Universidad Nacional Federico Villarreal

Laboratorio de Microbiología II – Recuento de Coliformes: Análisis Microbiológico de Bebidas

El control del agua y alimentos como bebidas se lleva a cabo comprobando si la

operación o el proceso al cual se someten, cumplen con los requisitos comerciales y las
leyes vigentes. Examinándose habitualmente la operación o el proceso para asegurarse
que se adoptan buenas prácticas. El control de alimentos y bebidas se basa en dos
pilares: la inspección y el análisis de laboratorio.

El objetivo de este 4° Laboratorio de Microbiología II al realizar esta practica

es el análisis microbiológico, se utiliza para establecer si el agua o alimento es inocuo y
tomar decisiones acertadas para proteger la salud pública. Haciéndose necesaria una
adecuada interpretación y análisis de resultados, para poder brindar soluciones frente a
determinados problemas de la industria y brindar seguridad al productor y consumidor
final.

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I.- OBJETIVOS

 Determinar la presencia coliformes.

 Realizar un recuento de colonias aerobias
mésofilas.
 Investigar y realizar recuento de Escherichia coli.

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II.- GENERALIDADES:

Se consideran como bebidas alcohólicas o refrescantes las bebidas no

fermentadas, carbónicas o no, preparadas basándose en agua potable y con los
ingredientes característicos de esa bebida. Dichos ingredientes pueden ser: zumos de
frutas, extractos de fruta o partes de plantas comestibles, frutas, semillas y tubérculos
disgregados, esencias naturales o agentes aromatizantes, edulcorantes naturales y ácido
carbónico.

Según los componentes de estas bebidas, se pueden distinguir las siguientes

clases:

Agua gaseosa; se elabora con agua potable y anhídrido carbónico. Se le conoce

también como agua de celta. Si se añade bicarbonato de sodio recibe el nombre de agua
de soda.

Bebidas Gaseosas; se prepara con agua potable, anhídrido carbónico

edulcorantes, aromas y acidulantes como los ácidos tartarico, cítrico, málico, láctico y
fosfórico. Los edulcorantes pueden ser naturales o artificiales.
Bebidas refrescantes aromatizadas, se elabora con los insumos detallados en el
párrafo anterior. Además pueden contener zumos de frutas y en el caso de las bebidas
de cola, pueden contener cafeína en una cantidad máxima de 0,015% en peso. Las

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aguas tónicas y los amargos no alcohólicos pueden contener quinina en una cantidad
máxima de 0,01%.

Bebidas refrescantes de extractos, se elaboran como las bebidas refrescantes

aromatizadas, pero añadiendo extractos o agentes aromáticos naturales de origen
vegetal.

Bebidas refrescantes de zumos de frutas, la característica principal en su elaboración

es el uso de zumos de frutas, además de los componentes antes indicados.
Evidentemente el agua debe reunir las características organolépticas, físicas, químicas y
microbiológicas de máxima calidad .El anhídrido carbónico ha de tener una pureza
mínima de un 99.8%% estar exento de otros gases como ácidos nitroso y sulfúrico y
carecer de otras impurezas como aire u óxido de carbono.
En general, para el análisis de las aguas embotelladas se utilizan los métodos y los
medios de cultivo estándar. Sin embargo hay algunas discrepancias en relación con la
temperatura de incubación y el medio de cultivo mas adecuados para la determinación
del número de viables totales. Por ello nosotros trabajaremos con una temperatura de
incubación de 37°-C por 48 horas.

La microflora de las bebidas recién preparadas es muy variada, pero con la posterioridad
desaparecen numerosas especies bajo el efecto de los agentes selectivos existentes en
el medio, especialmente el pH bajo y la gran concentración de C02 .

Los microorganismos que se pueden detectar se pueden incluir en tres grupos:

1. Agentes alterantes típicos; se encuentran levaduras que producen una
fermentación rápida en orden decreciente de importancia, estas levaduras son
Saccharomyces cerevisae, Saccharomyces ovarum, S. Microelliosoides y S.
Florentinus.
De fermentactón lenta Saccharomyces intermedius, S Bisporus. Torulospsis
stellata, S. Montanus y Candida parapsilopsis.
2. Microorganismos alerantes, pero sólo para condiciones específicas; las
bacterias principales agentes de alteración son las acido lacticas, gram
positivas. catalasa negativas del género Leuconostoc que suelen soportar bien
las condiciones del entorno de !as bebidas.
Cabe citar como agentes potenciales de alteración a las levaduras tales como
Hansenula y Pichia, bacterias como Gluconobacter y Lactobacillus, y diversos
mohos como Penicillium, Aspergillus, Mucor, Fusarium y Oospora.

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3. Microorganismos no alterantes, son aquellos microorganismos que pueden

sobrevivir en las bebidas sin provocar efectos evidentes en ellas. Este es el
caso de levaduras aerobias como Rhodotorula y el de bacterias aerobias como
las de los géneros Bacillys y Acetobacter. Así como microorganismos de
interés higiénico como Escherichia coli y otros coliformes: streptococos del
grupo D, incluso otros agentes como Salmonellas. Estafilococos y Clostridios
que pueden sobrevivir durante un cierto tiempo en las bebidas.

III.- TECNICA (ICMSF 2000)

3.1 Protocolos a tener en cuenta

BEBIDAS GASEOSAS
Una tomada la muestra se procederá con degasificar la muestra, para (o cual se
toman unos 50 ml del producto y se vierten en un matraz con perlas de vidrio. Se disuelve

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y elimina el gas mediante agitación durante unos minutos a temperatura ambiente. Si el

producto es muy ácido se neutraliza con fosfato tripticasa al 20%. Una vez preparada (a
muestra se realizan (as diluciones decimales correspondientes usando agua peptona
(agua triptona) como diluyente.

REFRESCOS
Los recuentos totales deben ser bajos y estar ausentes los bacilos coliformes,
como en el agua potable. No son raras las alteraciones por levaduras y mohos y pueden
causar la elevación del pH permitiendo se desarrollen otros gérmenes menos ácido
-tolerantes.
En refrescos no carbónicos de frutas, no se inhiben las levaduras por la cantidad
de conservante autorizado legalmente La alteración se controla generalmente mediante
acidez. Tanto en éstos como en tos refrescos carbónicos, el contenido microbiano
disminuye con el tiempo.

ZUMO DE FRUTA
Los hongos termorresistentes pueden producir problemas en los zumos
concentrados. Se investigan mediante calentamiento a 77°C durante 30 minutos. Se
enfrían y se vierten con Agar al 2%. Se incuban hasta durante 30días.

BEBIDAS ALCOHOLICAS
En las industrias dé las sidras de manzana y de pera pueden producir problemas
los métodos de producción y recolección. No suelen desecharse los frutos del suelo y los
podridos, lo que introduce una fuerte carga de organismos productores de alteraciones.
La sidra, la cerveza y el vino pueden alterarse por las bacterias acéticas que convierten el
etanol en ácido acético.
La cerveza, especialmente sin lúpulo, puede estropearse por pedicoccus,
enfermedad debida a sarcina.

3.2 Reactivos, Materiales y Equipos

 Agar nutritivo
 Agua de peatonal al 0.1%
 Caldo brilla 2% bilis verde
 Agua destilada
 Pastilla antimicótica

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 Probeta (50ml , 10 ml)

 Lunas de reloj
 Vaso de precipitado 250 ml.
 Varillas de vidrio
 Botellas
 Tubos de ensayo
 Tubos durham
 Placa petri esterilizadas
 Pipetas (5,10 ml)
 Espátulas
 Baño María
 Estufa
 Balanza analítica

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CALDO BRILLA 2% BILIS VERDE AGUA DE PEPTONA AL O, 1%

TUBOS
DURHAM
INVERTIDOS BAÑO MARIA

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3.3.- Procedimiento

3.3.1.- Recuento de microorganismos viables totales (muestras liquidas u

homogeneizadas)

Se trata de conocer el número tota! de microorganismos presentes en las

muestras analizar. Este número no guarda relación con e! de microorganismos patógenos
por !o que no puede usarse como Índice de su presencia y sólo debe considerarse un
indicador de las características higiénicas generales del alimento.
Dependiendo de las características del medio utilizado (medio rico, medio limitado
en nutrientes para medido de la flora no láctica de alimentos fermentados) y de las
condiciones de incubación (mesófilos, psicrófilos) los microorganismos analizados serán
miembros de poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de
microorganismos aerobios o aerotolerantes (anaerobios facultativos)

PREPARACION DE LA MUESTRA

• La muestra se diluye por lo menos dos veces (1:10 y 1:100) con agua peptona en
botella especial que se agitan con la muestra.
• Seguidamente, con pipetas esterilizadas, se procede a la Siembra en los medios
de cultivo trabajados.

CONTAJE EN PLACA:
• Se toma un mililitro de la muestra y se coloca en la placa estéril.

• Luego se vierte de 10 - 12 ml. Del medio sobre la muestra y mover en forma

circular buscando homogeneidad. (Siembra por inoculación) incubar a 37 °C por
48 horas.
• Proceder a la lectura de las placas.

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LECTURA DE LAS PLACAS

• Cuadricular las placas en 1 cm2.

• Colocar la placa sobre el microscopio o

con la ayuda de una lupa contar y
caracterizar las colonias existentes.
• Luego del conteo multiplicar el numero
de colonias por el (área de la placa,
dicho resultado será el numero total de
colonias en la placa, luego se multiplica
el numero obtenido de la operación
anterior por la dilución de la muestra, obteniéndose finalmente el numero de
colonias por mililitro de muestra.

PRUEBA PRESUNTIVA DE COLIFORMES

• Preparar 9 tubos cada uno incluyendo un tubo de Durham, con

caldo brilla 2% bilis verde brillante.
• Esterilizar y enfriar tos tubos.

• Proceder a la siembra de las muestras.

• Añadir a los tres (3) primeros tubos 1 ml de muestra de la

dilución 1:10
• Añadir a los siguientes tres (3) tubos 1 ml de muestra de la
dilución 1:100
• Añadir a los últimos tres (3) tubos 1 ml de muestra de la dilución 1; 1000.

• Incubar a 37 °C por 48 horas

• Realizar la lectura correspondiente.

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IV. RESULTADOS Y DISCUSION

 La formación de gas confirma presencia de coliformes, además también se

observo turbidez en los tubos los cuales 7 viraron de color y los 2 restantes
cambiaron de color a medias. Inclusive algunos formaron películas.

 El diluyente general siempre debe contener agua de peatonal al 0,1% en agua

destilada o solución salina, en este laboratorio utilizamos agua destilada
respetando esa proporción.

 En el análisis de aguas y bebidas utilizamos como muestra: chicha morada el cual

el resultado fue
10-1 10-2 10-3 NMP /100ml
Tubos positivos a 37°C 2 1 0
Tubos positivos a 44°C 2 1 0

 La prueba confirmativa se realizo tonel caldo bilis verde brillante al 2%.

 El NMP de organismos coliformes por gramos de muestra es 15 x10 = 150 gramo

V.- CONCLUSION

 Esta técnica se usa principalmente para la estimación de bacilos coliformes,

puede utilizarse casi para toda clase de gérmenes en muestras liquidas si puede
observarse fácilmente el crecimiento, por ejemplo, si hay turbidez o producción de
ácido.

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VI.- CUESTIONARIO

GRUPO I:

1. Definir: Microcalorimetría, jugos de fruta, bacterias termoduricas

Microcalorimetría
Es una técnica que se maneja en el control de la calidad químico. La
fundamentación se basa en el uso de las propiedades de las diferentes presentes en los
alimentos y en el de instrumentos especiales para la determinación cualitativa y
cuantitativa. En la microcalorimetría, la concentración de una sustancia colorada se mide
comparándola con otra.

Se puede decir que es el estudio de los pequeños cambios de calor

producidos como consecuencia del antabolismo de nutrientes. Los diferentes tipos de
microorganismos metabolizan los substratos de forma diferente y, por ello, se ha usado la
microcalorimetría para poder identificar las especies presentes en un alimento: usando un
medio de cultivo con una composición definida de azúcares pueden llegar a identificarse
diferentes tipos de bacterias lácticas mediante los termogramas de su metabolización de
los azúcares presentes en el medio.

Jugos de frutas
Se trata de productos obtenidos de frutas frescas los cuales han sido
sometidos a un proceso preparación mecánica previa y tratados y posteriormente
conservadas con un proceso adecuado.

Bacterias termodúricas
Son microorganismos capaces de proliferar a altas temperaturas, con óptimos que
oscilan ente 55ºC y 75ºC. Tienen una tasa de crecimiento muy alta, pero muy corta. Se
pueden encontrar tanto en el aire como en el agua o suelo. En los alimentos los
principales géneros bacterianos son Bacillus y Clostridium, entre los mohos Aspergillus,
Cladosporium y Thamnidium.

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Dentro de esta clase es posible incluir los termòtrofos que son mesófilos que se
pueden desarrollar a temperaturas elevadas como ocurre con algunas bacterias lácticas,
por ejemplo estreptococcus thermophilus o Streptococcus faecalis.
2. ¿Para que sirve y que es el agar Caldo Mosto?

Es un medio de enriquecimiento para la proliferación de microorganismos que se

utiliza en el a análisis microbiológico de cervezas.

3. ¿Qué métodos de Recuento de microorganismos se realiza en la industria

cervecera?
Un método adecuado de investigación es el agar de recuento de placa enriquecido
con glucosa y extracto de malta. Deben incubarse series de placas en aerobiosis y
anaerobiosis a 30ºC. Entre las bacterias altamente habituales están pediococos,
lactobacilos y productoras de ácido acético. Un microorganismo importante en la industria
cervecera es Zymomonas anaerobia, que origina turbidez y sabores extraños y crece
exclusivamente en anaebiosis. El protocolo de análisis comprende.

- Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 +- 1ºC)

- Investigación y recuento de E. coli
- Investigación de Salmonella-Shigella.
- Investigación y recuento de Clostridium sulfito-reductores.
- Investigación y recuento de mohos y levaduras.

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