria acidófila vive preferentemente a un pH de
entre 1’5 y 2’5. Es capaz de sobrevivir a altas concentraciones de metales pesados, muy tóxicos
para otras bacterias, por lo que es muy útil en procesos industriales de biolixiviación (extracción
de metales).

La biolixiviación es un proceso biotecnológico consistente en el uso de bacterias que se

alimentan a través de la oxidación de metales sulfurados, liberando así los metales, que son de
gran interés para la industria. Un buen ejemplo es el del sulfuro de cobre, que resulta un manjar
exquisito para nuestra bacteria de hoy. Por eso, al entrar en contacto con la roca, comienza el
proceso oxidativo, extrayendo electrones y disolviendo el sulfuro de cobre sólido. De este modo
se origina una disolución de sulfato de cobre, de la que se podrá extraer el metal de cobre
fácilmente.}

Cuestionario

1. ¿Cuáles son las principales estructura características de levaduras y mohos?

Excepto por las levaduras, que crecen como células únicas,

la mayoría de los hongos crecen como filamentos similares
a hilos. Estos filamentos se llaman hifas (singular, hifa).
Cada hifa consiste en una o más células rodeadas por una
pared celular tubular. Una masa de hifas componen el
cuerpo de un hongo, que se llama un micelio (plural,
micelios).
2. Elaborar un cuadro comparativo de características morfológicas, nutricionales y sensibilidad
a antibióticos de hongos y bacterias.

Hongos Bacterias

Morfología En forma Unicelulares, se

esférica o de llaman
barras levaduriformes o
levaduras;
filamentosos,
Nutrición Heterótrofos Heterótrofa

Sensibilidad Muy resistentes Muy Resistentes

Fisiología Sintetizan en Necesitan carbono

forma muy para su crecimiento
rápida todos
sus
componentes

3. Mencione los criterios de clasificación de hongos filamentosos y levaduras.

Hongos Filamentosos

Son hongos formados por una serie de ramas tubulares llamadas hifas, el conjunto de las cuales
forman el micelio. Se reproducen por la formación de esporas, las cuales pueden ser
pigmentadas y le dan el color al hongo. Al centro de la colonia se ubican las hifas fértiles que dan
origen a las esporas, razón por la cual los hongos son más coloreados en esa zona. -Presentan
una forma redonda u ovalada. -La mayoría son aeróbicos. -Su nutrición es heterótrofa. -Tienen
un tamaño superior al de las bacterias

Hongos Levaduriformes:

Son hongos unicelulares globosos, ovales o alargados de 2 – 6 um. que presentan reproducción
asexuada a través de yemación (Torulopsis, Candida), fisión binaria (Schizosaccaromyces) o
procesos intermedios (Saccharomyces). Algunas presentan reproducción sexuada por
ascosporas o teliosporas. Algunas levaduras forman pseudomicelios, que son brotes que
continúan unidos a la célula madre formando cadenas con constricciones completas sin unidad
citoplasmática. Las levaduras se desarrollan a temperaturas óptimas entre 25 y 30°C y forman
colonias lisas, de textura húmeda, cremosa o membranosa (sin hifas aéreas) semejantes a las
bacterias. A la observación en fresco, aparecen de mayor tamaño que las bacterias y se observan
células en yemación o fisión. Presentan una tinción Gram (+).Las levaduras presentan
metabolismo fermentativo, por lo cual su identificación se realiza por el estudio de la
fermentación de los azúcares. A la observación en fresco, aparecen de mayor tamaño que las
bacterias y se observan células en yemación o fisión. Presentan una tinción Gram (+). Las
levaduras presentan metabolismo fermentativo, por lo cual su identificación se realiza por el
estudio de la fermentación de los azúcares.

4. Describir tres problemáticas y tres benéficas en la utilización de bacterias.

Evitamos la contaminación medio ambiental

Poder ter controlado el proceso de expansión de la bacteria

Desarrollar nuevas sepas biológicas a nuestro favor

Cultivar una sepa contaminante

Aumentar el riesgo medio ambiental

No poder reproducirse en laboratorios