Introducción a las columnas

de HPLC

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En esta clase aprenderá lo
siguiente:
 Los diferentes usos de las columnas de
HPLC.
 Los materiales de relleno de las
columnas.
 Cómo seleccionar el diámetro de
partícula adecuado.
 Cómo seleccionar el diámetro interno de
columna adecuado.
 Cómo seleccionar la longitud de
columna correcta.

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 Columnas de HPLC
Muestreador
Precolumna
Fase móvil
desde la
bomba

Actúa sobre la muestra Columna

para atrapar partículas y analítica
componentes de muestras
retenidos con fuerza.
La columna
analítica lleva
a cabo la
Las columnas varían en los siguientes aspectos: separación.
• Longitud
• Diámetro interno
• Material de la fase estacionaria
• Tamaño de partícula de la fase estacionaria Al detector

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Columna - Acero inoxidable
estándar

Relleno de
columna

Frita de filtro de
acero inoxidable
Capilar
Tamaño de poro
de 2 um

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Columna - Columnas de
cartucho

Soporte del cartucho de protección

Cartucho de protección
Frita PEEK/Junta

Columna de cartucho

Conexión del
extremo

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 Materiales de relleno de
columnas - Sílice

Esférico

Soles de sílice Xerogeles

Irregular
Las partículas tienen un diámetro de
3 a 10 mm en las columnas estándar.

6
 Materiales de relleno de
columnas - Fases enlazadas
Poros

Cadena de carbono
con forma de cepillo

H3C Si CH3

Fase enlazada monomérica O OH

R1 R1 Si Si

Si-OH + Cl-Si-R Si-O-Si-R + HCl O O O

R2 R2

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 Materiales de relleno de columnas - Fases
enlazadas extensamente utilizadas
HPLC de fase inversa CH3
•C18 |
Las columnas de HPLC más utilizadas
•C8 -0-Si- R
•C4
|
Separaciones de proteínas
•C1 CH3
•Fenilo Dipolo débil - dipolo inducido
Interacciones con analitos polares Intercambio iónico

DEAE (dietilaminoetanol)
HPLC de fase normal o inversa QAE (aminoetilo cuaternario)
Carboximetilo
• CN Polaridad intermedia
Exclusión de tamaño
• NH2

HPLC de fase normal Glicerilpropilo

• Diol Separaciones de compuestos con

polaridades muy diferentes

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 Materiales de relleno de columnas
Rendimiento mejorado de desoxinucleósidos
utilizando fase enlazada óptima

mAU G Zorbax SB-C18

12 T 92% A : 8% B
LC: HP1090 C DAD1 A, Sig=254,16 Ref=
8
Columnas: 4,6 x 50 A
mm, 3,5 µM 4
Flujo: 1,0 ml / min.
6 min
0
A: 0,1% TFA -4
B: 90% MeOH:
mAU G
10% H2O (0,1% 40
TFA) T Zorbax SB-CN
30
Temp.: 30 °C C A 97,5% A : 2,5% DAD1
B A, Sig=254,16 Ref=
20
Detec.: 254 nm
10 2 min
0

0 2 4 6 8 min

9
 Materiales de relleno de columnas -
Soportes de polímeros
Estireno Divinil benceno Estireno-divinilbenceno

CH = CH 2 CH = CH 2
- CH2 - CH - CH-2 - CH - CHC2 - CH - CH22 - -

CH = CH 2 - CH2 - CH - CH-2 - CH - CHC2 - CH - CH22 - -

Admiten:
 Fase normal e inversa
 Intercambiadores iónicos
 Cromatografía por exclusión de tamaño

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 Tamaño de partícula - Efecto en
la eficacia

Número de platos/metro/103
Teórico

3 -µm

N
5 -µm

10 -µm
Velocidad de flujo Velocidad de flujo de la fase móvil, ml/min
Columnas Zorbax SB-C8; d.i. de columna, 4,6 mm; ciprofloxacina; 22 °C
Fase móvil, 20% ACN/80% acuosa, 0,1% TFA

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 Tamaño de partícula - Efecto en la
eficacia y la resolución
300SB-C8 (4,6 x 50 mm)
6
5µm 2 7 1. Met Encefalina
2. Leu Encefalina
1 5 3. Angiotensina II
4. Neurotensina
9
3 4 10 5. RNasa
6. Insulina
7. Lisozima
8. Calmodulina
8 9. Mioglobina
10. Anihidrasa carbónica

300SB-C8 (4,6 x 50 mm)

3,5µm

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tiempo de retención, min.
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 Número aproximado de platos (N) y
volumen vacío (Vm) para columnas de 5
mm y 3,5 mm
Si se reducen simultáneamente la longitud de la
columna (N ) y el tamaño de partícula (N ), se
podrá:
◦ Mantener la resolución
◦ Reducir el tiempo de análisis
◦ Reducir el uso de disolventes
Tamaño de la Número de platos Volumen vacío
Tamaño de partícula
columna (N) (Vm )
4,6 x 250 mm 5-m m 20.000 2,5 ml
4,6 x 150 mm 5-m m 12.000 1,5 ml
4,6 x 150 mm 3.5-m m Resolución rápida 20.000 1,5 ml
4,6 x 75 mm 3.5-m m Resolución rápida 10.000 0,75 ml
4,6 x 50 mm 3.5-m m Resolución rápida 6.000 0,5 ml
4,6 x 30 mm 3.5-m m Resolución rápida 3.600 0,3 ml
4,6 x 15 mm 3.5-m m Resolución rápida 2.000 0,15 ml

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 Aumentar la velocidad de análisis
mientras se mantiene la resolución
5 mm 3,5 mm 5 mm 3,5 mm

Dimensiones 250 x 4,6 mm 150 x 4,6mm 150 x 4,6 mm 75 x 4,6 mm

40% 50%
Tiempo de 30 min Reducción18 min 18 min 9 min
Reducción
análisis (min)

40% 50%
Residuo de 30 ml Reducción 18 ml 18 ml Reducción 9 ml
disolvente
(ml)

N 20.000 20.000 12.000 10.000

Sin modificar 9% de diferencia

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 Conseguir todo el potencial con
mayor velocidad de flujo
Presión mAU Rs2,1 = 2,2 Velocidad
300 Rs7,6 = 2,2 de flujo
200
90 bar 100
0 2 ml/min
mAU
300
200
133 bar 100
0 3 ml/min
mAU Rs2,1 = 2,1
300 Rs7,6 = 2,2
200 30 seg
181 bar 100
0 4 ml/min
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0.6 0.7 0.8 0,9 min

Zorbax SB-C18, 3,5 µm, 4,6 x 30 mm

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 Columnas con diámetro interno pequeño y muy
pequeño
dp= 10 dmm Convencional
4,6 mm 1,00 ml/min

dp= 5 dmm
4,6 mm
0 2 4 6 8 10

Diámetro interno
muy pequeño

2,1 mm dp= 5 dmm 0,01 ml/min

o
1,0 mm 100 mm
200 mm
0 2 4 6 8 10
Ventajas:
 Consumo reducido de disolvente. Inconvenientes:
 Idóneas para análisis de trazas si la  La instrumentación debe tener un
cantidad de muestra es limitado. volumen externo a la columna muy
bajo.
 Fácil conversión de velocidad de flujo
para cambiar el método de columna  Las fritas se deben cambiar con más
analítica a columna de diámetro muy frecuencia.
pequeño.
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Velocidades de flujo típicas
d.i. de columna Flujo
(partículas de 5 mm ) ml/min
4,6 1 –2
3,0 0,4 - 0,8
2,1 0,2 – 0,4
1,0 0,05 – 0,09

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Separación de alta resolución utilizando
una columna de diámetro interno estrecho

Columna ZORBAX 300SB-C8, 2,1 x 150 mm, 50 pmol BSA

Tryptic Digest en 4M de urea, 50 ºC, 0,2 ml/min., UV-214 nm, A:
0,1% TFA en agua, B: 0,1% TFA en acetonitrilo/20% agua,
Gradiente: 2-62% B en 70 min.
18
 Longitud de columna - Adaptar la
longitud a la resolución deseada
SB-C18
DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,4

4,6 x 15 mm los 7 componentes se descomponen en menos de 1 min

Condiciones: LC: Hewlett-Packard HP1100

Columnas: Zorbax SB-C18, 3,5 µm
Fase móvil: DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,4
1 mM octano ácido sulfónico, Na sal, pH 2,5: ACN (80:20)
4,6 x 30 mm UV:
Vol. de inyección:
275 nm; flujo: 2,0 ml / min.; 70 °C
1 µl
Absorbancia
Adsorbance

Muestra: 4. Acetanilida
1. Acetoaminofeno (4-acetoamidofenol) 5. Aspirina (ácido acetilsalicílico)
DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,4
2. Cafeína 6. Ácido salicílico
4,6 x 50 mm 3. 2-Ac2-Acetoamidofenol 7. Fenacetina (acetofenetidina)

DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,4

4,6 x 75 mm

DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,4

1 2
4,6 x 150 mm 3 4
5 6 7

0 1 2 3 4 5 6 7 8 min

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