Biochemical 

Indicators
FN 115‐Nutritional Assessment and 
Epidemiology
IRON STATUS
C. P. Fernandez 2

Stages of Iron Depletion and Biochemical 
Iron Deficiency  Tests Used to Identify Them
Stage Descriptive Term Biochemical Tests
“State in which there is insufficient  First Depleted iron  Serum ferritin level
iron to maintain the normal  stores
Second Iron deficiency  Transferrin saturation
physiological function of tissues  w/o anemia Erythrocyte 
such as the blood, brain, and  protoporphyrin
muscles.” Third Iron‐deficiency  Hemoglobin
anemia Mean corspuscular
volume (MCV)
C. P. Fernandez 3 C. P. Fernandez 4

Cont.
Serum Ferritin
„ Good indicator of body iron stores
„ Most specific test for iron 
deficiency
„ Useful in assessing total body iron 
load „ 2 major exceptions for use:  
„ 1 ug/L serum ferritin is equivalent to  1. significant or chronic 
i ifi t h i
8‐10 mg stored iron for an average‐ inflammatory conditions and
size adult 2. disease processes that cause 
tissue destruction
C. P. Fernandez 5 C. P. Fernandez 6

1
Cutoff values indicative of iron  Transferrin receptors
deficiency
Age (yr) Serum Ferritin (ug/L) „ Transferrin receptors on the surface of 
the erythrocyte precursor increase when 
1‐2 ‐ the supply of iron is inadequate for the 
3‐4 <10 production of hemoglobin
d i fh l bi
„ Cutoff value in defining elevated 
5‐10 <10
transferrin receptor level based on 
11‐14 <10 normal values for adults is >8.0ug/L
15‐74 <12
C. P. Fernandez 7 C. P. Fernandez 8

Erythrocyte protoporphyrin Cutoff values indicative of iron 
deficiency
„ Precursor of hemoglobin and  Age (yr) Erythrocyte Protoporphyrin 
becomes elevated when the iron  (umol/L RBC)
supply is insufficient
supply is insufficient 1‐2 >1.42
3‐4 >1.33
„ Can be used as a screening test in 
children and adults 5‐10 >1.24
11‐14 >1.24
15‐74 >1.24
C. P. Fernandez 9 C. P. Fernandez 10

Hemoglobin levels below which anemia may

Hemoglobin be considered to be present (WHO)
Age and Sex Normal Hb Level
„ Iron‐containing molecule found in 
(g/dL)
RBC capable of carrying oxygen Children: 6 mos – 6y 11.0
„ Index of blood
Index of blood’ss oxygen carrying 
oxygen carrying y – 14y
6.1y y 12.0
capacity (g hemoglobin/dL blood) Adult: Males 13.0
Females (non- 12.0
„ Most widely used screening test for  pregnant, non-lactating)
IDA Pregnant Women 11.0
Lactating Women 12.0
C. P. Fernandez 11 C. P. Fernandez 12

2
Epidemiological criteria for assessing severity  Mean Corpuscular Hemoglobin
and magnitude nutritional anemia in 
population groups (FAO/WHO, 1992)
„ MCH is the amount of hemoglobin in 
MAGNITUDE
Parameters High  Moderate Low RBC
Percent of population with Hb
Percent of population with Hb  „ Calculated by dividing Hg level by 
Calculated by dividing Hg level by
less than the above cut‐off  > 40 10‐39 1‐9 RBC count
points especially women and 
children „ Reference values ≈ 26‐34pg
Percent of population with Hb 
less than 7g/dL especially  > 10 1‐9 <1
women and children
C. P. Fernandez 13 C. P. Fernandez 14

Mean Corpuscular  Mean Corpuscular Volume

Hemoglobin Concentration „ Volume of average RBC

„ Average concentration of Hg in the  „ Calculated by dividing hematocrit 

average RBC value by RBC count
„ Normal range = 80‐100fL
Normal range 80 100fL
„ Calculated by dividing Hg value by 
„ Factors increasing MCV: Folate and 
Hematocrit value
B12 deficiency, chronic liver disease, 
„ Normal range = 320 ‐ 360g/L (32 ‐ alcoholism, cytotoxic chemotherapy
36dL)
C. P. Fernandez 15 C. P. Fernandez 16

Transferrin saturation Models Assessing Impaired Iron

Status
„ Reflects adequacy of iron  Model  Measurements Used
transport to tissue Ferritin Model Serum ferritin
Transferrin saturation
„ Serum transferrin
Serum transferrin of <16% is 
of <16% is Erythrocyte protoporphyrin
associated with iron deficiency Mean  MCV
corpuscular  Transferrin saturation
volume (MCV)  Erythrocyte protoporphyrin
model
C. P. Fernandez 17 C. P. Fernandez 18

3
Models Assessing Impaired Iron
Status
Model  Measurements Used
Four‐variable  MCV or serum ferritin
model Transferrin saturation
Erythrocyte protoporphyrin
Hemoglobin  Hemoglobin
percentile shift  Transferrin saturation IODINE STATUS
model Erythrocyte protoporphyrin
C. P. Fernandez 19 C. P. Fernandez 20

Biochemical Indicators Urinary Iodine
„ Good marker of previous day’s dietary 
„ Urinary Iodine
iodine intake
„ Thyroid Stimulating Hormone  „ Data can be used only for making a 

(TSH) population based estimate

population‐based estimate
„ Iodine concentration in early morning 
„ Thyroglobulin (Tg)
urine specimen provides adequate 
assessment of a population’s iodine 
status
C. P. Fernandez 21 C. P. Fernandez 22

Epidemiological criteria for assessing  Thyroid stimulating hormone (TSH)
severity of IDD based on median 
urinary iodine levels
Iodine levels 
Median value  Severity of IDD
(μg/l))
(μg
are low
< 20 Severe IDD
20‐49 Moderate IDD Pituitary gland 
50‐99  Mild IDD stimulates the 
release of TSH
> 100 No deficiency
C. P. Fernandez 23 C. P. Fernandez 24

4
TSH… Thyroglobulin (Tg)
„ Directly reflect the availability 
Insufficient 

°
and adequacy of thyroid  Enhanced  Release Tg
iodine intake  turnover  into the 
hormone 
hormone induces 
induces
of thyroid 
f h id serum
proliferation 
„ Best diagnostic for determining  of thyroid  cells
cells
hypothyroidism

C. P. Fernandez 25 C. P. Fernandez 26

Summary of IDD prevalence indicators and

Median Tg criteria for a significant public health problem
Severity of public health 
„ Different assays may have different  problem (prevalence)
normal ranges Indicator Target  Mild Moderate Severe
Population
„ Normal  (children and adults) 
Normal (children and adults) Median
Median  School age 50
School age  50‐99
99 20 49
20‐49 <20
urinary iodine  child
= 10ng/ml level (ug/L)
TSH >5mU/l  Neonates 3.0‐ 20.0‐ > 40.0%
whole blood 19.9% 39.9%
Median Tg  Children &  10.0‐ 20.0‐39.9 > 40.0
(ng/ml serum) Adults 19.9
C. P. Fernandez 27 C. P. Fernandez 28
WHO/NUT/94.6

Indicators for the assessment of 
Vitamin A status at the subclinical 
level
„ Serum retinol

„ Serum retinol‐binding protein (RBP)
lb d ( )
„ RBP/TTR molar ratio

VITAMIN A STATUS „ RAG hydrolysis test

C. P. Fernandez 29 C. P. Fernandez 30

5
 Serum Retinol Serum Retinol Level
„ Level is under homeostatic control
„ Reflects stores only when they are very 
high or very low 0.70μmol/l
„ Best used when frequency distribution can 
Best used when frequency distribution can
provide useful information…
• “low” value
… about the status of a population • Considered consistent with the
…about response to an intervention  presence of a subclinical deficiency
programme status
C. P. Fernandez 31 C. P. Fernandez 32

WHO biological indicators of subclinical  Serum retinol‐binding protein 
vitamin A deficiency in children 6‐71  (RBP)
months of age (McLaren and Frigg, 2001)
Prevalence below cut‐off to define „ Correlates closely with serum 
a public health problem and its 
l l fi
level of importance retinol
Indicator (cut‐ Mild Moderate Severe „ Measured using fluorometer
off)
Serum retinol > 2‐<10% > 10‐<20% > 20%
(<0.70μmol/l)
C. P. Fernandez 33 C. P. Fernandez 34

RBP/TTR (transthyretin)  RAG (retinoyl β‐glucuronide) 

molar ratio hydrolysis test
„ Introduced to assess vitamin A status in  „ RAG is a naturally occurring 
the presence of inflammation metabolite of Vitamin A
„ Low molar ratio of RBP/TTR can  „ In a study, RAG orally administered 
distinguish VAD in the presence of  to rats with VAD retinoic acid 
infection  appears in the plasma in high 
concentrations
C. P. Fernandez 35 C. P. Fernandez 36

6
Assessment of Body Reserves Indirect assessment of liver 
„ Indirect assessment of liver stores stores…
„ Relative dose response (RDR) apo‐RBP accumulates in 
„ Modified relative does response 
the liver when retinol  is in 
short supply
short supply
(MRDR)
„ Serum 30‐day dose response
Once retinol is available 
„ Deuterated‐retinol‐dilution  RBP is released into the 
technique circulation
C. P. Fernandez 37 C. P. Fernandez 38

Relative Dose Response • Fasting serum retinol is measured 

(A0)
„ “When stores of retinol are high, 
1 • 450‐1000mg retinyl ester is given 
plasma retinol concentration is little  orally
affected by oral administration of  • 5 hours after dosing, serum 
Vitamin A But when reserves are
Vitamin A.  But when reserves are  2 retinol is measured (A5)
retinol is measured (A5)
low, the plasma retinol concentration 
increases markedly, reaching a peak 
•RDR = (A5‐A0) x100/A5
5h after oral dose.” 3

C. P. Fernandez 39 C. P. Fernandez 40

Limitations of RDR WHO biological indicators of subclinical 

vitamin A deficiency in children 6‐71 
„ 5 hours waiting period
months of age (McLaren and Frigg, 2001)
Prevalence below cut‐off to define
„ Need to draw 2 blood samples a public health problem and its 
l l fi
level of importance
Indicator  Mild Moderate Severe
(cut‐off)
RDR (>20%) <20% > 20‐<30% > 30%

C. P. Fernandez 41 C. P. Fernandez 42

7
Modified Relative Dose Cont.

Response (MRDR)
2
„ Uses a metabolite of vitamin A, 3,4‐ • Oral  • MRDR = 
• Blood 
didehydroretinyl acetate  dose of  test  (4‐6  SDR/SR
(dehyroretinol)
(d h i l) DR h
hours 
1 after  3
„ Dehydroretinol binds to RBP and  dose)
appears in serum after test dose is 
liver reserves of vitamin A are low
C. P. Fernandez 43 C. P. Fernandez 44

Modified Relative Dose WHO biological indicators of subclinical 

Response vitamin A deficiency in children 6‐71 
months of age (McLaren and Frigg, 2001)
Dehydroretinol:retinol Prevalence below cut‐off to define
a public health problem and its 
>0.06 – marginal or poor l l fi
level of importance
vitamin A status Indicator  Mild Moderate Severe
(cut‐off)
<0.03 – adequate vitamin A
MRDR  <20% > 20‐<30% > 30%
status
(ratio > 0.06)
C. P. Fernandez 45 C. P. Fernandez 46

Serum 30‐day dose response  WHO biological indicators of subclinical 
(+S30DR) vitamin A deficiency in children 6‐71 
months of age (McLaren and Frigg, 2001)
„ Similar to RDR but… Prevalence below cut‐off to define
… second blood sample taken 30‐45 
p a public health problem and its 
l l fi
level of importance
days after the first
Indicator  Mild Moderate Severe
„ Used at the population level and in  (cut‐off)
monitoring the effectiveness of  +S30DR  <20% > 20‐<30% > 30%
interventions (ratio > 20%)
C. P. Fernandez 47 C. P. Fernandez 48

8
Deuterated‐retinol‐dilution  Breast milk Vitamin A 
technique concentration
„ Uses stable isotope of hydrogen – „ Proposed to be used as an indicator 
deuterium of vitamin A status of a communityy
„ Used increasingly in research „ Concentration of vitamin A in the 
„ Extent of dilution of the labeled tracer  breast milk of undernourished 
relates to the amount of endogenous  mothers is low
reserves 
C. P. Fernandez 49 C. P. Fernandez 50

Average Breast milk  WHO biological indicators of subclinical 
vitamin A deficiency in children 6‐71 months 
concentrations of age (McLaren and Frigg, 2001)
Prevalence below cut‐off to define a 
public health problem and its level of 
Vitamin A‐ sufficient  Vitamin A‐deficient  importance
populations population Indicator  Mild Moderate Severe
1.75‐2.45μmol/L <1.4μmol/L (cut‐off)
Breast milk  <10% > 10‐<25% > 25%
retinol (<
1.05μmol/L or 
<8μg/gmilk fat)
C. P. Fernandez 51 C. P. Fernandez 52

Protein 
„ Principal compound of body 
structure and function
„ Not stored in a non‐functional form
Not stored in a non functional form
„ Gain or loss of protein represents 
PROTEIN STATUS equivalent gain or loss of function

C. P. Fernandez 53 C. P. Fernandez 54

9
 Biochemical assessment of  Creatinine excretion and 
protein status: two compartment  Creatinine‐height index
model
„ 24‐H urinary creatinine – used for 
„ Somatic and visceral protein estimating body muscle mass 
„ Somatic protein – skeletal muscles „ When compared with a standard 
„ Visceral protein – organs,  based on stature, it can be used to 
erythrocytes, granulocytes and  estimate lean body mass
lymphocytes
C. P. Fernandez 55 C. P. Fernandez 56

Nitrogen Balance Serum Proteins
„ Rate of protein synthesis or anabolism = 
„ Based on the assumption that 
Rate of protein degradation or 
catabolism decreases in serum concentrations 
are due to decreased in liver 
„ Positive Nitrogen Balance –
Positive Nitrogen Balance nitrogen 
nitrogen
intake exceeds nitrogen loss production
„ Negative Nitrogen Balance – nitrogen  „ A consequence of limited supply of 

losses exceed nitrogen intake amino acids

C. P. Fernandez 57 C. P. Fernandez 58

Serum  Normal  Half‐life Function

Serum Proteins Used in Nutritional  Protein Value 
Assessment Mean (+
SD or 
Serum  Normal  Half‐life Function
Range)
Protein Value 
Transferrin 2.3 (2.6‐ 8‐9 days Binds iron in 
Mean (+
( SD 
4 3)
4.3) plasma and 
plasma and
or Range)
transports to 
Albumin 45 (35‐50) 12‐20  Maintain  bone marrow
days plasma oncotic
pressure;  Prealbumin 0.30 (0.2‐ 2‐3 days Binds T3; carrier 
carrier for small  0.4) for retinol‐
molecules binding protein
C. P. Fernandez 59 C. P. Fernandez 60

10
 Serum  Normal  Half‐life Function
Serum  Normal  Half‐life Function Protein Value 
Protein Value  Mean (+
Mean (+ SD or 
SD or  Range)
Range) Insulin‐like  0.83IU/mL 2‐6  One of a family 
Retinol‐ 0.372 + 12  Transports  gro th
growth  (0 55 1 4) hours
(0.55‐1.4) h of ins lin like
of insulin‐like 
binding  0.0073 hours vitamin A in  factor‐1  peptides that 
protein plasma; binds  (IGF‐1) have anabolic 
noncovalently actions on fat, 
to prealbumin muscle, 
cartilage, and 
C. P. Fernandez 61 cultured cells
C. P. Fernandez 62

Serum  Normal  Half‐life Function

Protein Value 
Mean (+
SD or 
Range)
Fibronectin Plasma:  4‐24  A glycoprotein 
2 92+0 2
2.92+0.2 h
hours fo nd in man
found in many 
Serum:  tissues; a 
1.82+0.16 soluble form 
appears in 
blood; involved 
in wound 
C. P. Fernandez healing 63

11