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1 INTRODUÇÃO

A cromatografia é preliminarmente uma ferramenta analítica para a separação de

misturas, combinada com análises qualitativas e quantitativas das substâncias separadas, ela

ocupa um lugar de destaque devido a sua eficiência para efetuar a separação, a identificação e

a quantificação das espécies químicas, isoladamente ou em conjunto com outras técnicas

instrumentais de análise. Ela é baseada na migração diferencial dos componentes de uma

mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e

a fase estacionária. A grande variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias a

torna uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação.

O termo cromatografia foi primeiramente empregado em 1906 e sua utilização é

atribuída ao botânico russo Mikhael Semenovich Tswett, que descreveu suas experiências na

separação dos componentes de extrato de folhas e gema de ovo, onde usou colunas de vidro

recheadas com vários sólidos, finamente divididos, e arrastou os componentes com éter de

petróleo.

“O nome deriva-se das palavras gregas “chrom” (cor) e “graphe” (escrever), embora o

processo não dependa da cor, exceto para facilitar a identificação dos componentes

separados” (COLLINS, 1997, p. 13).

Neste artigo serão abordados os principais métodos cromatográficos:

cromatografia em papel, cromatografia de camada delgada, cromatografia gasosa e

cromatografia líquida de alta eficiência.

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2 CLASSIFICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA

As diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas considerando-se

diversos critérios, sendo os mais comuns relacionados à técnica empregada, ao mecanismo de

separação envolvido e aos diferentes tipos de fases utilizadas.

“A forma física do sistema de cromatografia define a técnica geral: a fase estacionária pode

ser colocada em um tubo cilíndrico ou disposta sobre uma superfície planar” (COLLINS,

1997, p. 15). Desse modo a cromatografia pode ser subdividida em cromatografia em coluna e

cromatografia planar.

Em relação a cromatografia planar resume-se à cromatografia em papel (CP), à

cromatografia por centrifugação (Chromatotron) e à cromatografia em camada delgada

(CCD).

Em se tratando da fase móvel, são três os tipos de cromatografia: cromatografia

gasosa, a cromatografia líquida e a cromatografia super crítica (CSC), usando-se na última um

vapor pressurizado, acima de sua temperatura crítica. A cromatografia líquida se divide em:

cromatografia liquida clássica (CLC) e a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). No

caso de fases móveis gasosas, separações podem se ser obtidas por cromatografia gasosa (CG)

e por cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR). A diferença entre os dois tipos está no

tipo de coluna utilizada.

Quanto à fase estacionária, distingue-se entre fases estacionárias sólidas, liquidas

e quimicamente ligadas. No caso da fase estacionária ser constituída por um liquido, este pode

estar simplesmente adsorvido sobre um suporte sólido ou imobilizado sobre ele. Suportes

modificados são considerados separadamente, como fases quimicamente ligadas, por

normalmente diferirem dos outros dois em seus mecanismos de separação.

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Pelo mecanismo de separação, as separações cromatográficas se devem à

adsorção, partição, troca iônica, exclusão ou misturas desses mecanismos.

Dentre os principais tipos de cromatografia, estão: cromatografia em papel (CP), à

cromatografia gasosa (CG), à cromatografia em camada delgada (CCD), à cromatografia

líquida de alta eficiência (CLAE).

2.1 Cromatografia em papel

A cromatografia em papel (CP) é uma das técnicas mais simples e requer menos

instrumentos para sua realização, porém é a que apresenta as maiores restrições para sua

utilização em termos analíticos. Neste tipo de cromatografia, uma amostra líquida flui por

uma tira de papel adsorvente disposto verticalmente. Utiliza-se o papel de filtro de celulose,

por ser altamente hidrófilo, mantendo um revestimento de água imperceptível. Os líquidos

polares terão grande afinidade pelas hidroxilas da molécula de celulose, formando pontes de

hidrogênio, ficando retido e funcionando como fase estacionária, e os líquidos menos polares

serão repelidos por esta estrutura, funcionando como fase móvel. Coloca-se a amostra a ser

analisada um pouco acima da extremidade inferior do papel seco, que após ter esta

extremidade inferior mergulhada numa mistura de solventes, terão os seus constituintes

arrastados, juntamente com esta mistura que tende a subir por capilaridade. Os diferentes

constituintes apresentarão variação na velocidade de deslocamento, de acordo com os seus

coeficientes de partição. Os componentes menos solúveis na fase estacionária (água) terão

uma movimentação mais rápida.

Este método embora menos eficiente que a CDC, é muito útil para a separação de

compostos polares, sendo largamente usado em bioquímica.

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2.2 Cromatografia em camada delgada

Na cromatografia em camada delgada (CCD), a fase estacionária é uma camada

fina formada por um sólido granulado (sílica, alumina, poliamida, etc.) depositado sobre uma

placa de vidro ou outro suporte inerte. Pequenas gotas de solução das amostras a serem

analisadas são aplicadas em um ponto próximo ao extremo inferior da placa. Deixa-se a placa

secar e, então coloca-se a mesma em um recipiente contendo a fase móvel (solvente ou

mistura de solventes). A polaridade do solvente deverá ser de acordo com a substância que se

deseja separar. Como somente a base da placa fica submersa, o solvente começa a molhar a

fase estacionária e por capilaridade. Deixa-se secar a placa após o deslocamento da fase

móvel sobre ela. A revelação da placa é feita com a aplicação de um reativo que dá cor às

substâncias de interesse.

A cromatografia em camada delgada é um método simples, rápido, visual e

econômico, é a técnica predominantemente escolhida para o acompanhamento de reações

orgânicas, sendo utilizada também para a purificação de substâncias.

2.3 Cromatografia gasosa

A cromatografia gasosa é uma das técnicas analíticas mais utilizadas, com poder

de resolução excelente, possibilitando a análise de várias substâncias em uma mesma amostra.

Dependendo do tipo de substância a ser analisada e do detector empregado, consegue-se

detectar em escala de nano a picogramas. Essa sensibilidade permite que pequenas

quantidades de amostras possam ser analisadas. As colunas cromatográficas utilizadas podem

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ser de níquel, aço inox ou de vidro. Os gases utilizados como fase móvel devem ter alta

pureza e ser inertes em relação à fase estacionária. Hidrogênio, nitrogênio e hélio são os mais

usados.

“A escolha depende da disponibilidade, pureza, consumo e tipo de detector utilizado”

(VOGEL, 2002, p. 160). A pureza do gás de arraste interferem no resultado, acusando

impurezas na ordem de partes por milhão (ppm) ou partes por bilhão (ppb), a eficiência da

aparelhagem depende da manutenção de um fluxo constante de gás de arrasto.

A injeção da amostra é feita através de microsseringas ou válvulas semelhantes às

utilizadas em CLAE.

“Os detectores são dispositivos que transformam as variações na composição do gás de arraste

em sinais elétricos” (PERES, 2002, p.228).

Existem diferentes tipos de detectores: 1) detector de condutividade térmica

(DCT), usado para compostos orgânicos, inorgânicos, derivados de petróleo etc. 2) detector

de ionização de chama (DIC), utilizados apenas para compostos orgânicos com baixa

sensibilidade para formaldeído e ácido fórmico, consiste de um campo elétrico (200 - 300 v) e

uma chama onde a amostra é queimada.

Nesses equipamentos é necessário o controle da temperatura do injetor, da

coluna e do detector, as quais são mantidas por termostatos. A escolha da fase estacionária é

de fundamental importância, sendo ela o componente crítico da coluna. As fases estacionárias

podem ser polares, apolares ou quirais. Fases polares são baseadas em polietileno glicol puro

ou modificado. As fases quirais mais comuns são compostas de ciclodextrinas.

A cromatografia gasosa é, atualmente, uma das técnicas de análise de maior uso,

pois os recentes avanços na área com a utilização de colunas capilares fazem da cromatografia

gasosa uma técnica altamente atrativa.

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2.4 Cromatografia liquida de alta eficiência

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) se desenvolveu muito nos

últimos anos, esse avanço se deve a

utilização de suportes com partículas diminutas responsáveis pela alta eficiência,

as quais tornam necessário o uso de bombas de alta pressão para a eluição da fase móvel,

devido a sua baixa permeabilidade. Os componentes de um cromatógrafo líquido são: bomba,

coluna cromatográfica, detector e o registrador. É um método utilizado para separação de

espécies iônicas ou macromoléculas e compostos termolábeis. A fase móvel da CLAE deve

ser um solvente que respeite algumas características impostas por esse método analítico, ela

deve possuir alto grau de pureza e estar livre de oxigênio ou outros gases dissolvidos, sendo

filtradas e desgaseificadas antes do uso, pois as impurezas podem interferir na detecção do

analito por ultravioleta (UV). A fase móvel deve ser compatível com o detector empregado e,

também possuir polaridade adequada para permitir uma separação conveniente dos

componentes da amostra.

“A bomba deve proporcionar ao sistema vazão contínua sem pulsos com alta

reprodutibilidade, possibilitando a eluição da fase móvel a um fluxo adequado” (DEGANI et

al., 1998, p. 21).

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As válvulas de injeção usadas possuem uma alça de amostragem para a introdução

da amostra com uma seringa e duas posições, uma para o preenchimento da alça e
outra para sua liberação para a coluna. Existem alças de diversos volumes, sendo
utilizadas geralmente alças na faixa de 5-50 mL para injeções analíticas e 0,5- 2 mL
para preparativas (DEGANI et al., 1998, p.24)

A coluna cromatográfica é geralmente de aço inoxidável, com diâmetro interno de

cerca de 0,45 cm para separações analíticas e na faixa de 2,2 cm para preparativas. O

comprimento é variável, sendo comuns colunas analíticas de 10-25 cm e preparativas em

torno de 25-30 cm.

Quanto aos detectores, não existe um que apresente todas as propriedades para que
ele seja ideal para CLAE. Não são versáteis, ou universais, mas existem detectores
que apresentam ampla faixa de aplicações. A sensibilidade de um detector é
determinada a partir da relação entre o sinal produzido e a quantidade de amostra
que gera este sinal (PERES, 2002, p.229).

As separações em CLAE podem se dar por adsorção, partição ou ambos. O suporte

mais comumente utilizado é a sílica. O uso de fases estacionárias líquidas adsorvidas
a um suporte não tem grande aplicação devido à perda de fase estacionária, mas o
uso de suportes modificados, os quais foram desenvolvidos como conseqüência do
problema acima, possibilita a produção de uma imensa variedade de colunas com
diferentes propriedades e tipos de seletividade. As fases assim obtidas são chamadas
de quimicamente ligadas.
(DEGANI et al., 1998, p. 24)

Sob alguns aspectos, a cromatografia líquida de alta eficiência é mais versátil do

que a cromatografia com fase gasosa, pois ela não está limitada a amostras voláteis e

termicamente estáveis e porque a escolha das fases estacionárias e móveis é mais ampla.

3 CONCLUSÃO

A cromatografia é uma importante ferramenta analítica para a separação de

misturas, combinada com análises qualitativas e quantitativas das substâncias separadas. Os

principais métodos cromatográficos são: cromatografia em papel, cromatografia de camada

delgada, cromatografia gasosa e cromatografia líquida de alta eficiência. A seleção do tipo de

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cromatografia adequada depende do material a ser isolado e, freqüentemente, diversos

métodos cromatográficos podem ser usados seqüencialmente para que seja obtido um

composto na forma pura.

Logo pode se concluir que a cromatografia se tornou uma técnica versátil e de

grande aplicação.