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UFT
CAMPUS GURUPI

FUNDAMENTOS DE GENÉTICA VOLTADOS À BIOTECNOLOGIA

PROFESSOR RAIMUNDO WAGNER

ASSUNTO: SEQUENCIAMENTO DE DNA

ALUNA: MAUREN SILVEIRA

Sequenciamento de DNA

Fundamentos de genética Mauren Silveira UFT-Gurupi


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Uma forma de se saber qual é a sequencia de nucleotídeos é


investigando a nova fita formada a partir da fita molde.

A enzima responsável pela formação da nova fita é a DNA polimerase.


Entendendo como ela age, pode-se entender melhor a formação do
DNA novo.

Em nucleotídeos normais há um grupo hidroxila na posição 3’ (OH).

A DNA polimerase reconhece esse (OH) e liga um outro nucleotídeo a


essa posição pelo grupo 5’ fosfato.

A DNA polimerase usa como ponto de partida o grupo 3’ (OH), se ele


não existir, a enzima não é capas de fazer a união desse nucleotídeo
ao próximo, o que interrompe a replicação do DNA.

Acontece que existem nucleotídeos semelhantes aos normais, mas


sem o grupo (OH). Eles são os TERMINADORES DE CADEIA. Eles
indicam que um gene terminou e que não é preciso mais prosseguir
com a replicação.

Cada nucleotídeo tem um peso diferente. Cada nucleotídeo tem um


complemento seu devido às configurações químicas.

Como já se sabe como os terminadores de cadeia agem, como a


enzima DNA polimerase age, pode-se fazer um teste “in vitro” para
“ver” qual sequencia de DNA temos num gene.

Os terminadores de cadeias usados no seqüenciamento de DNA são


os didesoxinucleotídeos. Assim como terminadores há os iniciadores.

Então, adiciona-se quatro cópias da fita de DNA a ser pesquisada


separadamente em tubos com iniciadores e terminadores marcados
com sondas radiotivas. São usados quatro terminadores: dA, dG, dC e
dT. Um para cada nucleotídeo de DNA existente.

A enzima DNA polimerase vai iniciar a replicação para nova síntese de


fitas de DNA, mas ela pode adicionar um didesoxinucleotídeo ao invés
de um nucleotídeo normal. Assim, ela mesma pára a síntese do DNA,
tendo como final neste pedaço de fita nova um dideoxinucleotídeo
específico (ou A, ou T ou C ou G) marcado radioativamente. Como
sabemos, no DNA, um nucleotídeo A liga-se a um T, um C liga-se a
um G, um G liga-se a um C e um T liga-se a um A.

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Quando a reação terminar haverá vários pedaços de fita marcados


radioativamente. O conjunto desses pedaços representa o gene
pesquisado.

O conteúdo de cada tubo é desnaturado por aquecimento para


eliminar a enzima e os “primers”. Cada tubo será analisado
separadamente em gel de eletroforese.

Esse gel é feito em acrilamida no lugar de agarose. A diferença é que


a acrilamida faz uma malha molecular que permite a separação mais
definitiva das moléculas de DNA.

Essa eletroforese também é diferente na forma como é feita. Sendo


em tubos verticais, a sequencia da nova fita é lida de baixo para
cima.

Como cada nucleotídeo tem um peso diferente, ele migra no gel em


posição diferente.

Dessa forma, através da leitura do gel que tem nucleotídeos


marcados, pode-se prever o que está imediatamente antes deles, e
quanto menor o fragmento, maior a definição da sequencia.

De acordo com as definições a seguir também será possível prever o


seqüenciamento.

• Em uma amostra normal de DNA espera-se encontrar:


Quantidade de (T +C) é sempre igual à de (A+G).

• A quantidade de T é sempre igual à de A e C é sempre igual à


de G, mas (A+T) não precisa ser igual à de G+C).

• Essa proporção varia em indivíduos de espécies diferentes, mas


é a mesma em tecidos diferentes do mesmo organismo.

• G-C tem 3 pontes de H e A-T tem 2 pontes de H. Portanto DNA


com muito G-C é mais estável que DNA com muito A-T.

• Há um padrão na configuração do DNA:

• Adenina e Guanina são moléculas maiores ligadas ao açúcar.


Timina e Citosina são moléculas menores ligadas ao açúcar.

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