INSTITUTO NACIONAL DE CIENC IAS

AGRICOLAS
DEPARTAMENTO DE AGROQUIMICA Y NUTRICION DE LAS PLANTAS

Informe Científico Final.

Factibilidad biológica de la micorrización

"in vitro" de Papa, Solanum tuberosum,

J’ del Proyecto: Félix Fernández Martín

La Habana, 2003

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1. Introducción

El cultivo de la papa, constituye uno de los de mayor consumo a nivel

mundial, formando parte de la dieta de más de un billón de personas. Se
cultiva a gran escala en más de 130 países (Struik y Wiersema, 1999) y
los modos de propagación varían en función de los intereses de los
productores, siendo la micropropagación una de las técnicas más
empleadas con estos fines. Por lo general, la aplicación de esta última
tiene aún determinados problemas que limitan su uso generalizado y no
garantizan totalmente las condiciones para el posterior desarrollo de las
plántulas derivadas en ambientes naturales.
En la última década algunos investigadores han reportado los hongos
micorrizógenos arbusculares (HMA) que forman asociación natural con
las plantas y que están, obviamente ausentes en los cultivos axénicos,
como una posible solución para mejorar la adaptación de las plántulas
producidas in vitro (Herman, 1996; Bethlenfalvay y col., 1997; Jackson
y col., 1997 y Nowak, 1998). Estos han incrementado el vigor y la
supervivencia de una gran variedad de cultivos como: fresa, banano,
nuez, aguacate, plátano, piña, uva, frambuesa, café, boniato, agave,
etc.
Estos micetos juegan un importantísimo papel en la nutrición de los
cultivos y contribuyen a la supervivencia y crecimiento de las plantas al
reducir el estrés asociado con la nutrición, las relaciones con el agua, la
estructura del suelo, el pH, las sales minerales, los metales tóxicos y los
patógenos (Vosatka y col., 1999 y Rai, 2001).
No obstante, en algunos casos, los efectos beneficiosos sobre el
crecimiento solo son observados después que las plantas in vitro están
totalmente aclimatadas. Según Hernández - Sebastia y col. (1999) y Rai
(2001) los efectos varían con las especies de plantas y los
microorganismos utilizados.
Por otra parte, autores como Wang y col. (1993) aseguran que el
crecimiento y la supervivencia podrían incrementarse durante la
aclimatización si los inoculantes fueran introducidos durante el estadio
de enraizamiento in vitro. sin embargo, existen serias dificultades
relacionadas con el establecimiento de la simbiosis en esta fase debido,
primeramente, a los contaminantes que habitan las paredes de los
propágulos micorrízicos, al comportamiento del hospedero, el tipo de
propágulo micorrízico y por último a la naturaleza obligada de este
endófito. (Fortín y col., 2002)
Elmeskaoui y col. (1995) desarrollaron un método de cultivo in vitro que
permitió que las plantas fueran colonizadas con micelio secundario del
hongo, o sea el micelio formado en las raíces previamente colonizadas
por esporas germinadas.

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Existen, no obstante, algunos estudios que reportan a los HMA como
inoculantes en cultivos monoaxénicos a partir de clamidosporas
germinadas con marcados efectos sobre el crecimiento y desarrollo, la
producción de embriones y el estado fisiológico de diferentes especies de
plantas (Fernández y col., 2002 y Bressan, 2002), modificando las
condiciones de cultivo y combinando medios con sustratos para
incrementar su similitud con los sistemas naturales.
En general la implantación de un sistema de micorrización in vitro,
resulta complejo, pues debemos no solo tratar de crecer la plántula, sino
también propiciar que haya un correcto crecimiento del simbionte y el
establecimiento de la asociación micorrízica (hongo micorrízico
arbuscular), por lo tanto, una de las condiciones fundamentales para
que se produzca esta interacción es a partir de una fuente de inoculante
potente y libre de microorganismo no deseados para lograr con éxito
este proceso.
Por otra parte, debemos considerar que una vez implantada la simbiosis,
resulta necesario el desarrollo de un marcador que permita la detección
segura del simbionte en las condiciones naturales, una vez liberada la
vitroplantula micorrizada en condiciones de campo. En este sentido se
debe contar con una metodología adecuada para la localización de las
cepas microbianas en cualquier condición en que se emplee.
Tomando en consideración la importancia de los aspectos antes
tratados, este trabajo persigue el siguiente objetivo:
Evaluar la factibilidad de la inoculación micorrízica durante los estadios
in vitro y post in vitro del proceso de micropropagación del cultivo de
Solanum tuberosun L. var. Alfa.

Para dar cumplimiento al objetivo propuesto se plantearon las siguientes

tareas:

I. Producción y aislamiento de esporas de hongos micorrizógenos

arbusculares (Glomus clarum y Glomus fasciculatum).
II. Evaluación de diferentes metodologías de desinfección de esporas
para ser empleadas en experimentos posteriores de micorrización
"in vitro".
III. Micorrización "in vitro" de las plántulas.
a. Estudio de selección del medio de cultivo adecuado.
b. Estudio de momento de extracción de plantas micorrizadas.
IV. Definición de factores limitantes del proceso de micorrización "in
vitro".
V. Estudios comparativos entre las variantes comerciales y la
metodología propuesta en condiciones semicontroladas.

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2. Antecedentes.
2. Los Hongos Micorrizógenos Arbusculares (HMA)
Micorriza, una de las maravillas naturales más extraordinaria y
asombrosa; simplemente la sorprendente asociación que se establece
entre ciertos hongos del suelo y las raíces de la mayoría de las plantas,
en la cual se crea una unión con dependencia fisiológica íntima y
recíproca, con funciones muy estrechas entre ambos simbiontes.
La historia de las micorrizas se remonta a unos 400 millones de años,
específicamente a los inicios del período Devónico. Las investigaciones
filogenéticas y moleculares revelan que los hongos más primitivos que
formaban estas asociaciones divergieron de un taxón cercano no
micorrízico aproximadamente al mismo tiempo en que surgieron las
plantas terrestres, 462-353 millones de años atrás (Simon y col., 1993 y
Remy y col., 1994); por lo tanto, es realmente posible que la
colonización de la tierra por las plantas y la evolución de toda la flora
terrestre haya sido en simbiosis con los hongos micorrizógenos, quienes
coevolucionaron hasta lo que son hoy en día (Taylor y col., 1995).
El término Micorriza fue propuesto por el botánico Albert Bernard Frank
(1881), quien lo formó a partir del vocablo griego “myco”, que significa
hongo y del latín “rhiza”, que quiere decir raíz.
Los hongos que forman estas asociaciones son los llamados
Micorrizógenos y se conocen desde el siglo pasado, pero a pesar de su
interés ecológico no se les prestó atención sino hasta los últimos 40
años.
Las especulaciones de Frank sobre el posible papel de las asociaciones
micorrízicas en la nutrición y el crecimiento de las plantas fueron
refutadas por los científicos de la época, y solo hasta el año 1894 pudo
demostrar que la colonización del hongo en las raíces producía micelio
abundante en la rizosfera, y que esto ayudaba a la absorción de
nutrientes y agua del suelo.
Según Siqueira y Franco (1988) este fenómeno es de ocurrencia
generalizada pudiéndose afirmar que las plantas no tienen raíces, sino
micorrizas y que la micorriza es la regla y no la excepción.
Tradicionalmente las Micorrizas se han agrupado en: Ectomicorrizas,
Ectendomicorrizas y Endomicorrizas. Las primeras se caracterizan por la
penetración intercelular del micelio fúngico en la epidermis de la raíz y
la formación de la “Red de Harting” y el manto que se desarrolla
alrededor de las raíces colonizadas.
En cambio, en las Endomicorrizas las hifas del hongo se propagan a
través de las raíces y penetran las células corticales sin llegar a
colonizar el endodermo ni producir modificaciones morfológicas
evidentes en las plantas hospederas. Este grupo es el más difundido en
el planeta y está dividido en varios subtipos, de los cuales el más
representativo e importante es el Arbuscular por ser el de mayor

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 distribución, tanto geográfica como florísticamente (Ferrer y Herrera,
1988).
Se encuentra ampliamente distribuido desde los trópicos hasta el ártico,
y se han encontrado en Briophytas, Pteridophytas, Angiospermas y
Gimnospermas, colonizando más del 95% de las especies vegetales de
interés (Azcón - Aguilar y col., 1991 y Smith y Read, 1997). En las
zonas templadas son frecuentes tanto las Micorrizas ectótrofas como las
Arbusculares, mientras que en los trópicos predominan las de este
último grupo (Herrera y col., 1988).
Producto de tal coevolución existen plantas que necesitan en mayor o
menor grado de esta asociación para captar nutrientes y crecer
adecuadamente. Esta dependencia es más marcada en las del tipo
arbuscular pues los hongos que la forman no son capaces de completar
su ciclo de vida en ausencia de la planta hospedera, por lo que son
considerados simbiontes obligados (Siqueira y Franco, 1988).
Las Endomicorrizas Arbusculares pertenecen a la Clase Zigomicetes y al
Orden Glomales (Fig. 1), el cual está compuesto por 5 familias que
conforman los siguientes géneros: Glomus, Paraglomus, Archaeospora,
Sclerocystis, Scutellospora, Entrophospora, Gigaspora y Acaulospora
(Morton y Redecker, 2001).

Géneros:
Acaulospora Entrophospora Géneros:
Géneros: Scutellospora Gigaspora
Glomus Sclerocystis
Familia: Acaulosporaceae

Familia: Glomaceae Familia: Gigasporaceae

Familia: Archaeosporaceae
Género: Archaeospora
Familia: Paraglomaceae
Género: Paraglomus

Suborden Suborden
Glomineae Gigasporineae
Orden
Glomales

Fig 1. Clasificación actual de los hongos que forman la simbiosis micorrízica arbuscular (
Tomado de Morton y Redecker, 2001.

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2.1. Establecimiento simbiótico
Existen diferentes grados de dependencia entre las especies de plantas y
los hongos micorrizógenos que intervienen en la asociación, de los cuales
va a depender la intensidad de su desarrollo.
Como en otros sistemas biotróficos la penetración de las células del
hospedero ocurre sin dañar su integridad y sin provocar respuestas
restrictivas por parte de la planta, ocurriendo a través de la invaginación
de las paredes del plasmalema, mediante procesos mecánicos y
enzimáticos bien localizados y controlados, lo cual evidencia una
integración perfecta (alta compatibilidad) entre estos dos organismos
(Siqueira y Franco, 1988).
Bonfante y Perotto (1992) sugieren tres fases o estadios del
establecimiento simbiótico: germinación de las esporas y crecimiento
hifal, estimulación del crecimiento hifal e inicio del proceso de
colonización y desarrollo fúngico intracelular con formación de
arbúsculos.
La mayoría de las especies forman esporas en el suelo capaces de
germinar en ausencia de señales derivadas del hospedero (Giovannetti,
2000). Estas esporas germinan y crecen en respuesta a diferentes
condiciones ambientales y edáficas, pero son incapaces de extender su
micelio y completar el ciclo de vida sin establecer una relación funcional
con una planta hospedera. La clave evolutiva que despierta todos los
procesos desde la germinación hasta la formación de la red de hifas se
encuentra en el organismo del hongo, involucrando una secuencia de
eventos morfogenéticos representados por la germinación de la espora y
el crecimiento micelial, el patrón diferencial de ramificación de las hifas
en presencia de las raíces hospederas, la formación de apresorios, la
colonización radical, el desarrollo de los arbúsculos, el crecimiento del
micelio extrarradical y la formación de esporas (Fig. 2).
Evidentemente, la germinación de las esporas de estos hongos no está
regulada por su hospedero, a diferencia de lo que sucede con muchos
hongos biotrófos patogénicos, lo cual podría considerarse una fuerte
desventaja; sin embargo, los hongos micorrizógenos han sobrevivido y
evolucionado por más de 400 millones de años, evidencias fósiles y
datos de secuencias de DNA han mostrado su naturaleza ancestral
(Phipps y Tayor, 1996 y Remy y col., 1994). Esta persistencia indica que
los mismos han desarrollado estrategias eficientes que le han permitido
la sobrevivencia de sus individuos y poblaciones (Logi y col., 1998).

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 Germinación y crecimiento
presimbiótico

Espora en
reposo Reconocimiento del
hospedero y formación de
estructuras de
colonización

Producción de Colonización intrarradical

esporas en el del hospedero y
suelo crecimiento extrarradical

Figura 2. Diagrama representativo del ciclo de vida de los HMA durante el

establecimiento de una simbiosis funcional (Giovannetti, 2000).

2.2 Germinación de esporas

Este, es uno de los procesos más importantes durante el ciclo de vida de
los HMA, del cual
va a depender, en gran medida, el éxito del establecimiento de la
simbiosis (Rai, 2001).
Estos hongos presentan dos tipos de esporas en correspondencia con el
género al que pertenecen, ambas de naturaleza asexual (Siqueira y col.,
1985). Las esporas producidas por Gigaspora, Scutellospora,
Acaulospora y Entrophospora son llamadas Azygosporas y las de
Paraglomus, Archaeospora, Glomus y Sclerocystis son Clamidosporas.
Las esporas de Glomales germinan de modos diferentes dependiendo del
género en cuestión. Generalmente, en Clamidosporas de Glomus se
reporta un recrecimiento hifal en el extremo del esporóforo (Mosse,
1959 y Warcup, 1985). Otras, como las de Glomus viscosum, germinan
después de la formación de una estructura parecida a un balón inflado
que se origina en el extremo de la hifa suspendida (Walker y col.,
1995); aunque ocasionalmente estas esporas pueden germinar a través
de sus paredes (Tommerup y Kidby, 1980).
En contraste, los tubos germinativos de las especies de Gigaspora,
Scutellospora y Acaulospora emergen directamente a través de las
paredes de las esporas (Siquiera y col., 1982). La germinación de
especies de Scutellospora ocurre después del desarrollo de un “escudo
de germinación” dentro de las paredes internas de la espora (Walker y
Sanders, 1986).

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La germinación múltiple puede ser considerada una estrategia adicional
de las esporas de HMA para incrementar la probabilidad de una
colonización exitosa.
El inicio en la germinación de las esporas es marcado por un incremento
en la actividad y redistribución de su citoplasma (Fig.3). Además, se
suceden movimientos citoplasmáticos que originan acumulación de
material cerca del esporóforo. Paralelamente, comienza a estrecharse la
pared interna de la espora y se forma el tubo germinativo inicial, el cual,
al parecer, digiere las paredes intermedias.

Figura 3. Representación diagramática de los procesos de germinación de una

azigospora de la especie de HMA Gigaspora margarita. (Siqueira y col. ,
1985)

Seguidamente ocurre una intrusión del citoplasma en la zona de

germinación. La pared del tubo germinativo se continúa con la capa más
interna de la pared de la espora y su crecimiento es producto de la
síntesis de Novo y la deposición de nuevo material en la pared. Según
Siqueira y col. (1985), la emergencia del tubo germinativo es el
resultado, aparentemente, de una presión física.
2.3. Funcionalidad de los HMA.
La penetración y el establecimiento del hongo en las raíces promueve
modificaciones en la fisiología, bioquímica y nutrición de la planta,
ejerciendo un gran efecto sobre su comportamiento.
Las modificaciones observadas han sido las siguientes: aumento del
núcleo, de la masa citoplasmática y del número de varios organelos,
incrementos en el grado de vacuolación de las células corticales, en la
cantidad y diferenciación de tejidos vasculares, aumentos de la tasa
fotosintética, de la síntesis de proteína, clorofila, sustancias del
crecimiento y metabolitos secundarios, aumentos en la actividad de
varias enzimas y favorecimiento de la absorción, translocación y
utilización de nutrientes minerales y agua (Siqueira y Franco, 1988).
Estas modificaciones son de gran importancia para entender las

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respuestas de las plantas a la micorrización y para el control del
desarrollo del hongo en las raíces.
La naturaleza y magnitud de estas alteraciones son difíciles de evaluar
pues dependen de la relación de compatibilidad entre los componentes
del sistema (hongo - suelo - planta).
El incremento en los niveles de absorción de fósforo por parte de la
planta ha sido el efecto nutricional más estudiado debido a que limita el
crecimiento vegetal en la mayoría de los suelos (Vestberg y Estaun,
1994). Su accesibilidad a las raíces absorbentes es un problema, pues
aunque esté presente en grandes cantidades, su difusión es reducida,
además puede interactuar con coloides, o participar en reacciones de
precipitación con aluminio, hierro y calcio, todo lo cual contribuye al
desarrollo de zonas de agotamiento alrededor de las raíces absorbentes
(Trimble y Knowles,1995).
Sin embargo, en los últimos años ha quedado claro el positivo rol de las
micorrizas en la absorción del resto de los elementos esenciales (macro
y micronutrientes) y no solo sobre los que se mueven en el suelo por
mecanismos de difusión (George, 2000 y Rivera y col., 2001). Este
incremento en la eficiencia en la absorción de los nutrientes por las
plantas micorrizadas, conlleva a disminuciones en las necesidades de
fertilizantes orgánicos o minerales en comparación con las necesidades
de las plantas no micorrizadas, para mantener iguales o inclusive
mayores niveles de rendimiento.
La funcionalidad de los HMA ha sido discutida por muchos investigadores
durante la última década (Gianinazzi y col., 1990; Arias y Cargeeg,
1992; Varma y Schuepp, 1995; Lovato y col., 1996 y Hindav y col.,
1998), quienes plantean que pueden contribuir al crecimiento y a la
supervivencia de las plantas por reducción del estrés asociado no solo
con la nutrición, sino también con la toma de agua, la aireación, la
estructura del suelo, el pH, las sales, los metales tóxicos y los patógenos
(Sylvia y Williams, 1992).
Estos hongos modifican las relaciones con el agua de las plantas nativas
(Nelsen, 1987). La conductancia estomática, la tasa de transpiración y
el potencial de agua de la hoja son frecuentemente mayores en las
plantas micorrizadas bajo condiciones de estrés por sequía
(Subramanian y col., 1995), permitiendo a las plantas colonizadas por el
hongo mantener mayores valores de tasa fotosintética y contenido de
agua que las plantas no micorrizadas. No obstante, los mecanismos
involucrados en estas modificaciones permanecen aún bajo
investigación.
Así mismo, los hongos micorrizógenos incrementan la tolerancia de las
plantas a los contaminantes del suelo como metales pesados. Según
Gervais y col. (2000) pueden aliviar la toxicidad causada por aluminio,

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especialmente si fueron previamente aislados de suelos contaminados
(Dodd, 1998).
Lovato y col. (1996) también reportaron varias funciones de relevante
importancia vinculadas con la biorregulación, la bioprotección y la
biofertilización y aún en estudio, la micorrización de plantas
micropropagadas.

2.4. Inoculantes micorrízicos.

Para realizar el cultivo de los hongos Glomales se han propuesto

diversas metodologías, unas más complejas que otras, pero todas con
un denominador común: involucran una planta hospedera o explantes
de raicillas, ya que estos micetos se asocian con las plantas debido a su
condición de simbiontes obligados para cumplimentar su ciclo de vida
satisfactoriamente.
Lo que diferencia realmente una metodología de otra es el medio en el
cual se desarrolla esta simbiosis.
Las tecnologías más utilizadas son aquellas que involucran a la planta en
un medio o sustrato sólido, empleando materiales que van desde suelo,
turba, perlita, vermiculita, arena, arcilla, arcilla calcinada, varios
compostas vegetales y forestales y / o mezclas de algunos de ellos
(Morton et al., 1993).
También se han hecho crecer plantas en medios hidropónicos, poniendo
en contacto a las raicillas micorrízicas con una fina película de solución
nutritiva que fluye de manera continua y a velocidad constante,
aportando todos los requerimientos nutrimentales de la planta. Esta
metodología tiene como inconveniente que es preciso ser muy riguroso
en el control del pH de la solución, pues al no encontrarse en el suelo,
carece por lo tanto de la capacidad de estabilización química o buffer y
el mismo puede variar con la entrada al medio de los exudados de la
planta. Por otra parte, es necesario preinocular la planta con el hongo
deseado, previo al contacto con la solución nutritiva (Elmes et al; 1984
).
Otra importante metodología propuesta para la producción de inoculante
micorrízico, lo constituye sin duda el cultivo aeropónico, desarrollado por
Hung y Sylvia (1988), el cual se basa en el cultivo de plantas
preinfectadas en una cámara oscura, donde sus raicillas colonizadas con
el hongo deseado, son irrigadas temporalmente a través de un
dosificador de solución nutritiva, creciendo de forma acelerada de 12 a
15 semanas. Posteriormente, las raicillas y propágulos micorrízicos son
cosechados o removidos de la cámara, los segmentos radicales cortados
a 1 cm, y las esporas aisladas por tamizado, para su posterior uso.
Según Sylvia y Jarstfer (1992), se logra un material muy homogéneo y
libre de patógenos.

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La técnica más novedosa desde el punto de vista científico, resulta el
cultivo dual de raíces y hongos micorrizógenos (cultivo monoaxénico).
Estos trabajos iniciaron con el cultivo in vitro de micorrizas por parte de
Mosse y Hepper (1975), en raíces de tomate, pero no fueron muy
tomados en cuenta, hasta que Mugnier y Mosse, (1987) lograron la
producción in vitro usando raíces transformadas por el plásmido RitDNA
presente en las bacterias Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium
rhizogenes.
A partir de entonces se han desarrollado muchos protocolos para el
crecimiento in vitro, los cuales se realizan en tres fases, esterilización
superficial de esporas y raíces, incubación de placas durante 12
semanas y cosecha de inoculante micorrízico concentrado.
Este método resulta muy prometedor para la producción de inoculante
micorrízico arbuscular, sin embargo, este tipo de cultivo monoaxénico
no es tan sencillo pues debe tomarse en cuenta que cada especie de
hongo micorrizógeno y de hecho cada una de las simbiosis, constituyen
un sistema con diferentes requerimientos nutricionales, aún en órganos
individuales, como es el caso de la raíz.
Por otra parte, el hecho de que todavía no están bien establecidos los
niveles de atmósferas de CO2 que propician el intercambio gaseoso de la
simbiosis, las fuentes de nutrimentos, los requerimientos de cada hongo
que se pretenda cultivar, los microorganismos de naturaleza endófita
que intervienen en el proceso, etc., apoya la necesidad futura de
esfuerzos de investigación profunda en esta metodología tan
prometedora.
Actualmente, cuando se pretende potenciar la producción de inoculantes
micorrízicos arbusculares, el uso de sistemas que involucren sustratos
sólidos, suelos o la mezcla de este último con sustancias inertes,
presentan una superioridad clara en cuanto a la cantidad de especies y
géneros de Glomales que pueden ser cultivados (Fig. 17).
Además, otra de las ventajas de la producción de micorrizas en
sustratos sólidos y / o suelos, consiste en que se puede almacenar por
periodos largos de tiempo de hasta 5 años a temperaturas de 4 oC
(Morton, 1993).

2.5. Detección de Esporas de HMA.

Entre las distintas especies de HFMA, y aún entre cepas o ecotipos

pertenecientes a una misma especie, existen marcadas diferencias
funcionales, lo cual ha conllevado a que numerosos investigadores
hayan dedicado su esfuerzo a la caracterización de estos hongos. Para
ello se han empleado diversos métodos, constituyendo los primeros o
más clásicos aquellos basados en las características morfológicas de las

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esporas y del micelio fúngico, tales como forma, tamaño, color, número
y grosor de las paredes (Ruiz-Lozano y Azcón, 2000).
La clasificación hasta nivel de género de los hongos formadores de
micorrizas arbusculares no presenta dificultades, si se tiene en cuenta
que entre las diferentes familias existen marcadas diferencias
estructurales que se basan en los procesos de génesis de la espora y sus
conexiones hifales (Morton, 1999).
La labor taxonómica para la determinación a nivel de especie es una
tarea de una juiciosa consulta de claves taxonómicas, ya que esta
clasificación se basa, no sólo en los aspectos mencionados
anteriormente, sino en la característica subcelular de la pared de la
espora, que es la que define la ubicación del microorganismo hasta nivel
de especie, siendo ésta difícil de detectar debido a las pequeñas
diferencias existentes entre las especies de un mismo género (Morton,
1999).
Tomando en consideración las dificultades en la identificación de estos
hongos a partir de los métodos clásicos, en la actualidad se ha
incrementado el uso de técnicas más avanzadas que incluyen, tanto la
detección inmunoquímica, como indicadores bioquímicos que pueden
constituir alternativas más rápidas, sensibles y confiables (Sanders y
col., 1992; Simon, 1996).
La detección inmunoquímica, en general, se basa en la producción de
anticuerpos específicos (policlonales o monoclonales) frente a una
determinada especie, presuponiendo que ésta contenga grupos
antigénicos diferenciados (Hanh y col., 1999).
Un Ac reconoce solamente una parte restringida de un antígeno
(determinante antigénico). Un antígeno presenta una cantidad definida
de epítopos, algunos de los cuales están compartidos con otros
antígenos. Estos antígenos se denominan epítopos públicos o genéricos.
Existen otros que se encuentran en una sola entidad molecular y son
llamados antígenos específicos o privados (Hahn y col., 1999).
Los anticuerpos policlonales varían grandemente en su reconocimiento,
desde discriminar entre hongos no formadores de micorrizas
arbusculares y los formadores, hasta distinguir entre diferentes HFMA a
nivel de género y dentro de un mismo género pueden detectar hasta
nivel de especie (Hahn y col., 1999).
Los estudios basados en el uso de anticuerpos monoclonales muestran
un reconocimiento más específico de estos hongos a nivel de especie e
incluso se pueden discriminar organismos de una misma especie que
hayan sido aislados en diferentes ecosistemas, pero éstas son
alternativas de alto costo que requieren contar con infraestructura
especializada (Perotto y col., 1992).
Recurrir a la utilización de un anticuerpo policlonal o uno monoclonal
está en dependencia del interés de cada investigador, de las exigencias

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del trabajo y las condiciones materiales del laboratorio; no obstante,
cualquiera de las dos opciones representa una gran ayuda para
complementar el trabajo de clasificación que se realiza con las claves
taxonómicas (Perotto y col., 1992).
Los anticuerpos son utilizados para caracterizar superficies extra e
intracelular y para cuantificar constituyentes celulares de las esporas de
los HFMA. Por esto, se necesita información detallada sobre las
propiedades del (diálogo) hospedero-simbionte y sobre estudios
taxonómicos (Hahn y col., 1999).
Especialmente en el campo de las endomicorrizas arbusculares, se ha
comprobado que existen grandes diferencias en el comportamiento
ecológico y los efectos fisiológicos entre diferentes aislados, los cuales
son morfológicamente similares pero difieren en sus propiedades
inmunoquímicas (Wright y col., 1987).

2.5.1. Algunas características de las técnicas de

inmunodetección IFI y el ELISA.
En los años 40-50 del siglo pasado, Coons introdujo las técnicas basadas
en la conjugación de anticuerpos con fluorocromos para la detección de
la reacción antígeno- anticuerpo, lo que se tradujo en un aumento
importante de las posibilidades de aplicación de métodos con base
inmunológica para el diagnóstico.
La inmunofluorescencia (IF) es esencialmente un método inmunocito e
histoquímico de alta sensibilidad que, aplicado a los estudios
taxonómicos, ofrece gran versatilidad y niveles de detección en el orden
de los microgramos.
La fluorescencia es un fenómeno en el cual una luz de corta longitud de
onda, como la luz ultravioleta, excita ciertos colorantes conocidos como
fluorocromos, provocando que sus electrones más externos alcancen un
nivel de alta energía en forma de luz visible, de longitud de onda
caracterítica para los diferentes compuestos, que puede ser observada
como fluorescencia en microscopios equipados con sistemas de filtro
apropiados (Harlow y Lane, 1988).
El empleo de los ensayos inmunoenzimáticos en soporte sólido para la
detección de la reacción antígeno-anticuerpo ha crecido
vertiginosamente a partir del reporte de Engvall y Perlman (1971).
Los sistemas tipo ELISA resultan excelentes para el tamizaje de
anticuerpos, son métodos relativamente sencillos, de alta sensibilidad y
especificidad, con posibilidad de ser automatizados y pueden ser
realizados en laboratorios sin grandes recursos técnicos.
Dentro de los soportes sólidos más utilizados se encuentran la placas de
microtitulación de 96 pocillos, de cloruro de polivinilo (PVC) o
poliestireno (PE), aunque también se han empleado papel de
nitrocelulosa y perlas de poliestireno, entre otros. El empleo de uno u

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otro material puede estar en dependencia de la disponibilidad de
antígeno y de su capacidad particular de adsorción. Los fabricantes de
soportes y placas para ELISA ofertan varios productos, relativos
principalmente con la capacidad de adsorción de proteína que posee el
polímero en cuestión (Gavilondo, 1995).
2.6. Uso de las HMA en lo sistemas agrícolas.
La capacidad de los HMA de aumentar el crecimiento y la sobrevivencia
de las plantas ha despertado el interés de los científicos en el mundo
entero. Desde hace algunas décadas aumentan las publicaciones
científicas acerca del efecto beneficioso de la simbiosis sobre el
crecimiento y productividad de los cultivos (Harley y Smith, 1983;
Siqueira y Franco, 1988; Fernández, 1999 y Rivera y col. 2003.).
En la actualidad, el uso de estos inoculantes microbianos como
sustitutos de fertilizantes químicos y plaguicidas ha recibido especial
atención en el desarrollo de prácticas de producción agrícola sostenible
(O’ Gara, 1996).
Uno de los aspectos de más repercusión para el manejo de la simbiosis
lo constituye la poca especificidad cepa - cultivo, fenómeno que se
fundamenta sobre todo en el poco número de especies y cepas de
hongos endomicorrízicos que se asocian con una gran cantidad de
especies vegetales y que se expresa en que una especie adecuada o
“eficiente” para una condición edáfica dada, establecerá simbiosis
eficiente con una gran variedad de cultivos (Ruiz, 2001 y Rivera y col.,
2003). Precisamente esta baja especificidad simplifica en grado sumo el
manejo productivo de la simbiosis.
Indiscutiblemente, esto no significa que no exista en ocasiones algún
grado de especificidad o quizás de mayor preferencia entre ambos
simbiontes, pero su comportamiento va a estar condicionado en mayor
grado por las características físico, químicas y biológicas del sustrato
sobre el cual se desarrollen (Rai, 2001) y será dependiente de las
diferentes prácticas agronómicas que se lleven a cabo.
En correspondencia, la búsqueda de cepas eficientes también constituye
un factor importante a tener en cuenta para el manejo de la simbiosis
con fines productivos.
En los últimos años, en Cuba, se ha logrado encontrar una regularidad
en los efectos alcanzados con la inoculación de las especies de HMA
(Fernández, 1999; Sánchez, 2001 y Ruiz, 2001) reportándose una
importante especificidad suelo - cepa eficiente.
Sin embargo, una especie puede ser adecuada o “eficiente” para una
condición edáfica o un sustrato determinado y no ser efectiva, lo cual es
una consecuencia de las condiciones en que se establezca la simbiosis y
en lo fundamental, de la riqueza o disponibilidad de nutrientes del medio
(Dodd y Thompson, 1994 y Fernández, 1999).

14
En la actualidad se han utilizado satisfactoriamente estos hongos como
inoculantes en la mayoría de los sistemas de producción de plantas,
empleándose dos vías en lo fundamental: (1) la aplicación directa al
sustrato, válida para la producción de posturas, semilleros y adaptación
de vitroplantas y (2) el recubrimiento de las semillas, empleado en los
cultivos de siembra directa (Fernández, F. 2003).
2.7. La micorrización en los sistemas de producción de
vitroplantas.
2.7.1. Acerca del cultivo de tejidos
En la última década, los sistemas de producción de vitroplantas han sido
la herramienta más poderosa para la clonación y rápida multiplicación
de numerosas especies de plantas, fundamentalmente las que revisten
mayor importancia económica.
El número total de plantas producidas por la vía de cultivo de tejidos,
solo en Europa asciende a los 200 millones de unidades al año, de los
cuales alrededor de 180 millones se producen en laboratorios
comerciales (Lovato y col., 1996). Similares producciones se llevan a
cabo en el Este Asiático y en Norte América.
Dentro de sus múltiples aplicaciones se encuentran: la
micropropagación, el cultivo de meristemos, la embriogénesis somática,
la variación somaclonal, la selección in vitro y el cultivo de protoplastos
y la hibridación somática (Debergh y Zimmerman, 1991).
No obstante las exitosas aplicaciones de estas técnicas, persisten aún
numerosos problemas que limitan la distribución de su uso. (Elmeskaoui
y col., 1995)
Típicamente los explantes asépticos crecen en condiciones de baja
intensidad luminosa en pequeños potes o envases, sobre medios de
cultivo artificiales que contienen azúcares, sales minerales, vitaminas y
reguladores del crecimiento en concentraciones que exceden los niveles
encontrados en los ambientes naturales (Leifert y col, 1995 y Nowak,
1998).
Según Mc Clelland y Smith (1990); Jeong y col. (1995) y Matthijs y col.
(1995), las condiciones de cultivo in vitro no permiten un adecuado
intercambio de gases, lo cual produce alteraciones en el desarrollo de
los explantes, así como también, modulación o represión de algunas vías
metabólicas. Además se observa un mal funcionamiento estomático
(Frommel y col., 1991 y Majada y col., 1995) y cutículas que muestran
un pobre desarrollo y reducidos contenidos de ácidos grasos (Preece y
Sutter, 1991).
En los últimos años han tomado auge los estudios referidos a la escasez
de aireación reportada en los envases de cultivo. Fujiwara y col. (1987)
aseguran que la concentración de CO2 en el interior de los potes

15
disminuye drásticamente una o dos horas después que comienza el
fotoperiodo y se mantiene baja mientras dura este.
Estudios recientes han demostrado que las plantas que son producidas
in vitro pueden expresar su capacidad fotosintética si se cultivan sobre
un medio libre de azúcar y en presencia de CO2 atmosférico como
principal fuente de carbono (Desjardins, 1995a y Nguyen y col., 2001).
La transferencia de las plantas de condiciones in vitro a ex vitro es uno
de los momentos más críticos del proceso de micropropagación y la
causa de los altos costos de producción. La alta mortalidad es observada
frecuentemente durante el transplante debido, entre otros factores, a
una reducida capacidad fotosintética (Cournac y col., 1991; 1992;
Desjardins, 1995b; Preece y Sutter, 1991 y Van Huylenbroeck y
Debergh, 1996).
2.7.2. Las fases in vitro y post in vitro
La propagación de plantas a través de las técnicas de cultivo de tejidos
consta de dos fases o estadios muy diferentes con requerimientos que
varían en función de la especie vegetal de la cual se trate.
Tanto la fase in vitro como la ex vitro juegan un importante papel en el
proceso. La manipulación exitosa de los medios de cultivo empleados in
vitro, así como de los sustratos para la adaptación, estarán en
correspondencia con las especies de plantas y sus requerimientos
nutricionales.
Las plantas que crecen in vitro lo hacen en condiciones que,
paradójicamente, le proporcionan cierto estrés fisiológico debido a la
fuente de carbono que les es suministrada (en forma de azúcares), lo
cual reduce grandemente su necesidad de fotosintetizar. A su vez, estas
condiciones asépticas reducen también el estrés relacionado con la
presencia de organismos patogénicos (Preece y Sutter, 1991). La
combinación de estas situaciones constituye un gran inconveniente para
la supervivencia de estas plantas tanto en casas de cultivo como en
campo.
La fase ex vitro, en particular, constituye la etapa más estresante del
proceso. Las condiciones de las casas de cultivo no favorecen una
sencilla adaptación de las vitroplantas; en estos ambientes las
humedades relativas son sustancialmente más bajas y los niveles de
iluminación más altos que en los envases dedicados el cultivo in vitro de
las mismas.
Según Preece y Sutter (1991) algunas características anatómicas,
morfológicas y fisiológicas de las plantas se encuentran modificadas en
esta etapa, teniendo en cuenta la fragilidad que presentan cuando son
extraídas de los envases de cultivo. Estos autores relacionan una serie
de aspectos a tener en cuenta al analizar las posibles modificaciones
como los vinculados con la pérdida de agua (cutícula, estomas e
hidátodos), así como con las hojas, los tallos, la morfología radical y el

16
proceso fotosintético. En consecuencia, se reporta que durante esta fase
de aclimatación las plántulas tienen muy baja tasa fotosintética, lo cual
dificulta la transformación desde su condición heterotrófica hacia una
autotrófica. (Davies y col., 2000)
2.8. Generalidades sobre el cultivo de la papa
La papa (Solanum tuberosum L.) es uno de los cultivos no cereales más
importantes para la humanidad (Torres, 1991), produciendo más
calorías, proteínas, vitaminas y sales minerales por unidad de superficie
y de tiempo que los principales cereales y que otras plantas con
tubérculos y raíces comestibles; además de su gran versatilidad por ser
integrada dentro de los sistemas de cultivo (CIP, 1998).
Es cultivada en todo el mundo exceptuando las tierras bajas de los
trópicos. Su centro de origen es la región Andina de Suramérica donde
ha sido cultivada desde el año 8 000 antes de Cristo. Fue llevada a
Europa por los años 1 500, pero lamentablemente solo muy pocas
variedades fueron seleccionadas, dejando una estrecha base genética en
las especies cultivadas.
En las zonas templadas, actualmente se concentra más del 90% de la
producción mundial (Rojas, 1996) y muy poco en las regiones tropicales
húmedas debido a su propensión a ser infestada por numerosos
organismos patógenos y plagas, así como a la dificultad de conservación
de los tubérculos; sin embargo presenta una amplia capacidad de
adaptación a condiciones variables de clima y suelo, por lo que se planta
en más de 130 países, ocupando el 40% aproximadamente del área
cultivada a escala mundial. (Struik y Wiersema, 1999)
El desarrollo industrial de este cultivo se ha incrementado durante los
últimos 50 años, especialmente con respecto a la producción de semillas
y los sistemas de multiplicación. La producción de vitroplantas,
microtubérculos y minitubérculos se han convertido en tecnologías que
son fácilmente adaptables a las posibilidades y necesidades locales.
Existen numerosas formas de propagar este cultivo incluso ya sea bajo
condiciones asépticas (para rápida multiplicación, mejoramiento
genético, obtenerla libre de enfermedades o para almacenarlas por
largos períodos de tiempo) o bajo condiciones más o menos naturales
(casa de cultivo, campo) (Struik y Wiersema, 1999). De hecho la planta
de papa es extremadamente versátil y para su multiplicación pueden
emplearse tanto células individuales como tejidos, meristemos, brotes,
cortes de tallos, tubérculos, partes de tubérculos, semillas verdaderas
de las bayas, etc.
El cultivo de la papa en Cuba es uno de los renglones de mayor
importancia para la alimentación de la población. El área utilizada para
el cultivo es aproximadamente de 15 000 hectáreas (Estévez y col.,
2001).

17
En nuestro país la papa se cultiva en las zonas occidental y central y en
menor medida en la oriental, fundamentalmente en la época de seca
(noviembre – diciembre) cuando las temperaturas son más bajas.
2.9. Micorrización de plántulas micropropagadas.
En los sistemas de producción de plantas micropropagadas el sustrato
de crecimiento se encuentra enriquecido nutricionalmente y por otro
lado deficitario de microorganismos, como resultado, las plantas se
desarrollan frágiles y susceptibles a cualquier cambio o variación
ambiental al que se sometan (Dolcet- San Juan y col., 1996).
La transferencia de las plantas de condiciones in vitro a ex vitro es uno
de los factores mas críticos dentro de la micropropagación y una de las
causas de los altos costos de producción debido a las altas tasas de
mortalidad que frecuentemente se reportan (Elmeskaoui y col., 1995).
Con el objetivo de incrementar las tasas de crecimiento y sobrevivencia
de las plántulas en este estadio se han enfocado las investigaciones
hacia el control de las condiciones ambientales, como por ejemplo
provocando incrementos en la intensidad luminosa y/o en las
concentraciones de CO2 (Desjardins y col., 1990).
Otro intento ha sido el de variar las condiciones ambientales durante la
multiplicación o el estadio de enraizamiento de las vitroplantas,
incluyendo también incrementos en los niveles de iluminación y en las
concentraciones de CO2 en los tubos de cultivo, así como disminución de
la concentración de sacarosa en los medios (Desjardins y col., 1990 y
Hdider y Desjardins, 1994).
No obstante, en la actualidad numerosos investigadores aseguran que la
introducción de determinados inoculantes microbianos por la vía de la
micropropagación podría ser la solución a estos problemas (Dolcet-San
Juan y col., 1996; Lovato y col., 1996; Nowak, 1998 y Rai, 2001).
Aunque la micropropagación es una técnica establecida para la
producción de plantas de alta calidad, Nowak (1998) asegura que si las
condiciones de cultivo son bien ajustadas entonces pueden crearse
asociaciones artificiales con algún microorganismo en particular o con
grupos de ellos. Por otra parte, también plantea que estos individuos no
solo pueden actuar como inductores de resistencia al estrés, sino que
pueden ocupar micrositios en la rizosfera de las plantas hospederas
haciendo a estas inaccesibles al ataque de patógenos.
2.9.1 . Micorrización en condiciones ex vitro
En un intento por utilizar este potencial para perfeccionar el cultivo de
tejidos de plantas, algunos investigadores han procedido a la inoculación
de éstas durante el transplante a la fase adaptativa (Chávez y Ferrera -
Cerrato, 1990; Wang y col., 1993; Varma, 1994; Dolcet - San Juan y
col., 1996 y Davies y col., 2000).

18
Los estudios realizados en esta fase, por lo general, demuestran un
incremento importante en las variables de crecimiento y vigor, como
altura de las plantas, diámetro del tallo, número de hojas y área foliar
así como también en la tasa de sobrevivencia de las plántulas.
Dolcet - San Juan y col. (1996) realizaron la inoculación de plantas de
nuez micropropagadas y encontraron que de las plantas controles no
inoculadas solo sobrevivió el 20 %, mientras que del 60 al 80 % de las
plantas previamente inoculadas con Glomus mosseae y G. intraradices
sobrevivieron al transplante. Además reportaron cierta dependencia con
el genotipo en cuanto a la capacidad adaptativa de las variedades
estudiadas.
Similares resultados han sido reportados desde hace algunos años por
numerosos investigadores en una gran variedad de cultivos: Chávez y
Ferrera Cerrato (1987) encontraron incrementos en la masa vegetal
(343 %) y en la longitud del estolón (17 %) en plantas de fresa;
Guillemin y col. (1992) y Lovato y col. (1996) reportaron mayor área
foliar y altos niveles de infección y frecuencia de arbúsculos en
vitroplantas de piña y uva previamente inoculadas; así mismo, Vidal y
col. (1992) y Azcón-Aguilar y col. (1992) manifestaron incrementos en
los porcentajes de sobrevivencia en plantas de aguacate
micropropagadas; Declerck y col. (1994) y Noval y col. (1995 y 1997)
corroboraron los resultados anteriores al estudiar vitroplantas de piña y
banano, respectivamente.
Según Ponton y col. (1990) los beneficios de la inoculación dependían
del medio de crecimiento o sustrato empleado y del grado de
colonización radical (Wang y col., 1993) alcanzado durante el periodo.
Como en la mayoría de los casos la estimulación del crecimiento de las
plantas fue expresada solo al finalizar la fase de adaptación, Wang y col.
(1993) sugirieron el desarrollo de un sistema de cultivo en el cual los
hongos micorrizógenos fueran introducidos in vitro, durante el estadio
de enraizamiento, para asegurar la sobrevivencia de las plantas durante
esta importante fase.
2.9.2 Micorrización en condiciones In vitro
La utilización de inoculantes microbianos previos al transplante, en la
micropropagación es, para numerosos investigadores, el blanco principal
de atención para inducir la resistencia al estrés de las plantas
producidas in vitro (Elmeskaoui y col., 1995; Nowak y col., 1995; Balla
y col., 1997; Murphy y col., 1997 y Wilhelm y col., 1997).
Las respuestas de resistencia inducidas por estos inoculantes han sido
mayormente estudiadas en las plantas cultivadas in vivo, sin embargo,
tales respuestas para las producidas in vitro solo han sido reconocidas
recientemente (Herman, 1996) e identificadas como “Biotización”.
Según Nowak (1998), la biotización no es más que la respuesta
metabólica de las plantas que crecen in vitro a los inoculantes

19
microbianos, induciendo cambios en el desarrollo y la fisiología de las
plantas e incrementando la resistencia al estrés de los propágulos
derivados. El establecimiento de asociaciones simbióticas pudiera
también incluirse en esta categoría (Preininger y col., 1997).
Los beneficios que brinda el uso de inoculantes micorrízicos sobre las
plántulas en estadios in vitro han sido reportados por algunos autores
(Hooker y col., 1994; Elmeskaoui y col., 1995; Nowak, 1998; Hernández
- Sebastia y col., 1999 y Rai, 2001). En sentido general las plántulas
presentan mayor crecimiento y desarrollo del tallo y las raíces así como,
incrementos en el número de hojas y en el área foliar. Se ha
demostrado también que las plantas micorrizadas muestran variaciones
en el potencial osmótico con respecto a las no micorrizadas, lo cual es
reconocido por los autores como una ventaja realmente importante
desde el punto de vista de adaptación a las nuevas condiciones.
No obstante, el desarrollo y establecimiento de la simbiosis planta -
hongo micorrizógeno in vitro constituye, aún en la actualidad, un gran
problema. Primeramente por la alta posibilidad de contaminación del
inóculo micorrízico, en segundo lugar por el comportamiento del
hospedero in vitro y finalmente por la naturaleza obligada del endófito
(Rai, 2001).
2.10. Necesidad de esterilización para la germinación de los
propágulos
La desinfección superficial de los propágulos en general, usados como
inoculante, es un requisito de suma importancia para la exitosa
formación de la micorriza en condiciones in vitro (Bécard y Piché, 1992).
La descontaminación se requiere, tanto para evitar la proliferación de
contaminantes, como para asegurar que los microorganismos asociados
con las esporas de estos hongos, no influyen en los resultados
experimentales (Walley y Germida, 1996).
Desde comienzos de siglo ya se realizaban los primeros trabajos sobre
desinfección de propágulos micorrízicos, los cuales estaban
encaminados a descontaminar hifas de hongos micorrizógenos con el
objetivo de promover su recrecimiento en condiciones axénicas.
Los estudios de Jones (1924), Niell (1944) y Magrou (1946), aportaron
datos interesantes acerca de la temática y reportaron diferentes
tratamientos que efectivamente destruían los microorganismos no
deseados, pero que también eliminaban a los endófitos. No fue hasta
que aparecieron los antibióticos que Tolle (1958) consiguió obtener un
pequeño recrecimiento hifal bajo condiciones asépticas.
Lamentablemente esta metodología no fue adoptada por otros
investigadores, debido probablemente al descubrimiento de Mosse
(1953) y Gerdemann (1955), quienes modificaron la base de las
investigaciones sobre cultivo axénico, al pasar de las raíces a las
esporas.

20
A partir de entonces han sido numerosos los grupos que han dirigido sus
investigaciones en ese sentido con diferentes fines, para los cuales se
requiere de la descontaminación de las esporas.
El uso de esporas asépticas para los estudios de laboratorio ha permitido
dar algunos pasos en las investigaciones sobre el cultivo de hongos
micorrizógenos arbusculares bajo condiciones axénicas, lo cual
actualmente, constituye una preocupación y representa uno de los retos
de la biología moderna (Payró y col.,1998).
Las esporas pregerminadas han sido utilizadas no solo con este fin, sino
también, con el de obtener cultivos duales con raíces transformadas
genéticamente y el de producir plantas micropropagadas micorrizadas in
vitro (Payró y col., 1998).
2.10.1. Métodos de esterilización total y parcial
Muchos han sido los procedimientos utilizados para esterilizar la
superficie de las esporas (Mosse, 1962; Tommerup y Kidby, 1980;
Bécard y Fortín, 1988; Paula y Siqueira, 1990; Bécard y Piché, 1992;
Colozzi - Filho y col., 1994 y Walley y Germida, 1996).
La mayoría de los investigadores prefieren soluciones de Cloramina
T(2%) con trazas de surfactante y antibióticos como la estreptomicina y
la gentamicina (Walley y Germida, 1996), aunque también se han
empleado el hipoclorito de sodio, el formaldehído, etc. (Colozzi-Filho y
col., 1994). El éxito en el uso de estas soluciones desinfectantes es
altamente dependiente de cómo son manipuladas y sobre qué material.
Es conocido que las características de las esporas son dependientes de
la especie a la cual pertenezcan, incluyendo el número y grosor de las
paredes y los rasgos o caracteres distintivos tenidos en cuenta, todo lo
cual influirá en el grado de desinfección que debe ser empleado (Walley
y Germida, 1996).
El material del hongo que va a ser desinfectado debe ser purificado
hasta donde sea posible, pues en muchas ocasiones los contaminantes
provienen de esporas viejas o de sus restos (Bécard y Piché, 1992). No
obstante, la extracción de esporas del suelo por la técnica de Wet
Seiving (Gerdeman y Nicolson, 1963), está sujeta a gradientes de
centrifugación que remueven las esporas muertas y otros desechos.
Este método aísla las esporas jóvenes y saludables que son, por lo
general, más fáciles de desinfectar.
Para la descontaminación han sido empleados diversos agentes
oxidantes y antibióticos (Mosse,1962; Tommerup y Kidby, 1980; Bécard
y Fortín, 1988; Tylka y col., 1991; Colozzi - Filho y col., 1994 y Payró y
col., 1998). Entretanto, las informaciones sobre los daños causados a
las esporas por estos productos son escasas.
Estudios realizados de viabilidad de las esporas después de la
descontaminación con productos químicos, pueden ofrecer información
valiosa sobre la habilidad de éstas de sobrevivir operaciones de

21
laboratorio y al mismo tiempo, esclarecer ciertos aspectos sobre el
desarrollo y la sobrevivencia de los HMA en su hábitat natural (Colozzi -
Filho y col.,1994).
Lamentablemente, algunos de los procedimientos para esterilizar la
superficie de las esporas que se reportan rutinariamente, rara vez
informan los niveles de descontaminación logrados.
En adición, la mayoría de los métodos empleados en la actualidad son
de alto impacto y por lo general, destruyen la totalidad de los
contaminantes asociados a las paredes de las esporas (Walley y
Germida, 1996).
Los prolongados tiempos de desinfección y las altas concentraciones de
los descontaminantes destruyen no solo la microbiota asociada, sino
también bacterias que se encuentran embebidas en dichas paredes
(Colozzi - Filho y col., 1994); esto podría influir en que no se logren
frecuentemente los porcentajes de germinación deseados, teniendo en
cuenta la influencia positiva que pueden tener algunos de ellos en los
eventos previos al proceso germinativo.

2.11. Técnicas empleadas para la micorrización in vitro

El reto que constituye el cultivo axénico de los hongos endomicorrízicos
fue abordado desde comienzos de la década del 70 por Mosse y Hepper
(1975), quienes comenzaron a inocular propágulos de hongos
endomicorrízicos en plántulas y sobre cultivos de raíces.
Otros grupos de investigadores enfrentaron el reto de establecer la
simbiosis micorrízica sobre un medio de cultivo axénico (Hayman, 1983;
Miller - Wideman y Watrud, 1984; Mugnier y Mosse, 1987; Bécard y
Fortín, 1988; Gemma y Koske, 1988; Becard y Piché, 1989; Chabot y
col., 1992; Elmeskaoui y col., 1995; Declerck y col., 1996 y 1998 y
Pawloska y col., 1999).
En los últimos quince años se han realizado un sinnúmero de
investigaciones en función de garantizar un desarrollo in vitro exitoso de
los propágulos de HMA, no solo con el audaz propósito de lograr su
crecimiento en condiciones artificiales, sino también con el fin de
garantizar la inoculación de vitroplantas en esta fase de desarrollo del
cultivo.
Según Vestberg y Staun (1994), los protocolos de inoculación deben ser
diseñados para cada especie de planta en particular, teniendo en cuenta
la tasa de crecimiento y desarrollo radical y el número de transplantes
realizados. La selección de la cantidad (Morandi y col., 1979;
Ravolarinina y col., 1989; Guillemin y col., 1992 y Morte y col., 1996) y
la calidad del inóculo es un factor importante a tener en cuenta tanto
para la micorrización in vitro como in vivo (Vestberg y Ousukainen,
1996). El inóculo no solo debe estar puro sino también producir los
efectos biológicos deseados.

22
Las hifas, esporas y fragmentos de raíces micorrizadas han sido
empleadas como inóculo ya sea para la micorrización in vitro como in
vivo, así como también para el establecimiento del hongo micorrízico en
el cultivo de raíces, transformadas o no, in vitro (Mosse y Hepper, 1975;
Strullu y Romand, 1986; Ravolarinina y col., 1989; Schubert y col.,
1990; Elmeskaoui y col, 1995; Azcón - Aguilar y col., 1996; Declerck y
col., 1996, Morte y col., 1996 y Hernández - Sebastia y col., 1999).
Recientemente Declerck y col., (1998) comenzaron a emplear las
vesículas, que producen algunas de las especies de estos hongos en el
interior radical, como una efectiva fuente de inóculo.
Las técnicas de inoculación publicadas hasta la fecha difieren
dependiendo del sustrato o de la naturaleza del inóculo empleado (Rai,
2001).
Las plantas obtenidas a través de las técnicas de cultivo de tejidos se
producen sobre medios sólidos, semisólidos y líquidos, cuya composición
varía dependiendo de la especie de planta que se esté cultivando y de
los propósitos del productor; sin embargo, los cultivos duales de raíces y
hongos micorrizógenos son establecidos sobre medios sólidos,
particularmente sobre medio White modificado (Mínimo) (Pawloska y
col, 1999).
La selección del medio es muy importante pues algunos tipos de agar
contienen inhibidores propios debido a la presencia de trazas de metales
pesados. Además, determinadas concentraciones de sulfato de sodio,
fósforo y sacarosa en el medio de cultivo son de relevante importancia
para el establecimiento del hongo (Bécard y Fortín, 1988 y Elmeskaoui y
col., 1995).
Los estudios realizados por Bécard y Fortin (1988) y Bécard y Piché
(1989) profundizaron en el uso de las raíces transformadas como base
para establecer una colonización micorrízica primaria. Esta metodología
es, actualmente, un modelo de trabajo para establecer la simbiosis
sobre plantas producidas in vitro.
Las raíces micorrizadas, infectadas axénicamente son utilizadas como
inóculo para, entre otros aspectos, resolver el problema de la
contaminación (Elmeskaoui y col., 1995; Declerck y col., 1996, 1998 y
Plenchette y col., 1996).
Recientemente, una nueva técnica ha sido desarrollada para establecer
la simbiosis micorrízica en plantas micropropagadas y evaluar su efecto
sobre el crecimiento de las plántulas (Elmeskaoui y col., 1995 y Declerck
y col, 1998).
En ésta el hongo micorrizógeno se inocula sobre raíces, transformadas o
no, cultivadas sobre medio M para establecer un cultivo dual (infección
primaria) y luego esta asociación es usada para inocular plántulas
micropropagadas creciendo sobre un sustrato artificial, dando como

23
resultado un sistema de cultivo tripartita (Elmeskaoui y col., 1995), el
cual permite la inoculación directa del hongo en un ambiente axénico.
Este sistema es enriquecido con CO2 lo cual favorece el crecimiento de
las plántulas. En el cultivo tripartita el CO2 es esencial por dos razones:
proporciona las condiciones necesarias para la nutrición autotrófica del
carbono y estimula el desarrollo de la colonización micorrízica (Chabot y
col., 1992).
Otro sistema fue el desarrollado por el grupo de A. Cassell´s (Murphy y
col., 1997). Estos autores hicieron crecer vitroplantas de fresa sobre un
sustrato inerte (espuma de poliuretano) bajo condiciones
fotoautotróficas, con reducida concentración de sacarosa en el medio.
A diferencia del método descrito anteriormente en este se emplean
como inóculo esporas de hongos micorrízicos colocadas directamente
debajo de las plantas y como resultado las plantas micorrizadas tuvieron
mejor desarrollo y produjeron mayor número de estolones que los
controles no micorrizados.
En conclusión, las técnicas que incluyen el cultivo tripartita, o como
también se le conoce “hairy - root technology”, tienen gran aceptación
en la actualidad, no solo por el significativo rol que han jugado en el
establecimiento de los HMA en hospederos transgénicos o no, sino
también porque resultan una base adecuada para el entendimiento de
los procesos que median la interacción endófito (hongo) - hospedero, el
crecimiento y desarrollo del hongo micorrízico en medios de cultivo, la
producción de metabolitos secundarios, la tolerancia a metales pesados,
la bioprotección, la biorremediación y la actividad promotora del
crecimiento (Rai, 2001)

24
3. Materiales y Métodos.
Tarea 01. Producción de inoculante
Fase I
En el invernadero de especies certificadas de hongos micorrizógenos
arbusculares se desarrollo la producción del inoculante micorrízico para
ser utilizado posteriormente en los procesos de micorrización de
plántulas de papa. Nos planteamos como objetivo específico en este
estudio, la obtención de un inoculante líquido para propiciar un manejo
fácil y adecuado de los hongos micorrizógenos tanto en los medios de
cultivos, como en la fase de adaptación de las vitroplántulas antes
mencionadas. Para llevar a cabo este trabajo, se desarrollaron los
siguientes pasos:
- Inoculación de las especies micorrízicas Glomus clarum y Glomus
fasciculatum individualmente, colocando 10 gramos de cepa pura
por debajo de las semillas de Sorghum vulgare en el momento de la
siembra, sobre un sustrato estéril de reproducción, arcilla caolinítica.
- Al término del ciclo de vida de la planta, se eliminó la parte aérea, y
se obtuvo un sustrato sólido consistente en una mezcla de
propágulos micorrízicos (raicillas colonizadas, micelio fúngico y
esporas del propio hongo) y el propio soporte inicial, que tuvo las
siguientes características micorrízica.:
a. Abundante micelio externo (> 100 mg/g suelo).
b. Adecuada colonización radical ( entre 80 y 87 %).
c. Glomus fasciculatum: 120 esporas.g-1 de sustrato.
Glomus clarum: 300 esporas.g-1

- Posteriormente se procedió a extraer los propágulos micorrízicos por

el método de decantado húmedo y tamizado a través de dos tamices
de 400 y 40 um respectivamente, la fracción sólida que se recogió
en el tamiz más fino, se centrífugo y luego se decantó la fracción
líquida con los propágulos fúngicos.

- Una vez separado todos los componentes, estos fueron desinfectados

superficialmente con sln de Cloramina T( 2%) y Sulfato de
Estreptomicina e introducidos en diferentes soluciones estériles
osmóticamente protectoras.
Este inoculante líquido fue logrado posteriormente al estudio de
diferentes concentraciones de una solución osmótica protectora que por
motivos de estar en estos momentos bajo solicitud de patente, no
divulgaremos. Una vez lograda las soluciones mas promisorias y con el

25
objetivo de demostrar la viabilidad del germoplasma fúngico dentro de
estos medios, se montaron en el laboratorio de micorrizas arbusculares
del INCA, dos experimentos de almacenamiento y viabilidad de
esporas, colocando un número constante de 100 esporas viables dentro
de tubos eppendorf, realizándose en cada tratamiento 10 observaciones.

Determinaciones:
Para cada una de las especies se realizaron dos pruebas, un conteo
diario durante 7 días y posteriormente se estudiaron la mejor
concentración de Medio Líquido, extendiéndose este procedimiento
durante 8 meses, evaluándose en ambos casos, la capacidad de
supervivencia de las esporas a través de la determinación visual de la
calidad y coloración de las mismas.

Fase II

En la Universidad de Murcia, (España), se realizó un experimento con

inoculantes líquidos de las especies de Glomus clarum y Glomus
fasciculatum con el objetivo de conocer la capacidad germinativa y de
colonización de este material fúngico almacenado 8 meses en medio
líquido, para ello se emplearon cajas de petri con raicillas transformadas
de zanahorias, cultivadas en medio Mínimo (Becard & Fortín, 1992) .(
Fig. 1).
En total se evaluaron 10 cajas de petri por especie de hongo micorrízico,
en cada una de ellas se colocaron 50 segmentos de hifas maduras y 50
esporas, previamente lavadas con agua estéril tres veces e incubadas a
una temperatura de 28oC, durante 60 días

Fig. 1. Raicíllas transformadas de zanahoria y cultivadas en medio Mínimo (Becard & Fortín,
1992)

Determinaciones
Se le realizaron observaciones cada 7, 15 y 30 días del porcentaje de
germinación, así como la cuantificación de la colonización micorrízica a

26
los 7, 15, 30, 40, 50 y 60 días, según el método de Tinción y estimación
de el porcentaje de raíz micorrizada utilizada por el laboratorio del INCA
( Fernández, 1999).

Fase III
Con el objetivo de conocer la viabilidad del inoculante micorrízico frente
a mezclas líquidas de fertilizantes comerciales, se procedió a incubar
durante una semana, a temperatura ambiente, 0.1 ml del medio líquido
de Glomus fasciculatum ( con 100±5 esporas y micelio) con 100 ml de
distintas soluciones nutritivas de aplicación común en la agricultura o
medios de sostenimiento de plantas.
Las soluciones ensayadas contenían ácido nítrico y sulfato ácido de urea
a razón de 5 y 2 ml l-1, respectivamente, junto con 20-6-6 (NPK) (25 g l-
1
, solución I), 10-40-10 (25 g l-1, solución II) y 18-18-18. (25 g l-1,
solución III)

Determinaciones
En este caso de cuantificaron las esporas vivas y muertas, así como la
presencia y abundancia de micelio extramátrico.

Inmunodetección de esporas de HMA.

Obtención de las esporas de Glomus clarum.

Las esporas a emplear posteriormente, tanto en el esquema de
inmunización como en la prueba de sensibilidad, se recuperaron del
inoculante a través de la técnica de tamizado húmedo y decantado, y
posteriormente se extrajeron por centrifugación en gradiente de
Sacarosa + Tween 80 a 2000g durante 5 minutos (9). Una vez
finalizada la centrifugación se procedió a realizar la extracción de las
esporas de la interfase agua- sacarosa + Tween 80, auxiliados por una
micropipeta.

Todas las esporas se colectaron 24 h antes de iniciar los ensayos y se

mantuvieron en una solución osmóticamente protectora (solución
Ringer: NaCl 7.5 g/L, KCl 0.075 g/L, CaCl2 0.1 g/L y NaH2CO3 0.1 g/L) a
una temperatura de 4oC.

Proceso de esterilización de las esporas de Glomus clarum.

Después de realizada la extracción de las esporas del inoculante, se
procedió a su esterilización con empleo de un filtro (malla de acero-40
µm) reutilizable, esterilizable y acoplado a tapas horadadas de los tubos
Eppendorf (8).

27
Preparación del antígeno. Obtención de proteínas totales.
Las proteínas también se obtuvieron a través del procedimiento de
sonicación de esporas de G. clarum en un equipo Vibra-Cell®, utilizando
como buffer de extracción Tris-HCl 0.61 M pH 8 (ácido cítrico 0.3 M,
polivinil pirrolidona (PVP) 4%, polietilenglicol (PEG) 6000). La
suspensión obtenida fue centrifugada a 15000g durante 30 minutos a
una temperatura de 4°C y el sobrenadante fue almacenado a -20°C,
hasta su posterior inoculación en conejos. La concentración de proteínas
existente en este antígeno se determinó por el método de Bradford
(10).

Esquema de inmunización con proteínas totales como antígeno.

Se utilizaron 3 conejos hembras de la raza Chinchilla con un peso
aproximado de 2.5 Kg., producidos en el Centro Nacional de Producción
de Animales de Laboratorio (CENPALAB).
La primera inoculación para todos lo conejos en los tres esquemas de
inmunización se realizó con diez pinchazos de 0.2 mL de 1 mL de
proteínas totales equivalente a 80 µg/mL de proteínas totales del hongo
en igual volumen de adyuvante completo de Freund (*artículo
aceptado para publicar), en el lomo del conejo (12) dependiendo del
tipo de antígeno utilizado contenido en 1 mL de agua destilada e igual
volumen de adyuvante completo de Freund.

Las restantes inoculaciones se realizaron a una concentración de 60

µg/mL con igual volumen pero de adyuvante incompleto de Freund.
Estudio de especificidad del AcP.

Con el objetivo de estudiar la especificidad de los antisueros producidos

en este trabajo se utilizaron las especies de hongos Glomales
anteriormente mencionadas.

Detección de autofluorescencia en esporas de Glomus clarum.

Para realizar la determinación de la capacidad de autofluorescencia se
montaron las esporas en portaobjetos para fluorescencia, se excitaron
con filtros de 280, 480 y 690 nm durante 5 minutos y seguidamente se
observaron en un microscopio Olympus de epifluorescencia.
Como control negativo se utilizó esporas expuestas a la luz blanca y
esporas enfrentadas al conjugado fluorescente.

Detección de esporas de Glomus clarum mediante ELISA.

Se recubrió la placa de ELISA (FALCON® PRO-BINDTM) con el antígeno a
una concentración de 1 µg/mL en tampón de recubrimiento (Na2CO3,
1.59 g/L; NaHCO3, 2.93 g/L; NaN3, 0.20 g/L, pH 9.5), se adicionaron las
diluciones del suero por triplicado en tampón PBST-BSA1%. Se usaron

28
las siguientes diluciones de AcP: 1/500, 1/1000, 1/3000 y 1/5000,
seguidamente se añadieron 50 uL/pozo de IgG conejo-PhoA (SIGMA®)
1/2000, se añadió el sustrato de la enzima, el ρ-nitrofenilfosfato (ρ-
NPP), disuelto en tampón dietanolamina pH 9.8, y se paró la reacción
con una solución de carbonato de sodio 2M. La placa de ELISA se leyó
en un equipo (Reader 230 ORGANON TEKNIKA) a 405 nm (13).
Se tomó como criterio de positividad aquellas absorbancias que
superaban tres veces el valor del blanco.
Para esto se tuvo en cuenta los valores de absorbancia obtenidos con el
suero preinmune.
Análisis estadístico.
Los valores de absorbancia obtenidos en el ELISA fueron sometidos a
análisis de varianza (ANOVA) en el cual se incluyó el Test de Rangos
Múltiples de Duncan, con un nivel de significación de p<0.01.

Tarea 02.
Las esporas utilizadas se aislaron del inoculante liquido a través de la
técnica de Tamizado húmedo y decantado y posterior extracción por
centrifugación en gradiente de sacarosa + Tween 80 a 2000 x g durante
5 minutos (Gerdemann y Nicholson, 1963, modificado por Herrera y
col., 1995). Una vez obtenida la interfase agua - sacarosa + Tween 80
las esporas se extrajeron empleando una pipeta Pasteur.
Este proceso se realizó 24 h antes de comenzar los estudios y tantas
veces como fuera necesario. Las esporas fueron mantenidas en solución
Ringer a 4 oC.
Desinfección y germinación de esporas de G. clarum
Primera fase
Se estudiaron dos metodologías que incluyeron el uso de la Cloramina T
(2%) como desinfectante químico combinado con Cefalexina (5%) como
antibiótico y diferentes tiempos de exposición al mismo. Uno de los
métodos fue propuesto por Barredo y col. (1995) quienes luego de
obtenidas las esporas asépticas las incubaban para germinar en medio
White modificado y el otro citado por Walley y Germida (1996), en el
cual las esporas se colocaban en medio Agar Agua.
Los materiales empleados, así como la metodología seguida fueron
modificados durante el proceso de la siguiente manera:
ƒ la desinfección de las esporas se realizó en tubos Eppendorf sin
centrifugación a bajos tiempos (2 y 6 minutos), sustituyendo dos
centrifugaciones sucesivas
ƒ la manipulación de las esporas y del material desinfectante
(Cloramina T y Cefalexina -IMEFA-) se realizó a través de filtros
(malla de acero, 40 µm) esterilizables, acoplados a las tapas

29
 horadadas de los tubos Eppendorf, en sustitución de filtros
millipore y membranas de 0.22 µm, empleando jeringas
esterilizables de 15 mL.

Las esporas extraídas se colocaron en tubos Eppendorf y se lavaron

durante 5 minutos en solución Ringer estéril, agitándose en vórtex para
remover las impurezas.
Posteriormente se procedió a realizar la desinfección comenzando con la
solución de Cloramina T (2%) y empleando tiempos de exposición de 2 y
6 minutos de acuerdo al tratamiento en cuestión.
Ambas soluciones (desinfectante y antibiótica) fueron preparadas a partir
de la dilución del producto en agua destilada estéril.
Una vez finalizado este paso las esporas se lavaron con agua destilada
estéril dos veces consecutivas y se les añadió la solución de Cefalexina.
Las esporas tratadas se pasaron a placas Petri conteniendo los diferentes
medios en estudio empleando micropipeta Gibson de 200 µL y se
incubaron durante 25 días a 28oC colocando las placas invertidas. Se
inocularon 10 placas por tratamiento a razón de 50 esporas por placa.
Para el montaje de este experimento se empleó un Diseño
Completamente Aleatorizado con arreglo bifactorial (2x4) y tres
repeticiones, en el cual los factores fueron: soluciones desinfectantes y
medios de cultivo para incubación.
Los tratamientos estudiados fueron los siguientes: Medio
1. Cloramina T (2%) + Cefalexina (2 min.) Agar Agua
2. Cloramina T (2%) + Cefalexina (6 min.)
3. Cefalexina (6 min.)
4. Control (Agar Agua + esporas sin desinfectar)
Medio
5. Cloramina T (2%) + Cefalexina (2 min.)
White
6. Cloramina T (2%) + Cefalexina (2 min.)
modificado
7. Cefalexina (6 min.)
8. Control (White modificado + esporas sin desinfectar)
Segunda fase
Después de evaluada la efectividad de la mezcla de Cloramina T y
antibiótico como solución desinfectante, se procedió a incorporar dos
aspectos importantes en el protocolo de trabajo con vistas a dar
respuesta al objetivo referente a la micorrización in vitro de plántulas de
papa, cultivo que manifiesta un alto ritmo de crecimiento bajo estas
condiciones.
El primero fue la germinación de las esporas en medio líquido y el
segundo la utilización de una atmósfera de CO2 con el propósito de
incrementar la homogeneidad y rapidez de la germinación, así como
estimular el crecimiento del tubo germinativo.
En este nuevo ensayo se mantuvo la desinfección química con
Cloramina T (2%) utilizando como antibiótico una mezcla de Sulfato de

30
Streptomicina y Kanamicina, partiendo de la metodología propuesta por
Bécard y Fortín (1988) modificada por St. Arnaud y col., (1996), a la
cual se le realizaron algunas variaciones en este trabajo.
Primeramente se partió de esporas lavadas previamente aisladas del
inoculante por la técnica antes descrita, a las cuales se les adicionó una
mezcla de Tween 20 + Cloramina T (2%) durante 10 minutos, seguida
de lavados sucesivos con la mezcla de los antibióticos (5 veces) Sulfato
de Estreptomicina (1%) + Kanamicina (0.5%) durante 1 ó 2 minutos.
Posteriormente las esporas se incubaron durante toda la noche a 4 oC
en la solución de antibióticos y pasado este tiempo se les añadió
Cloramina T (2%) durante 10 minutos. Para finalizar se lavaron varias
veces con agua destilada estéril y se pasaron a solución Ringer.
Los antibióticos se filtraron a través de membranas miliporo (Tipo HA,
4.0 cm de diámetro y 0.22 µm de poro). Todo el proceso de desinfección
se realizó en un beaker de 250 mL a través de un tamiz de 40 µm de
diámetro de poro.
Luego de realizada la desinfección de las esporas se procedió a
comprobar la eficacia del método y se inocularon 20 esporas por placa
(5 en total) sobre un medio rico, Agar Nutriente. Estas se incubaron a
28 oC durante cinco días.
A diferencia de los métodos anteriormente descritos en que las esporas
germinaron sobre medio sólido, en este se colocaron a germinar en
frascos Gerber conteniendo solución Ringer, o sea un medio líquido que
facilitaba la posterior inoculación de las mismas.
Los frascos con esporas se colocaron dentro de una cámara o jarra de
CO2 (BBL®, Gas Pack®) (Fig. 4). Esta cámara incluye un sobre o
envoltura que contiene una tableta que combina bicarbonato de sodio y
ácido cítrico, la cual al reaccionar con agua es capaz de generar CO2 y
producir una atmósfera de aproximadamente 5 - 10 % del gas en
cuestión.
Las esporas, en estas condiciones, se incubaron durante tres días a 28
o
C de temperatura, realizándose con posterioridad evaluaciones de
porcentaje de germinación y contaminación.
Determinaciones realizadas
Se realizaron las determinaciones correspondientes a % de Germinación
y de Contaminación. Se consideró una espora germinada cuando la
misma presentaba crecimiento del tubo germinativo y en el caso de la
contaminación se consideró el número de esporas contaminadas en una
placa con respecto al número total de esporas que se sembraron en
cada una.

31
Análisis Estadístico

El procesamiento de los resultados se realizó mediante un Análisis de

Varianza y posterior Test de Duncan para p≤0.001 en caso de existir
diferencias significativas entre las medias.

Figura 4. Cámara de CO2 o Gas Pack® en la cual se colocaron las esporas

para acelerar su germinación.

Tareas 03 y 04.
Inoculación con HMA (Glomus clarum) de vitroplantas de papa
en estadio de enraizamiento
Material vegetal
Se utilizaron vitroplantas de papa común (Solanum tuberosum L. var.
Alfa) obtenidas por micropropagación sobre medio MS (Murashige y
Skoog, 1962), en estadio de enraizamiento. Las mismas tenían entre 7 y
10 días de subcultivadas, presentando un sistema radical poco
desarrollado que oscilaba entre 3 y 5 raíces y unas 4 ó 6 hojas por
planta.
Establecimiento del cultivo dual
Con el propósito fundamental de lograr un establecimiento exitoso del
hongo en las raíces se realizó un experimento que consistió en la
inoculación de vitroplantas de papa con esporas germinadas de G.

32
clarum, en el cual se diseñó un nuevo medio de cultivo (N) con el que se
pretendía garantizar el crecimiento y desarrollo de ambos organismos.
El nuevo medio estaba compuesto por una combinación de nutrientes de
los medios MS (comúnmente empleado para la micropropagación de
este cultivo) y Mínimo (M) (Bécard y Fortín, 1988) mezclado con
vermiculita estéril en proporción 1:1, este último se reporta en la
literatura como uno de lo más utilizados para el crecimiento in vitro de
los hongos micorrizógenos (tabla 1).
Se sembraron 3 plantas por frasco y se montaron 5 frascos por
tratamiento bajo un Diseño Completamente Aleatorizado. Los
tratamientos fueron los siguientes:
1. Medio N + HMA
2. Medio N
3. Medio MS (Control)
Posteriormente, en una segunda fase o repetición se incluyó en los
tratamientos el medio M, también como base para el establecimiento del
cultivo dual. En este caso se trabajó con igual número de plantas por
tratamiento, los cuales son descritos a continuación:
1. Medio N + HMA
2. Medio N
3. Medio M + HMA
4. Medio M
5. Medio MS (Control)

Tabla 1. Composición química de los medios de cultivo.

COMPONENTES MS (mg. L-1) M (mg. L-1) N (mg. L-1)

CuSO4. 5 H2O 0.025 0.13 0.025
MgSO4. 7 H2O 370.00 731.0 370.00
MnSO4. 4 H2O 22.30 - 22.30
ZnSO4. 7 H2O 8.60 2.65 8.60

KNO3 1 900.00 80.00 950.0

NH4NO3 1 650.00 - 82.50
Ca(NO3)2. 4 H2O - 288.0 -

KCl - 65.00 -
CaCl2. 2 H2O 440.00 - 440.00
CoCl2 0.025 - 0.025
MnCl2. 4 H2O - 6.00 -

KH2PO4 170.00 4.80 5.00

33
 COMPONENTES MS (mg. L-1) M (mg. L-1) N (mg. L-1)
NaFeEDTA - 8.00 -
Na2EDTA 37.25 - 37.25
FeSO4. 7 H2O 27.80 - 27.80
KI 0.83 0.75 0.40
H3BO3 6.20 1.50 6.20
NA2MoO4. 2 H2O 0.25 0.0024 0.25
Sacarosa 30 000.00 10 000.00 20 000.00

Glicina 2.00 3.00 3.00

Tiamina
0.10 0.10 0.10
hidroclorada
Piridoxina
0.50 0.10 0.10
hidroclorada
Ácido nicotínico 0.50 0.50 0.50
Myo inositol 100.00 50.00 50.00
Agar Bacteriológico 10 000.00 10 000.00 2 000.00

El pH de los medios fue ajustado a 5.5 antes de la esterilización.

Leyenda: MS: Murashige & Skoog; M: Medio Mínimo y N: Medio Nuevo.
Las esporas del hongo micorrizógeno previamente desinfectadas y
germinadas se inocularon directamente sobre las raíces empleando
micropipeta Finnipipette® de 1000 µL a razón de 100 µL por planta, los
cuales aportaban entre 50 y 55 esporas en cada aplicación.
Los frascos se colocaron en una cámara de crecimiento durante el
tiempo que transcurrieron los ensayos, con un fotoperiodo de 16 horas
luz y 8 de oscuridad, 200 - 300 µE.m-2. seg-1 de iluminación y 20 oC de
temperatura.
Determinaciones realizadas
A los 35 días de la inoculación se muestrearon 12 plantas por
tratamiento a las cuales se les realizaron las siguientes
determinaciones: largo radical (cm), altura de la planta (cm) y masa
fresca foliar y radical (g), así como concentración de clorofila total (µg
de clorofila/g masa fresca) utilizando un Espectrofotómetro U.V.visible
(CARY 50) y empleando la siguiente expresión matemática:

Clorofila Total = (20,2 x Abs. 645 nm) + (8,05 x Abs. 663 nm) x (mL de acetona)
Masa fresca (g)

Abs. = Absorbancia
Además se realizaron tinciones a las raicillas de las vitroplantas
utilizando la técnica descrita por Elmeskaoui y col. (1995) modificada
por el autor, al sustituir el colorante fuchina ácida por azul de tripano,
para comprobar la presencia o no de colonización.

34
Análisis Estadístico
Los datos se procesaron a través de un Análisis de Varianza de
clasificación simple y posterior docimación con el Test de Duncan para p
≤ 0.001 en los casos en que existió diferencias significativas entre las
medias.

Tarea 05.
Inoculación con HMA de vitroplantas de papa en fase de
adaptación. Estudio de diferentes cepas, concentrados de
especies y sustratos.
En este experimento se inocularon vitroplantas de papa común aptas
para el transplante con 3 cepas de hongos micorrizógenos (Glomus
clarum, G. fasciculatum - Taxter - Gerdemann & Trappe emend. Walker
& Koske y G. intraradices Schenck & Smith) procedentes del cepario del
INCA y dos concentrados de especies, uno de Selva y otro de Desierto
(estos serán los nombres con los cuales se les hará referencia a lo largo
del documento) obtenidos en el laboratorio de Bioquímica Ecológica del
CINVESTAV, Unidad Irapuato.
Se evaluaron asimismo dos sustratos diferentes, uno compuesto
totalmente por turba de musgo (Sunshine # 3), utilizado
frecuentemente por numerosos laboratorios para la adaptación de
vitroplantas, y otro por una combinación de la mezcla antes mencionada
y vermiculita en proporción 2:1 con el fin de variar las condiciones
nutricionales y así valorar el comportamiento de las cepas y
concentrados de especies vinculado con la riqueza del sustrato.
El inóculo simple empleado contaba con las siguientes características: G.
clarum (140 esporas/g), G. fasciculatum (100 esporas/g) y G.
intraradices (60 esporas/g).
El transplante de las vitroplantas se realizó a macetas colocando una
planta en cada una de estas y un total de 10 macetas por tratamiento.
La inoculación se realizó en el momento del transplante a razón de 2g
de inóculo por planta.
Al cabo de 15 días de transplantadas se le añadió solución nutritiva de
Long Ashton, LANS (Hewitt, 1966), con pH ajustado a 5.6 y una
concentración de fósforo de 22 ppm en el caso de los tratamientos
micorrizados.
Se empleó un Diseño Completamente Aleatorizado bajo arreglo
bifactorial (6x2) y los factores estudiados fueron las cepas (3 cepas de
HMA, 2 concentrados de especies de HMA nativas y 1 control - 6 -) y los
sustratos (2).

35
Los tratamientos estudiados fueron los siguientes:

1. G. clarum
2. G. fasciculatum
3. G. intraradices Sunshine # 3
4. Selva
5. Desierto
6. Control
7. G. clarum
8. G. fasciculatum
9. G. intraradices Sunshine #3 + Vermiculita (2:1)
10.Selva
11.Desierto
12.Control

Determinaciones realizadas
Al cabo de 35 días de transplantadas se realizaron las siguientes evaluaciones
a 5 plantas por tratamiento escogidas al azar:
• Morfoagronómicas: Largo radical (cm), Masas seca foliar, radical,
de tubérculos y total (g)
• Fúngicas: Porcentaje de Colonización (%) y Densidad Visual (%),
empleando estereomicroscopio (Zeiss, West Germany -5- )
• Fisiológicas: Tasa fotosintética (µmolCO2.m-2.s-1) y Transpiración
(µmolH2O.m-2.s-1) utilizando un Analizador portátil de fotosíntesis
(LI-6250, LI-COR, Inc. Nebraska, USA), así como se determinó la
variable Eficiencia en el uso de agua EUA (%) a partir de la
siguiente expresión matemática:
EUA= Tasa fotosintética (µmol.m-2.s-1)
Transpiración (µmol.m-2.s-1)
• Contenidos nutricionales foliares: macronutrientes P (%), K (%),
Ca (%), Mg (%) y los micronutrientes Mn (ppm), Cu (ppm) y Zn
(ppm), empleando para el caso del P el método colorimétrico
reportado por Jackson (1970) y para el resto de los elementos
Espectrofotómetro de absorción atómica.
Análisis Estadístico
Para el procesamiento de la información se utilizó el paquete estadístico
“Statistical para Windows”, realizando los Análisis Multivariados de
Componentes Principales (Varela, 1998) y Conglomerado Jerárquico de
Ligamento Completo (Cluster) con el propósito de realizar una valoración
integral de los diferentes tratamientos en estudio (cepas y concentrados de
especies de HMA y sustratos) y agruparlos en función de sus efectos.
Se realizaron además, los Análisis de Varianza correspondientes a las variables
que estuvieron más correlacionadas con la formación de las componentes,
utilizando el programa estadístico Statgraphs 4.1, así como transformaciones a
los valores de porcentaje pertenecientes a las variables fúngicas Colonización y
Densidad Visual, según la expresión 2arcsen√x (Lerch, 1977).

36
Resultados y Discusión.

Tarea 01.
Características del inoculante líquido de Hongos Micorrizógenos
Descripción
En la Foto 1 y 2 pueden observarse las esporas de Glomus
fasciculatum y Glomus clarum respectivamente a los 8 meses de
incubación en el medio líquido, en el primer caso, se aprecia la unión
esporocárpica que puede reunir hasta 9 esporas en una misma
estructura, las dos paredes celulares típicas de la especie y la unión
directa del esporóforo sin estrechamiento de paredes en la base del
mismo y el aspecto del producto con Glomus fasciculatum, con
abundante presencia de mucílago, probablemente debido a la excreción
de una glicoproteína soluble del citoplasma de estos hongos llamada
Glomalina. así como las características morfológicas del segundo
hongo, con las tres capas de pared celular y el típico poro ocluido que
enlaza la base del esporóforo con la espora y la hifa de formación.

a b

c d

e
Foto 1. Diferentes esporas de Glomus fasciculatum. a: Esporas formando esporocarpos. b: Esporas en
esporocarpo frente al reactivo de Meztler. d: Doble pared celular de la espora y unión directa del
esporóforo sin estrechamiento de las paredes en la base del mismo c: Esporas en esporocarpos. d:
Espora individual y unión con el esporóforo. e: Aspecto del LicoMic en las líneas de riego, nótese una
gran cantidad de esporas y presencia de mucílago, presumiblemente Glomalina.

37
 Capa externa
Capa intermedia

Capa interna

Poro sin ocluir

Fig. 2. Esporas jóvenes de Glomus clarum, contenidas en el LicoMic. A. Diferentes

capas de paredes. B. Poro del esporóforo sin ocluir.

Estabilidad del inoculante micorrízico Líquido

Tras realizar ensayos tendentes a seleccionar un soporte líquido, capaz

de asegurar la viabilidad del inoculante durante un prolongado período
de tiempo, se elaboraron inoculantes a base de las especies
anteriormente mencionadas, las cuales tuvieron una estabilidad superior
a 8 meses, debido a las peculiaridades del componente liquido utilizado
en su elaboración (Tabla 1).
Tabla 1. Número de esporas de Glomus fasciculatum y Glomus clarum viables en
el medio líquido (ML) y en agua, durante 8 meses de incubación.
Meses de incubación
Tratamientos
1 2 3 4 5 6 7 8
Glomus
fasciculatum 103a 101a 97a 100a 100a 96.5a 97.5a 98a
(ML)
Glomus clarum
100a 101a 100a 103a 102a 100a 101a 99a
(ML)
Glomus
fasciculatum 42b 30b 26.5b 17.5c 17.5b 17.5b 10b 11b
(Agua)
Glomus clarum
45b 31b 26.3b 21b 18.2b 15.3b 9.2b 8.5c
(Agua)
Es x 0.12*** 0.15*** 0.26*** 0.31*** 0.14*** 0.09*** 0.25*** 0.31***

La importante pérdida de viabilidad de las esporas de ambas especies en

el agua obligó a realizar otro ensayo tendente a conocer con qué

38
velocidad se produce la pérdida de viabilidad de las esporas en este
medio.

Tabla 2. Número de esporas de Glomus fasciculatum y Glomus clarum viables en

medio líquido (ML) durante 164 horas.
Horas de incubación
Tratamientos
24 48 72 96 120 144 164
Glomus fasciculatum
103.5a 104.5a 100.5a 94b 108a 107a 101.5a
(ML)
Glomus clarum (ML) 100a 101a 100a 102a 100a 101a 100a
Glomus fasciculatum
82b 57.5c 48.5c 49.5c 42b 44b 45b
(Agua)
Glomus clarum (Agua) 79c 78b 65b 48c 42b 41b 42b

Es x 0.09*** 0.11*** 0.12*** 0.08*** 0.09*** 0.11*** 0.07***

Los resultados (Tabla 2) mostraron que si bien la pérdida de viabilidad

se produce de forma progresiva, durante los dos a tres primeros días de
acuerdo a la especies en cuestión, la viabilidad mantiene niveles altos, y
durante los días cuatro y cinco, ésta continúa manteniendo niveles
aceptables, del orden del 50 %.

Pruebas de Germinación.

Una vez estudiada la estabilidad de los medios líquidos, se procedió a

conocer si estos inoculantes eran capaces de promover una infección y
por lo tanto mantener capacidad germinativa luego de 8 meses de
incubación.

Tabla 3. Porcentajes de germinación de esporas y micelio de Glomus

fasciculatum y Glomus clarum en medio M, incubado a 28oC , durante 60 días.
Días de incubación

Tratamientos 7 15 30

Micelio Esporas Micelio Esporas Micelio Esporas

Glomus
10 n.s 25 n.s 47 n.s 40 n.s 62 n.s 52 n.s
fasciculatum (ML)
Glomus clarum (ML) 15 n.s 24 n.s 46 n.s 41 n.s 63 n.s 51 n.s

En la tabla 3 se puede apreciar que las cepas pudieron expresar su

capacidad germinativa hasta los 30 días de incubación con
independencia de los propágulos fúngicos empleados no detectándose
diferencias significativas en ninguno de los momentos estudiados.

39
El propágulo fúngico que mayores valores alcanzó fue el micelio
extramátrico, coincidiendo con la mayoría de los reportes científicos, no
obstante para el caso de las esporas, también se encontraron elevados
porcentajes de germinación.
Este hecho, pudiera resultar muy interesante, teniendo en cuenta que
las esporas de las especies de Glomus, poseen un bajo poder
germinativo y pasan por largos períodos de dormancia, sin embargo el
hecho de permanecer durante 8 meses en un medio líquido
osmóticamente protector, indudablemente genera un fuerte stress en la
zona de la pared externa que a nuestro juicio influyo sobre las
capacidades germinativas, una vez extraídas de este medio y colocadas
con condiciones favorables para la germinación.

Los resultados observados en la Tabla 4 y la figura 3, permitieron

aseverar que las esporas y micelio no solo germinaron, sino que
produjeron una fuerte colonización gradual a partir de los 14 días de
iniciado el experimento, siendo muy similar en ambas especies.

Tabla 4. Porcentajes de colonización de raicillas transformadas de zanahoria con

las cepas de Glomus fasciculatum y Glomus clarum durante 60 días de
incubación en medio M a 28oC
Días de incubación
Tratamientos
7 15 30 40 50 60
Glomus fasciculatum
0 n. s 12 n.s 24 n.s 35 n.s 46 n.s 56 n.s
(ML)
Glomus clarum (ML) 0 n.s 5 n.s 11 n.s 32 n.s 57 n.s 62 n.s

40
 a b

c d

e f

.
Figura 3. (a): Esporas de Glomus fasciculatum germinadas a los 14 días, (b): colonización
micorrízica a los 30 días, (c): Esporas de Glomus clarum germinadas a los 14 días, (d):
colonización micorrízica a los 30 días, (e y f): Raicillas de zanahoria transformadas y teñidas con
azul de tripano a los 15 y 30 días respectivamente, después de comenzada la germinación del
micelio de Glomus fasciculatum.

Estos resultados vienen a asegurar un alto porcentaje de esporas y

micelio viables, cuando el inoculante se incorpore a los medios de
cultivo, en consecuencia, cabe concluir que este inoculante puede ser
aplicado a los medios de cultivos en condiciones de gran humedad sin
afectar a los propágulos micorrízicos.

Estabilidad en soluciones fertilizantes.

A pesar de la adecuada estabilidad del germoplasma fúngico en las

condiciones anteriores, convenía conocer si al utilizarlo mezclado con
otras fuentes químicas podían producirse alteraciones importantes en la
viabilidad de las esporas.

41
Durante el ensayo, en la solución I se observó abundante micelio
extramátrico, presencia de agregados de esporas y, a medida que
transcurrió el tiempo, la presencia de un mucílago, que
presumiblemente pudiera ser excreción de Glomalina, proteína soluble
de citoplasma, causante, entre otras cosas, de la formación de
agregados en el suelo, microbianos, etc. que atrapan gran número de
esporas.
El comportamiento de las soluciones II y III se caracterizó por la
presencia de esporas siempre dispersas, poca presencia de micelio a las
24 h, y ausencia total de mucílago. La elevada concentración de P y K
en estas soluciones podría ser la causa del comportamiento observado.
En la Tabla 5 se puede apreciar el comportamiento de las variables
viabilidad y mortalidad de esporas de LicoMic en las soluciones
fertilizantes. En todos los casos, hubo presencia de esporas durante
todo el ensayo, si bien, cabe destacar que la mayor presencia de
esporas viables y menor mortalidad aconteció en la solución I, diferente
significativamente del resto de las soluciones.

Tabla 5. Presencia de esporas brillantes y con estructura de pared intacta (V, %) y

esporas necrosadas (M, %) en distintas soluciones fertilizantes durante 168 horas.
Solución Tiempo (h)
0 24 48 72 168
V V M V M V M V M
I 100 97.70a 2.34c 97.70a 0 97.70a 0 97.70a 0
II 100 66.70b 33.34b 66.70b 0 66.70b 0 66.70b 0
III 100 62.33c 37.67a 62.33c 0 62.33c 0 62.33c 0
0.12 0.25* 0.15* 0.12* 0.22** 0.20**
Es x *** ** ** ** 0 * 0 * 0

Es interesante destacar que la mortalidad de esporas en los distintos

tratamientos aconteció en las primeras 24 h de contacto con las
soluciones fertilizantes. Los altos niveles de N en la solución I no
parecen afectar la viabilidad de las esporas, mientras que los altos
niveles de P y K, en las soluciones II y III, podrían haber inducido un
efecto osmótico causante de la mayor mortalidad de esporas. Sin
embargo, cabe pensar que una mayor dilución del LicoMic, a nivel de
cuba fertilizante, podría evitar los efectos adversos observados.
Estos hechos permiten concluir que el medio líquido micorrizógeno para
Glomus clarum, especie mas pequeña y mas débil en estructura de
pared celular, puede mezclarse a altas concentraciones con el complejo
20-6-6 sin pérdida significativa de la viabilidad de las esporas. Las
mezclas con los complejos 10-40-10 y 18-18-18 sin bien pueden inducir
mayores pérdidas de viabilidad de las esporas, ésta permanece a niveles
aceptables y en mezclas más diluidas no cabría esperar la ocurrencia de
estos comportamientos.

42
Inmunodetección de esporas de HMA.

Detección de autofluorescencia en esporas de Glomus clarum .

Las esporas de G. clarum mostraron resultados totalmente diferentes
cuando eran expuestas a diferentes longitudes de onda, respecto a las
técnicas de fluorescencia convencionales utilizadas en este trabajo como
controles negativos, debido a la presencia de la propia autofluorescencia
de la pared de la esporas de G. clarum.
En este estudio se observó de forma muy característica el fenómeno de
la autofluorescencia (Figura 1 b, c y d), y se encontró no sólo excitación
y emisión de luz a 480 nm (luz verde), sino que por vez primera se
informa una marcada excitación tanto en el rango del ultravioleta (240-
280 nm) como en el naranja-rojo (690 nm).

Esporas expuestas a la luz blanca. Esporas expuestas a luz roja.

Esporas expuestas a la luz verde. Esporas expuestas a la luz azul.

Figura 1. Esporas de Glomus clarum excitadas a diferentes longitudes de onda.

La autofluorescencia de las esporas se debe en gran medida a que en

las plantas se produce acumulación de compuestos fenólicos como
respuesta de defensa ante la presencia de microorganismos, y los
mismos producen fluorescencia (Gange et al., 1999). También se tiene
evidencia que estos compuestos pueden acumularse dentro de la pared
de las esporas y conferirles autofluorescencia (Bennett et al., 1996)).
Este fenómeno puede presentarse en mayor o menor grado en
dependencia del grado de acumulación de fenoles que tenga la pared de
la espora y en el sitio donde las mismas se hayan desarrollado.
Las esporas de Glomus clarum pueden desarrollarse a partir del
micelio extramátrico o de la formación de vesículas, las cuales son
estructuras que pueden funcionar como reservorio de nutrientes para la
espora o desarrollarse y devenir en esporas , por consiguiente, se
encuentran diferencias en el grado de autofluorescencia, ya que las
esporas que se desarrollan dentro de la raíz tendrán un mayor

43
reforzamiento en la fluorescencia por el aumento de compuestos
fenólicos oxidados en su pared, que rompen con la integridad de la
pared de las esporas, debido a la cercanía de éstas con las células de la
raíz de la planta.
Esta autofluorescencia puede explicarse también atendiendo a las
características que presenta la formación de las esporas en las especies
que pertenecen al género Glomus. El proceso de formación de esta
estructura está estrechamente relacionado con la génesis de las
diferentes capas de la pared de la espora, siendo la primera y la
segunda capa parte de la hifa que sostiene a la espora (Morton, 1999).
El grosor de las paredes de estos hongos varía considerablemente de
una especie a otra, e incluso de un ecotipo a otro dentro de una misma
especie, además en las láminas pleomórficas (1ra lámina) de muchos de
los miembros de Glomus, como es el caso de Glomus clarum la
respuesta que se observa pudiera estar dirigida a alguna glicoproteína
que se genere en el citoplasma de la espora en formación y que después
viaje a través del poro para situarse en la primera lámina de la pared .
En este trabajo se logró ver excitación de las esporas de G. clarum a
480 nm (luz verde) y una marcada excitación tanto en el rango de
ultravioleta (240-280 nm ), como en el de la luz naranja-roja (690 nm),
diferentes al color verde-amarillo del control negativo utilizado en el
ensayo con el uso del IFI cuando éstas fueron excitadas a través del
microscopio epifluorescente mostrando un color verde brillante que es
fuertemente dirigido hacia la zona del esporóforo (Figura 2).

Figura 2: Control negativo de esporas de G. clarum utilizado para establecer las diferencias entre la
autofluorescencia y la fluorescencia lograda por la técnica de inmunofluorescencia
indirecta.

Detección de esporas de Glomus clarum por ELISA.

En la Tabla 1 se pueden apreciar los resultados alcanzados del

enfrentamiento del Anticuerpo Policlonal a las especies de HFMA en
estudio.
En este caso se obtuvo una respuesta cruzada del antisuero frente a
todas las especies a la dilución 1/500, no obstante, en el caso de la
especie Glomus clarum, su reacción resultó mucho más intensa con
valores indeterminados de absorbancia. A partir de 1/1000 y hasta la

44
dilución 1/3000 el antisuero policlonal reconoció las esporas de Glomus
clarum sin que se evidenciaran reacciones cruzadas con las otras
especies de Glomus estudiadas.
Es bueno destacar la baja respuesta del antisuero frente a la especie
Acaulospora scrobiculata y para el resto de las especies de Glomus. Si
bien aparecieron reacciones cruzadas en la dilución más baja, éstas
fueron significativamente inferiores a las logradas frente a Glomus
clarum y con valores muy cercanos a los del suero preinmune.

Tabla 1. Resultados del ELISA. Reactividad del antisuero anti-Glomus clarum frente
a las especies de Glomales estudiadas.
Título
1:500 1:1000 1:3000 1:5000 SPI B
Cepas
G. clarum ID 0.85 a 0.41 b 0.13 d
A. scrobiculata 0.12 de 0.09 def 0.07 def n.d
G. fasciculatum 0.21 c 0.11 de 0.07 def n.d 0.10 de 0.04 f
G. claroideum 0.26 c 0.12 de 0.07 def n.d
Glomus sp1 0.24 c 0.12 de 0.06 def n.d
ES x 0.02 ***
Leyenda: SPI: suero preinmune, B: Blanco, ID: indeterminados
Medias con letras comunes no difieren significativamente para p<0.01

La Figura 3 muestra claramente las diferencias en los valores de absorbancia para las especies
en estudio a la dilución 1/3000, siendo significativamente mayor el obtenido para la especie
Glomus clarum con valor de 0.41. Las demás especies estudiadas no presentaron reacción a esa
dilución y sus valores no sobrepasaron el valor 0.07, los cuales no diferían significativamente
de los valores alcanzados por el suero preinmune.
Abs(405nm)

0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
A.Scrob

G.sp1
G. fasc
G.c

G. clar

Especies

Figura 3. Valores de absorbancia a la dilución 1/3000 en el ELISA para Glomus clarum.

Leyenda:
Gc: Glomus clarum
A.scrob: Aculospora scrobiculata
G. fasc: Glomus fasciculatum
G. clar: Glomus claroideum
G. sp1: Glomus sp1 (Güira)

45
La actividad del suero frente a las diferentes especies en estudio
también se analizó por ELISA, el cual constituye por su naturaleza una
eficiente herramienta de detección inmunológica, considerada una de las
metodologías más sensibles a la hora de determinar uniones antígeno-
anticuerpo a muy bajas concentraciones del analito (antígeno-
anticuerpo). Se pudo determinar que a medida que se diluyó el
antisuero las reacciones cruzadas disminuyeron y, por lo tanto, aumentó
la especificidad del antisuero para la especie contra la cual fue
levantado, en este caso Glomus clarum.
Los valores de absorbancia indican que hubo un fuerte reconocimiento
del antisuero policlonal hacia Glomus clarum, máxime si tomamos en
consideración la similitud de grupos antigénicos que comparten estas
especies de Glomaceas. Por otra parte, el análisis de varianza
evidenció que los mayores valores siempre se presentaron en el caso de
Glomus clarum, difiriendo significativamente con el resto de las
especies estudiadas. En el caso del resto de las Glomaceas estudiadas,
si bien aparecieron reacciones cruzadas, éstas fueron significativamente
inferiores a las logradas con Glomus clarum y con valores muy
cercanos a los del suero preinmune (Tabla 1). Resultados similares han
sido obtenidos por otros investigadores quienes iniciaron sus
experimentos con un número similar de esporas, al usado en este
estudio.
Con estos resultados se pudo constatar la utilidad de usar la
autofluorescencia de la pared como herramienta en la detección de G.
clarum además de corroborarse una vez más la factibilidad del uso de
técnicas inmunoquímicas para el desarrollo del trabajo de identificación
taxonómica, si se tiene en cuenta la especificidad del suero en reconocer
determinantes antigénicos específicos para Glomus clarum.
El antisuero policlonal logrado contra las proteínas de pared de las
esporas pudo detectar hongos micorrizógenos y a su vez corroboró que
estos últimos son microorganismos que están distantes
filogenéticamente de otros tipos de hongos y bacterias, pudiendo
considerarse esta técnica como promisoria en la identificación de estas
esporas u hongos en los medios de cultivos en donde se aplique la
inoculación con la especie estudiada.

46
Tarea 02:

Estudios sobre desinfección y germinación de esporas

Para garantizar la eficaz germinación in vitro de las esporas de Glomus

clarum empleadas en los experimentos se realizaron estudios previos de
desinfección de las paredes de las mismas.
En las tablas 1 y 2 se muestra el efecto de los diferentes tratamientos
de desinfección empleados en dos medios de cultivo (Agar Agua y White
Modificado) sobre las variables Germinación (%) y Contaminación (%),
así como de sus porcentajes de incremento y decremento,
respectivamente.

De forma general, en las variables analizadas se encontraron diferencias

significativas entre los tratamientos, denotándose un comportamiento
diferenciado entre los medios de cultivo empleados, siendo en el medio
Agar Agua donde se observaron los mayores valores de las mismas.
El análisis de los porcentajes de germinación, en los tratamientos en los
que se utilizó Cloramina T y antibiótico (Cefalexina) como agentes
desinfectantes, independientemente de los tiempos empleados y de los
medios en los que se incubaron las esporas, siempre indicó el mejor
comportamiento de esta variable con relación a los controles sin
desinfectar.
Como se había hecho alusión, dentro de estos tratamientos, los mayores
valores se reportaron en el medio Agar Agua, con un rango entre 44,0 y
44,6 % de germinación, siendo las mejores variantes en las que se
empleó Cloramina T(2%) combinada con la Cefalexina.
Tabla 1. Efecto de los diferentes tratamientos de desinfección sobre el porcentaje de
Germinación (G) y su incremento a los 25 días de incubadas las esporas.

Tratamientos
Medios de G (%) Incremento (%)
Desinfección
incubación
Cl T (2%) + Cefalexina (2min.) 44.0 a 1275
Cl T (2%) + Cefalexina (6min.) 46.4 a 1350
Agar Agua
Cefalexina (6min.) 33.6 b 950
Sin desinfectar 3.2 e -
Cl T (2%) + Cefalexina (2min.) 31.1 b 185
Cl T (2%) + Cefalexina (6min.) 25.8 c 136
White Modificado
Cefalexina (6min.) 31.1 b 185
Sin desinfectar 10.9 d -
Es x - 0.94*** -
C.V (%) - 10.61 -
Leyenda: Cl T: Cloramina T. Medias con letras desiguales difieren entre sí significativamente
para p≤ 0.05, según Test de Rangos Múltiples de Duncan.

47
En cuanto a los tratamientos que solo contaron con la aplicación del
antibiótico, aunque su comportamiento fue superior a los controles,
nunca superaron el mejor tratamiento de desinfección en cualquiera de
los dos medios estudiados.
Este comportamiento se evidenció aún más, al analizar los diferentes
porcentajes de incremento con relación a los controles sin desinfectar
(Tabla 1).
En este análisis se puso de manifiesto, nuevamente, la gran diferencia
de respuestas a la germinación encontradas entre los medios de cultivo
empleados, reportándose porcentajes de incrementos superiores a 1000
% en el medio Agar Agua.
Otro de los aspectos estudiados fue el efecto producido por el uso de las
soluciones desinfectantes sobre el porcentaje de contaminación de las
esporas (Tabla 2).
El comportamiento de esta variable denotó que de forma similar al
porcentaje de germinación, existió una respuesta diferenciada de cada
grupo de tratamientos en presencia de un determinado medio. En este
caso, las variantes que estuvieron bajo la influencia de los agentes
desinfectantes, mostraron los menores valores de contaminación.
En el caso del medio Agar Agua no solo se observaron los menores
valores de contaminación en los tratamientos desinfectados, sino
también en el tratamiento control donde los valores disminuyeron a la
mitad (42.8 %) con relación a su homólogo en medio White (93.0 %).
Además, no se encontraron diferencias significativas en la exposición de
las esporas a los distintos tiempos de desinfección (3.2 y 3.3 %).
Tabla 3. Efecto de los diferentes tratamientos de desinfección sobre el porcentaje de
Contaminación (C) y su decremento a los 25 días de incubadas las esporas.

Tratamientos
Medios de C (%) Decremento (%)
Desinfección
incubación
Cl T (2%) + Cefalexina (2min.) 3.3 f 92.28
Cl T (2%) + Cefalexina (6min.) 3.2 f 92.52
Agar Agua
Cefalexina (6min.) 48.2 b -12.61
Sin desinfectar 42.8 c -
Cl T (2%) + Cefalexina (2min.) 22.0 e 76.34
Cl T (2%) + Cefalexina (6min.) 4.8 f 94.83
White Modificado
Cefalexina (6min.) 33.2 d 64.3
Sin desinfectar 93.0 a -
Es x - 0.97*** -
C.V (%) - 9.82 -
Leyenda: Cl T: Cloramina T. Medias con letras desiguales difieren entre si significativamente
para p≤ 0.05 según Test de Rangos Múltiples de Duncan.

Sin embargo, en el medio White Modificado solo se lograron alcanzar

niveles de contaminación significativamente similares a los anteriores en

48
el tratamiento bajo desinfección, con ambas soluciones, durante 6
minutos.
Este efecto se puede evidenciar claramente al observar los porcentajes
de decremento en la contaminación (Tabla 2).
Como se puede apreciar, solamente se observó incremento de los
valores de contaminación (%) con relación a los controles en el caso del
tratamiento en el cual se aplicó la solución antibiótica, en el resto de las
variantes los porcentajes de contaminación fueron inferiores a los de los
testigos de desinfección.
Al analizar las variables Germinación y Contaminación se observó que
existía cierta relación entre ambas, evidenciándose, por lo general, que
un decremento en la contaminación correspondía a importantes
incrementos en el porcentaje de germinación y viceversa.
Tomando en consideración lo anterior, se estudió la relación existente
entre ambas variables, a partir del cálculo de las curvas de tendencia y
las ecuaciones de regresión, utilizando el modelo polinomial de 2do grado
(Fig. 1).
Como se puede apreciar, se encontró una alta y significativa relación
negativa entre las variables en estudio, reportándose coeficientes de
determinación superiores a 0.90. Tanto en medio Agar Agua como en
White Modificado, los comportamientos indicaron una relación inversa en
el funcionamiento de estas variables, demostrándose de forma
fehaciente la estrecha vinculación de los mecanismos de germinación y
las poblaciones contaminantes adheridas a la pared.

49
 Medio Agar Agua
69.01

57.56

Germinación (%)
y = 59.02-2.97x+0.039x2
46.10 R2=0.96***
34.65

23.20

11.74

0.29
0.3 8.0 15.8 23.5 31.3 39.1 46.8

Contaminación (%)

Medio White Modificado

37.86

32.14
Germinación (%)

26.42

20.70

14.98
y = 23.4+0.44x-0.006x2
R2=0.97***
9.26

3.54
0.4 17.7 35.0 52.4 69.7 87.0 104.3

Contaminación (%)
Figura 1. Curvas de tendencia y ecuaciones de regresión realizadas entre las variables
Contaminación (x) y Germinación (y) en los tratamientos

Partiendo de estos resultados se realizaron algunas modificaciones a la

metodología de desinfección con la cual se obtuvieron las mejores
respuestas, con el principal interés de garantizar no solo la
homogeneidad en la germinación de las esporas, sino también acelerar
la ocurrencia del proceso.
Como se describió anteriormente entre las modificaciones realizadas
para incrementar la eficiencia de la desinfección se encontraban:
aumento en el tiempo de exposición de las esporas a la solución
antibiótica, incremento del número de antibióticos (2) y uso de
membranas miliporo para filtrar los mismos.
Estos nuevos procedimientos garantizaron ausencia de contaminación
en las esporas, pudiéndose comprobar, al inocularlas posteriormente a
la desinfección, sobre un medio rico (Agar Nutriente).
En las placas Petri inoculadas no se encontró crecimiento microbiano
alguno durante los 5 días de incubación.
En adición, el empleo de la cámara de CO2 o Gas Pack® en la cual se
incubaron las esporas para su germinación en medio líquido, garantizó
no solo la homogenización del proceso germinativo (Fig. 6), pudiéndose

50
disponer del 100% de las esporas germinadas para ser empleadas en
los experimentos posteriores de inoculación de plántulas en condiciones
in vitro, sino que también posibilitó la obtención de dichas esporas a
solo tres días de su desinfección.

Figura 6. Esporas de Glomus clarum germinadas en solución

Ringer en cámara de CO2 (30x).

La desinfección de esporas de hongos micorrízicos empleadas como

inóculo es crucial para la formación y el desarrollo exitoso de la
micorrización en condiciones in vitro, por ser la presencia de
contaminantes uno de los mayores problemas que atenta contra el
estudio de estos microorganismos bajo condiciones controladas;
además, las metodologías de desinfección deben ser establecidas para
cada especie de hongo en particular pues el efecto de los desinfectantes
o las combinaciones de estos varían en función de la especie utilizada
(Walley y Germida, 1996).
Los resultados reflejan el efecto de diferentes combinaciones de
antibiótico (Cefalexina), desinfectante (Cloramina T) y medios de cultivo
para la incubación de las esporas (Agar Agua y White Modificado) sobre
las variables Germinación y Contaminación, destacándose positivamente
los tratamientos en los que se utilizó Cloramina T (2%) y Cefalexina (2 y
6 min.) como agentes desinfectantes, sobre el medio de incubación Agar
Agua, alcanzándose valores medios de germinación de 44.0 y 46.4 %
respectivamente.
En el experimento se empleó, primeramente, una dosis de Cefalexina de
200 mg.ml-1, la cual constituye, según Payró y col. (1998), una
concentración suficiente para ejercer un adecuado control microbiano.
Por otra parte, la Cefalexina está considerada como un antibiótico de

51
amplio espectro, reportándose su mayor efecto sobre grupos
bacterianos Gram - y algunas enterobacterias Gram +, además de
actuar sobre algunos hongos de la clase Deuteromycete (Loyola-Vargas
y Miranda, 1995).
La efectiva acción de la Cloramina T como fuerte agente oxidante se
puso de manifiesto en los tratamientos en los que se utilizó y estuvo
dada por su mayor estabilidad con respecto a otros desinfectantes como
el Hipoclorito de sodio, el cual libera el cloro instantáneamente. En el
caso particular de la Cloramina T se liberan lenta y gradualmente las
moléculas contenidas del halógeno, evitando que actúen negativamente
sobre el proceso germinativo (Collins, 1969 y Colozzi - Filho y col.,
1994).
No obstante, según Walley y Germida (1996), la exposición prolongada
de las esporas a esta sustancia puede inhibir la ocurrencia de la
germinación, lo cual encontraron al tratar esporas de Glomus clarum
con Cloramina T (5%) durante 120 min.
Similares resultados fueron descritos por Collozi - Fhillo y col. (1994),
quienes reportaron, en esporas de Gigaspora margarita (Becker & Hall)
y Scutellospora heterogama (Nicolson & Gerdemann) Walker & Sander
inoculadas en medio Agar Agua, valores cercanos a 60 % de
germinación en presencia de Cloramina T (2%) y tiempos de exposición
a la solución desinfectante + antibiótico entre 3 y 6 minutos.
En cuanto a los medios de cultivo empleados en el estudio para la
incubación de las esporas y su germinación se reporta el Agar Agua
como el de mayores porcentajes de germinación con respecto al White
Modificado en el que los valores oscilaban entre 25.8 y 31.1 %, lo cual
no debe sorprender si se tiene cuenta la composición química de ambos
medios.
El medio White es sumamente rico desde el punto de vista nutricional lo
cual origina que proliferen contaminantes indeseables presentes en las
paredes de las esporas, que no se expresan en un medio tan pobre
como el Agar Agua (Walley y Germida, 1996).
En este sentido, es bueno destacar el determinado control que pueden
ejercer los medios pobres como el Agar Agua, en el cual no solo se
lograron los niveles de contaminación más bajos en general, sino que
inclusive, en el tratamiento control estos niveles disminuyeron a la
mitad (42.8 %) con relación a su homólogo en medio White.
A partir del análisis de las regresiones realizadas a las variables
porcentajes de Germinación y de Contaminación en ambos medios de
cultivo, se encontró una alta y significativa relación negativa entre ellas,
poniendo de manifiesto la vinculación existente entre los
microorganismos que habitan las paredes de las esporas y los
mecanismos de germinación de éstas.
En estudios de desinfección realizados por Walley y Germida (1996) a

52
esporas de Glomus clarum se encontró que los contaminantes que
crecieron alrededor de las esporas obstaculizaron la emergencia y el
crecimiento del tubo germinativo, por lo que la germinación de las
mismas se vió limitada.
Siqueira y col. (1984) y Paulitz y Linderman (1989) plantearon el papel
destructor de los microorganismos cuando ocurre una exacerbación de
sus poblaciones en la superficie de los propágulos de los hongos
micorrizógenos arbusculares; inclusive algunas especies fúngicas y
bacterianas, identificadas como hiperparásitos, pueden enquistarse,
germinar y penetrar las paredes de las esporas hospederas,
desarrollarse dentro de éstas, evitar que las mismas germinen y
provocar su destrucción, así como obstruir la emergencia y el
crecimiento del tubo germinativo (Walley y Germida, 1996).
No obstante, es interesante resaltar que existen determinados grupos
de microorganismos no considerados contaminantes que habitan las
paredes de las esporas y que pudieran ejercer un papel sumamente
benéfico sobre la germinación y el crecimiento del tubo germinativo.
Autores como Will y Sylvia (1990) y Giovannetti (2000), han discutido
acerca del papel beneficioso que juegan ciertos microorganismos
adosados a las paredes de las esporas como Pseudomonas y
Corynebacterium, los cuales incrementaron la germinación de esporas
de Glomus versiforme, planteando incluso que estos pudieran incidir
directamente en los mecanismos de destrucción de la pared externa,
intercambiar material molecular y combinar algunos productos finales de
la síntesis de cada uno de los microorganismos involucrados.
Sin embargo, aunque con el empleo de los mejores tratamientos de
desinfección se logra realizar un buen control de la contaminación, es
necesario aclarar que la metodología utilizada solo garantiza la
obtención de valores medios de germinación en las esporas tratadas,
aún a los 25 días de incubación.
En la segunda fase del experimento se utilizaron los antibióticos
Kanamicina y Sulfato de Estreptomicina, los cuales tienen una gran
similitud con la Cefalexina en cuanto a su acción sobre bacterias Gram +
y Gram - (Willett, 1983), conjuntamente con la Cloramina T como
agente oxidante y Tween 20 como surfactante y son reportados por
numerosos autores al desinfectar esporas para su inoculación en cultivos
tripartitas (Bécard y Piché, 1992; Elmeskaoui y col., 1995 y Fortin y
col., 2002).
Al incubar las esporas en la cámara de Gas Pack en presencia de CO2 se
logró una aceleración considerable de la germinación, debido a su acción
directa como estimulador del proceso germinativo y del crecimiento del
tubo germinal, llegando a ser total a las 72 horas.
Aunque generalmente los hongos micorrizógenos no necesitan
condiciones específicas o la presencia de raíces hospederas para

53
germinar, desde hace algunos años diversos autores comenzaron a
hacer referencia al importante papel que puede jugar el CO2 en la
ocurrencia de estos procesos (Bécard y Piché, 1989; Chabot y col.,
1992; Poulin y col., 1993; Elmeskaoui y col., 1995; Louche - Tessandier
y col., 1999 y Buée y col., 2000), resaltando principalmente como el
CO2 conjuntamente con los exudados radicales pueden estimular la
germinación y/o el crecimiento del tubo germinativo y como algunas
especies en particular pueden fijar CO2 como fuente mineral de carbono.
Recientemente, el empleo de 13CO2 marcado en experimentos realizados
in vitro utilizando análisis espectroscópico de resonancia magnética
nuclear (NMR), han confirmado que existe fijación de CO2 en la
oscuridad durante la germinación de esporas de Glomus intraradices
(Bago y col., 1999).
Desde el punto de vista metabólico, el CO2 tiene una gran importancia
para la germinación de estos hongos, debido a que en este estadio su
metabolismo es predominantemente dependiente del catabolismo
lipídico (Fortin y col., 2002) para realizar la biosíntesis de otros
compuestos. Por lo tanto y como es conocido, el catabolismo de los
lípidos conduce a la formación de acetilCoA, dos moléculas de carbono,
las cuales son posteriormente oxidadas en el Ciclo de los Acidos
Tricarboxílicos (CAT), por lo que el balance neto de carbono es
teóricamente cero.
No obstante, en los hongos micorrizógenos ocurre el Ciclo del Glioxalato
(CG) (Bago y col., 1999), y este ciclo, a diferencia del CAT evita la
pérdida de las dos moléculas de CO2, de lo que puede deducirse que
para el CG, el CO2 puede representar una entrada adicional de carbono y
activar significativamente el crecimiento del hongo (Fortin y col., 2002).
Teniendo en cuenta lo anteriormente explicado, el CO2 puede ser
considerado como el primer compuesto estimulador no específico
emitido por las raíces hospederas; y muy recientemente Fortin y col.
(2002) recomiendan, de forma similar a nuestros resultados, el uso de
ambientes enriquecidos con CO2 (2-5%) en estudios sobre compuestos
radicales estimuladores más específicos, en los cuales la respuesta del
hongo se incrementa y las variaciones se minimizan notablemente.
El desarrollo de este estudio permitió no solo poder contar con una
metodología que garantizara la germinación exitosa de las esporas de
Glomus clarum en ausencia de contaminación, sino también que estas
estuvieran listas y en un medio fácilmente manipulable para ser
inoculadas en plantas in vitro, al cabo de solo tres días de incubación.

54
Tarea 03y 04.

Inoculación con el HMA (Glomus clarum) de plántulas de papa en

condiciones in vitro.
Luego de obtenidas las esporas germinadas y disponer de material
vegetal suficiente para este experimento se procedió a la inoculación de
las plántulas sobre el medio de cultivo N diseñado para estos fines.
En la tabla 1 se puede observar el efecto de la inoculación con G. clarum
sobre el comportamiento de las variables altura de las plantas y masas
frescas foliar y radical en la primera fase del experimento.
Como puede apreciarse existe un marcado efecto negativo del medio N
o nuevo sobre el desarrollo de las plántulas de papa.
Al analizar cada una de las variables puede observarse como se
diferencian significativamente los valores, haciéndose menores en el
caso del tratamiento micorrizado con respecto a su homólogo y al
control sin inocular sobre medio MS.
Sobre este medio las plantas se desarrollaron adecuadamente (figuras 1
a, b y c) y mostraron incrementos que oscilaban entre un 47 y hasta un
54 % en el caso de la variable altura de las plantas, comportamiento
que se hace similar y evidente en el resto de las variables.

Tabla 1. Fase I. Efecto de la inoculación con G. clarum sobre las

variables estudiadas al cabo de 30 días.
Tratamiento Altura Masa fresca foliar Masa fresca radical
s (cm) (g) (g)
N + HMA 2.10 b 0.06 b 0.09 b
N 2.41 b 0.09 b 0.11 b
MS Control 4.53 a 0.37 a 0.17 a
Es x 0.14*** 0.02*** 0.02***
C.V. (%) 14.37 8.45 11.74
Leyenda: N: Medio Nuevo; M: Medio Mínimo y MS: Medio Murashige y Skoog. Medias con letras
desiguales difieren entre si significativamente para p≤ 0.05 según Test de Rangos
Múltiples de Duncan.

Las plantas que crecieron sobre medio N mostraron un crecimiento

atrofiado y poco armónico, sobre todo en el caso de los tratamientos
inoculados, observándose en estos un marcado cambio de coloración, de
verde a purpúreo, en la zona aérea de todas las plantas (Fig. 1c),
probablemente producido por algún tipo de deficiencia nutricional.
Este efecto o variación en la coloración comenzó a observarse a los 10
días de inoculadas las plantas aproximadamente y aparecía
primeramente sobre el envés de la hoja, extendiéndose lentamente
sobre la superficie de la misma, hasta abarcar toda la zona aérea de las

55
plantas incluyendo, en algunos casos, los tallos. A los 20 días de
inoculadas las plantas ya mostraban en todas sus hojas esta afección.

aa bb cc

Medio MS Medio N Medio N + HMA

Figura 1. Desarrollo diferenciado de plántulas de papa sembradas sobre diferentes medios de

cultivo, inoculadas o no con HMA, al cabo de 30 días (a, b y c). Depresión del
crecimiento de las plantas observado en el medio N (b y c) respecto a las
desarrolladas sobre medio MS (a). Cambio de coloración reportado sobre las
plantas crecidas en medio N en presencia del HMA (c).

Las plantas que crecieron sobre este medio (N) sin inocular, no sufrieron
variación alguna de la coloración, aún cuando su crecimiento se
encontraba deprimido y su desarrollo bastante retardado (Fig. 1b).
Al analizar el comportamiento de estas variables en la segunda fase o
repetición del experimento (tabla 2), en la cual se introdujeron los
tratamientos relacionados con el medio M como sustrato para el
establecimiento del cultivo dual, se observó, de la misma manera que en
el caso anterior, un efecto diferenciado de los medios de cultivo,
inoculados o no, sobre el crecimiento de las plántulas de papa.
Nuevamente el medio MS ofreció condiciones favorables para el
desarrollo de las plántulas, reflejado en los altos valores alcanzados por
las variables estudiadas. Sin embargo, aunque con los métodos de
tinción empleados no se logró observar la colonización en este ensayo,
si se observó un efecto positivo de la inoculación sobre las plantas
crecidas en medio M, las cuales alcanzaron valores estadísticamente
similares a los obtenidos sobre MS, con excepción de la variable masa
fresca radical, en la que los mismos superaron estadísticamente al
control.

56
Tabla 2. Fase II. Efecto de la inoculación con G. clarum sobre las
variables estudiadas al cabo d e 30 días.
Tratamiento Altura Masa fresca foliar Masa fresca radical
s (cm) (g) (g)
N + HMA 2.12 c 0.08 c 0.11 b
N 2.51 b 0.13 b 0.08 c
M + HMA 3.38 a 0.18 a 0.18 a
M 2.67 b 0.11 bc 0.11 b
MS Control 3.36 a 0.17 a 0.14 b
Es x 0.07*** 0.01*** 0.01***
C.V. (%) 8.36 13.57 10.52
Leyenda: N: Medio Nuevo; M: Medio Mínimo y MS: Medio Murashige y Skoog. Medias con letras
desiguales difieren entre si significativamente para p≤ 0.05 según Test de Rangos
Múltiples de Duncan.

De igual forma, las plantas que crecieron sobre medio N presentaron un

comportamiento similar al antes descrito, manifestando el efecto
depresor sobre el crecimiento y el desarrollo de las mismas y mostrando
valores de altura y masas frescas foliar y radical inferiores a las
inoculadas sobre medio M y a los controles sobre medio MS.
Así mismo, se pudo observar el cambio de coloración sobre las hojas en
los tratamientos micorrizados sobre medio N, el cual presentó una
dinámica de aparición y de extensión al resto de la planta similar a la
anterior.
Paralelamente se determinaron las concentraciones de clorofilas a, b y
total de las plantas inoculadas sobre medio N (Fig. 2) para comprobar si
los cambios de coloración se debían a deficiencias de este pigmento en
las plantas micorrizadas.

Al comparar los valores obtenidos en ambos tratamientos (plantas

micorrizadas y no micorrizadas), no se encontró efecto alguno de estos
sobre el comportamiento de la variable analizada, pues no existió
diferencias significativas entre las concentraciones de clorofila
determinadas.
Tanto las clorofila a y b (datos no mostrados) como la total reflejaron
valores estadísticamente no significativos en ambas repeticiones del
experimento.

57
 N + HMA
1600 N

1300
Clorofila (ug/g)

1000
700
400
100
Fase 1 Fase 2

Figura 2. Efecto de la inoculación con HMA sobre la concentración de clorofila

total de las plántulas desarrolladas sobre medio N.

La gran mayoría de los autores (Elmeskaoui y col., 1995; Hernández -

Sebastia y col., 1999 y Louche - Tessandier y col., 1999) emplean
actualmente el sistema de cultivo tripartita para establecer la
micorrización durante el estadio in vitro de la micropropagación de las
plantas, utilizando como inóculo cultivo de raíces transformadas o no,
previamente inoculadas con hongos micorrizógenos.
El principal reto de este estudio fue poder lograr micorrización de
plantas completas en condiciones in vitro utilizando como propágulos
esporas germinadas, teniendo en cuenta las dificultades que presentan
estos hongos para desarrollarse en medios de cultivo y la falta de
autotrofia de las plantas bajo estas condiciones;
La definición de los medios de cultivo adecuados para el desarrollo
exitoso de ambos organismos es una de las etapas más críticas del
proceso y depende en gran medida de las especies utilizadas en cada
caso.
Bioensayos realizados previamente a la ejecución de este experimento
(datos no incluidos en el documento) en el cual se inocularon plántulas
de papa sobre el medio de propagación MS sugirieron claramente la
necesidad de realizar un cambio de medio antes del establecimiento del
cultivo dual, aspecto ya reportado por otros autores (Elmeskaoui y col.,
1995; Hernández - Sebastia y col., 1999 y Fortin y col., 2002) al no
garantizarse el crecimiento adecuado del hongo bajo estas condiciones,
pues este medio contiene altas concentraciones de sulfato de sodio,
fósforo y sacarosa, las cuales influyen negativamente sobre el
establecimiento micorrízico in vitro.
Esto fue corroborado por Bressan (2002) quien al inocular embriones de

58
boniato con esporas de Glomus etunicatum sobre diferentes medios de
cultivo (MS y White), encontró respuestas diferenciadas de la
colonización en función de las concentraciones de nutrientes en los
medios y comprobó que cuando se adicionaba al medio sacarosa (3%)
se producía un efecto depresor sobre el crecimiento hifal y la
colonización radical.
En este trabajo pueden observarse los resultados derivados de la
inoculación de plántulas de papa con esporas germinadas de G. clarum
sobre un nuevo medio de cultivo semisólido (N), elaborado a partir de
los medios MS y M y combinado a su vez con vermiculita, esto último
con el propósito fundamental de aumentar las condiciones de aireación
en el medio de cultivo y de crear un sistema relativamente similar al
ambiente natural en el que se desarrollan ambos organismos.
Como fue descrito en el capítulo anterior se observó un efecto negativo
sobre las plántulas de los tratamientos (tanto micorrizados o no) que
crecieron sobre este medio expresado en las variables de crecimiento
estudiadas, comportamiento que pudo haber sido provocado por la
interacción entre los componentes del nuevo medio y la vermiculita
presente.
Como es conocido las vermiculitas son arcillas con una capacidad de
intercambio catiónico extremadamente alta (100 - 260 meq/100g) y se
expanden y contraen con gran facilidad secuestrando gran número de
iones entre sus capas (Grim, 1968), lo cual pudo haber ocurrido en este
caso al reaccionar con el agar presente en el medio y provocar que los
iones quedaran atrapados, ocasionando la indisponibilidad de los
nutrientes.
Por otra parte, en presencia de pH ácido, como es el caso (5.5), algunas
cantidades de Al3+ y Fe3+ de las arcillas pasan a solución y pueden
reaccionar con el escaso fósforo presente en el medio N, el cual contenía
una baja concentración de macronutrientes y en especial de este
elemento, formando fosfatos insolubles de hierro y aluminio y que
indudablemente, disminuyeron aún más la concentración de fósforo a
disposición de las plántulas en crecimiento.
La disponibilidad de fósforo para las plántulas pudo haber sido aún
menor si tenemos en cuenta que la micorrización en condiciones de muy
baja disponibilidad de nutrientes deja de ser una relación mutuamente
beneficiosa para convertirse en parasítica.
Al respecto se refirieron Daniels y Menge (1980) y Fernández y col.
(1990) al plantear que los hongos micorrizógenos arbusculares en
condiciones muy bajas de disponibilidad de nutrientes expresan una
relación hiperparasítica con la planta hospedera provocando serias
afectaciones al normal desarrollo de las mismas.
El empleo de este sustrato para tales fines fue reportado por vez
primera por Bressan y col. (2000) quienes estudiaron la respuesta de

59
embriones somáticos de boniato a la micorrización con esporas
germinadas de Glomus etunicatum, colocando los embriones
previamente inoculados en tubos que contenían, además de medio
White, una mezcla de vermiculita + arena estéril. En contraste con los
resultados presentados en este trabajo, dichos autores reportaron un
efecto estimulador de la micorrización sobre el desarrollo de los
embriones inoculados, debido probablemente a que los componentes
presentes en el medio White, mucho más rico, no resultaron limitantes
para las plantas al interactuar con la vermiculita.
Además de este efecto sobre el crecimiento de las plantas se encontró
un marcado cambio de coloración solo en los tratamientos inoculados
con HMA. Por las características que presentó la afección no parece
estar relacionada con ninguna deficiencia nutricional simple, pues las
variaciones de color observadas y el estado de las plantas no coinciden
con ninguno de los síntomas provocados por el déficit individual de los
elementos esenciales en el cultivo de la papa (Wallace, 1970).
No obstante, si bien esta modificación pudiera atribuirse a deficiencia de
fósforo por la presencia de coloración purpúrea en las hojas y el hecho
de ser encontrada como sintomatología típica en otros cultivos como la
col y el colinabo, no se reporta para el caso específico de la papa
(Wallace, 1970 y Fedepapa, 1997).
Por otra parte, las determinaciones de clorofila a, b y total realizadas a
las plantas micorrizadas y a sus homólogas sobre el mismo medio,
tampoco arrojaron resultados que relacionaran la presencia de esta
coloración con algún efecto producido sobre este pigmento en especial.
De acuerdo a los resultados se considera como muy probable que
estemos en presencia de una deficiencia múltiple de elementos, lo cual
ocasiona una sintomatología más compleja.
Cuando se analizan los resultados de la segunda fase del experimento,
en el cual se introduce el medio M como sustrato para ambos
organismos, se observa nuevamente el efecto diferenciado de los
tratamientos sobre el desarrollo de las plántulas; pero curiosamente, se
aprecia un efecto positivo de la inoculación sobre las plantas que
crecieron sobre el medio M .
Resulta extremadamente interesante destacar el efecto beneficioso de la
micorrización puesto de manifiesto en esta fase, en la cual las plantas
de papa micorrizadas alcanzaron valores en las variables estudiadas,
similares a los controles sobre medio MS y mostraron una mayor
relación raíz / tallo, a pesar de los bajos contenidos nutricionales que
caracterizan el medio M (Fortin y col., 2002).
Los efectos encontrados “in vitro” pueden asociarse a efectos
nutricionales favorables vinculados con la asociación simbiótica
reportados “in vivo”, aunque también puede verse reflejado un efecto
hormonal y / o fisiológico de las especies micorrízicas sobre las plantas

60
que colonizan.
Lo anterior tiene una estrecha relación con lo planteado por Niemira y
col. (1996) quienes refieren que aunque los niveles de colonización
micorrízica encontrados en plantas de papa (en condiciones de campo)
son relativamente bajos, presentan una alta respuesta a la inoculación
micorrízica desde el punto de vista morfológico y fisiológico.
Los resultados coinciden con los reportados por Elmeskaoui y col.
(1995) quienes encontraron efectos estimuladores de la micorrización
sobre plántulas de fresa, expresados en mayor altura y largo radical de
las plantas inoculadas, así como una reducción del potencial osmótico, lo
cual, según los autores, podría representar una importante condición
preadaptativa para enfrentar el estrés hídrico que encuentran al ser
transferidas a la fase de aclimatización, al aumentar en cierto grado la
hidratación de las hojas.
Es importante destacar que a pesar de no contar con datos cuantitativos
de colonización micorrízica o con evidencia visual de ocurrencia del
proceso, producto del empleo de una metodología inadecuada de
tinción, la cual no permitió apreciar las estructuras fúngicas, si se pudo
obtener suficiente información que involucra directamente la presencia
de micorrización con los efectos (positivos o no) encontrados en las
plantas inoculadas; constituyendo resultados de gran importancia en los
estudios de inoculación de plantas bajo estas condiciones, si tenemos en
cuenta que se trabajó con plantas completas utilizando como propágulo
fúngico clamidosporas germinadas, hecho que hasta el momento se
consideraba prácticamente imposible.

61
 Tarea 05.

Inoculación con HMA de vitroplantas de papa en fase de

adaptación.

En la figura 1 se muestran las plantas de papa en fase adaptativa

inoculadas con HMA sobre dos sustratos nutricionalmente diferentes.

Figura 1. Plantas de papa inoculadas con diferentes cepas y concentrados de especies

de HMA sobre dos sustratos diferentes.

Para el procesamiento de la información se procedió primeramente a

realizar Análisis Multivariados de Componentes Principales y de
Conglomerado Jerárquico de Ligamento Completo (Cluster), con el
objetivo de valorar integralmente las diferentes combinaciones de los
factores en estudio (3 cepas de HMA, 2 concentrados de especies de
HMA nativas y 2 sustratos) y agruparlos en función de sus efectos.
La aplicación del método de Componentes Principales permitió definir
cuales de las variables estudiadas estaban más relacionadas con el
comportamiento diferenciado de los tratamientos.
Al realizar el análisis de Componentes Principales se encontraron dos
componentes que explicaron un 43.8 y un 20.2 % de la variabilidad
total, respectivamente (Tabla 1), para una varianza acumulada de 64,09
%.

Tabla 1. Representación de los valores propios y la varianza explicada.

Componen Valor Varianza explicada Varianza
tes propio (%) acumulada (%)
1 5.27 43.85 43.85
2 2.43 20.23 64.09

62
Al observar la tabla 2 puede apreciarse las variables que mayores
coeficientes de correlación mostraron con las componentes.
La primera componente está caracterizada fundamentalmente por las
siguientes variables: Colonización, Densidad Visual, Tasa fotosintética,
Eficiencia en el uso del agua (EUA) y el contenido de Magnesio foliar;
mientras que la segunda se encuentra relacionada con el
comportamiento de las plantas de papa en las variables Masa seca total
y contenido de Manganeso foliar.
El hecho de que estas variables presenten coeficientes de correlación
significativos indica que las mismas se encuentran estrechamente
relacionadas entre sí.
Resulta interesante destacar que, en este caso, se encuentran incluidas
tanto variables directamente relacionadas con la inoculación y el
funcionamiento micorrízico, como variables dependientes de la
inoculación e indicativas del crecimiento y del estado nutricional y
fisiológico de las plantas.
En las representaciones gráficas (Figs. 2 y 3) obtenidas a partir de la
aplicación de ambos métodos puede apreciarse la formación de siete
grupos (A, B, C, D, E, F y G).

Tabla 2. Correlaciones entre las variables iniciales y las dos primeras

componentes.

Variables Componente 1 Componente 2

Masa seca total (g) 0.5765 0.6034
Colonización (%) 0.8001 -0.3481
Densidad Visual (%) 0.8875 -0.2354
asa Fotosintética (µmolCO2.m-2.s-1) 0.8210 -0.3239
Transpiración (µmolH2O.m-2.s-1) 0.2103 0.2023
Eficiencia uso agua (%) 0.7544 -0.4693
Potasio (%) 0.6515 0.4992
Fósforo (%) 0.4818 -0.4801
Calcio (%) 0.5940 0.5643
Magnesio (%) 0.7832 0.1544
Manganeso (ppm) 0.5978 0.6764
Zinc (ppm) 0.4841 0.4920

Los grupos se irán comentando de acuerdo con los valores obtenidos por
estos en cada componente, teniendo en cuenta la mayor importancia de
la componente 1, partiendo de los mayores valores. Las letras dadas a
cada grupo fueron el resultado del orden de aparición de estos, a partir
del análisis del Cluster (Fig. 11).
Primeramente se encuentra el grupo F seguido por el C, integrados por
los tratamientos inoculados con las cepas G. intraradices y G.
fasciculatum sobre el sustrato Sunshine # 3, respectivamente, situados
en el extremo derecho del cuadrante positivo.

63
Cercano a estos se destaca el grupo A el cual incluye los tratamientos 4
y 5 inoculados con los concentrados de especies de Selva y Desierto,
ambos sobre el sustrato 1, así como al tratamiento 8 producto de la
inoculación de la cepa G. fasciculatum sobre el sustrato 2, compuesto
este por una combinación de la mezcla Sunshine # 3 + vermiculita en
proporción 2:1.
1

2
F 3
6 3
1.5 6
10
10
C2 1 G
12
12 B C
A
0.5 9
9
Factor 2

2
4 2
4
0 5
11
11 5 8
8
-0.5

-1 D
E 11
7
-1.5 7
C1
-2
-2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5

Factor 1

Figura 2. Representación gráfica del efecto de la inoculación con diferentes cepas de

HMA en dos sustratos sobre plántulas de papa según los métodos de
Componentes Principales y Conglomerado Jerárquico.
A (Selva - S1, Desierto - S1 y G. fasciculatum - S2); B (G. intraradices - S2, Selva - S2 y
Desierto - S2); C (G. fasciculatum - S1); D (G. clarum - S1); E (G. clarum - S2); F (G. clarum -
S1) y G (Control -S1 y Control - S2)
S1: Sustrato 1 (Sunshine # 3)
S2: Sustrato 2 (Sunshine # 3 + Vermiculita (2:1)

Luego se encuentra el grupo B compuesto por la cepa G. intraradices (9)

y los concentrados de especies de Selva y Desierto (10 y 11), todos
sobre el sustrato 2.
Por otra parte se hallan los grupos D y E compuestos por la cepa G.
clarum en los sustratos 1 y 2, respectivamente.

64
Finalmente, y bastante alejado del resto de los grupos se ubica el grupo
G, compuesto por los tratamientos controles en ambos sustratos.

Cluster Análisis
5,5

5,0
Distancias entre individuos

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0
12 6 3 7 11 10 9 8 5 4 2 1

Figura 3. Representación diagramática del Conglomerado Jerárquico de Ligamento

Completo (Cluster) empleado para agrupar los diferentes tratamientos.

En el análisis multivariado se pudo apreciar, un marcado efecto positivo

de la inoculación micorrízica sobre las plántulas de papa, donde se
destacan los tratamientos en los que se emplearon las cepas G.
intraradices y G. fasciculatum en el sustrato 1 (Grupos F y C,
respectivamente), como los de mejores comportamientos, siendo
importante señalar que la inoculación con hongos micorrízicos presentó
los mayores efectos cuando las plantas crecieron en este sustrato.
Un comportamiento interesante fue el mostrado por la cepa G.
fasciculatum, la cual además de ejercer sus mayores efectos sobre las
plantas que se desarrollaron en el sustrato 1, presentó también un buen
comportamiento en el sustrato 2 (Grupo A - 8 -).
En la tabla 3 se recogen los valores medios de cada una de las variables
estudiadas en los grupos formados a partir de la aplicación del Cluster.
En la misma se observan que los mayores valores de las variables más
correlacionadas con la primera componente se encuentran en los grupos
F, C y A.

65
Al analizar esta información se observa, primeramente, el
comportamiento de los porcentajes de Colonización y de Densidad
Visual, variables que evalúan el funcionamiento fúngico de la asociación,
así como de las variables fisiológicas Tasa fotosintética y EUA, del
porcentaje de Magnesio y de la Masa seca total, donde todas evidencian
el efecto positivo de la inoculación micorrízica al presentar siempre los
tratamientos micorrizados (grupos A, B, C, D, E y F) valores más altos
que los controles (G).
Además de los Análisis Multivariados se realizaron Análisis de Varianza a
las variables que mostraron mayores coeficientes de correlación con las
componentes y consecuentemente estaban más relacionadas entre si,
los cuales corroboraron, en sentido general, los análisis previos
realizados y dejaron claro el efecto diferenciado de las cepas y los
sustratos, así como de la interacción entre ambos factores.
En la figura 4 se puede observar como el porcentaje de Densidad Visual
no solo logró diferenciar mejor el efecto de los sustratos que el
porcentaje de Colonización, sino que también el ordenamiento de los
mejores tratamientos en base a la docimación (G. intraradices - S1, G.
fasciculatum - S1 y S2 y concentrado de Selva - S1) mostró mayor
similitud con el realizado por el Análisis Multivariado, que el obtenido en
base al porcentaje de Colonización (G. fasciculatum - S2, concentrado
de Selva - S1 y G. intraradices - S1).

Tabla 3. Valores medios de las variables estudiadas en los grupos formados a partir
de la aplicación del método de Conglomerado Jerárquico de Ligamento Completo
(Cluster).

Mn
G M.S. T Col. D.V E.U.A K P Ca Mg Zn
T. F T (ppm
(g) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (ppm)
)

A 1.156 38.43 5.69 8.36 0.0040 0.0019 2.16 0.092 0.40 0.31 64.6 102.9

B 1.46 35.05 4.77 7.01 0.0040 0.0017 1.88 0.052 0.28 0.27 65.0 164.5

C 1.35 36.27 5.80 10.19 0.0052 0.0019 2.12 0.131 0.47 0.30 75.1 103.7

D 1.012 33.83 4.79 9.10 0.0039 0.0023 1.75 0.127 0.29 0.25 57.5 72.5

E 0.53 36.86 5.73 7.41 0.0040 0.0018 1.56 0.089 0.22 0.25 42.5 96.25

F 1.63 38.64 6.29 8.14 0.0043 0.0018 2.12 0.058 0.57 0.31 97.5 145.0

G 0.885 19.12 2.06 5.825 0.0041 0.0013 1.84 0.057 0.35 0.22 60.0 247.5

Leyenda: M.S.T: Masa Seca Total; Col: Colonización; D.V.: Densidad Visual;
T. F.: Tasa Fotosintética (µmolCO2.m-2.s-1); T.: Transpiración (µmolH2O.m-2.s-1);
E.U.A.: Eficiencia en el uso del agua.

66
Seguidamente se encuentran las variables fisiológicas Tasa fotosintética
y Eficiencia en el uso del agua, en las cuales el efecto de los
tratamientos también se ve reflejado (Fig. 5).
De igual forma que en las variables antes explicadas, los mayores
valores de Tasa fotosintética se encuentran en los tratamientos
inoculados, los cuales muestran respuestas diferenciadas en función de
las cepas empleadas y los sustratos y demuestra, a su vez, el efecto
positivo de la micorrización sobre el estado fisiológico de las plantas de
papa.
Se destacan nuevamente los tratamientos antes presentados como los
que mayores valores alcanzan en esta variable y es en este caso el
tratamiento 2 (G. fasciculatum - S1) el que presenta el mayor valor.
En el caso de la variable EUA no se observan grandes diferencias entre
los diferentes tratamientos, sin embargo los valores de los mismos si
son superiores a los de los controles en ambos sustratos.
Esto puede verse con mayor claridad representado en la figura 5, en la
cual también puede observarse que en ambas variables se graficaron los
factores por separado al no encontrarse diferencias significativas en el
análisis de la interacción. Asimismo, se encontró un marcado efecto del
factor sustrato, obteniéndose, en el caso del sustrato 1, un
comportamiento significativamente superior al observado en el sustrato
2.
De igual forma, el contenido de Magnesio foliar (%) también reflejó el
comportamiento diferenciado de los tratamientos (Fig. 6) y manifestó
efectos significativos en la interacción de los factores cepas x sustratos.
Los mayores contenidos estuvieron asociados nuevamente con los
tratamientos en los que se emplearon las cepas G. intraradices y G.
fasciculatum en el sustrato 1y G. fasciculatum conjuntamente con el
concentrado de especies de Selva en el sustrato 2.
Por otra parte se hace referencia a la Masa seca total (Fig. 2), no solo
por ser una de las variables que mayores coeficientes de correlación
alcanzó en la segunda componente, aunque presentó un
comportamiento relativamente homogéneo en ambas (Tabla 2), sino por
ser la variable que mejor representa el alcance positivo que tiene el
empleo de los inoculantes micorrízicos sobre el desarrollo morfológico de
las mismas.
De forma general, se observó un efecto positivo y diferenciado de la
inoculación micorrízica sobre esta variable, presentando los tratamientos
inoculados un comportamiento superior a los testigos. Los mejores
tratamientos estuvieron coincidentemente asociados a la inoculación del
concentrado de Selva en el sustrato 2 y de G. intraradices y G.
fasciculatum en el sustrato 1.
A pesar que esta variable no presentó coeficientes de correlación del
nivel del resto de las anteriormente analizadas, si manifestó un

67
comportamiento similar en cuanto a las cepas o concentrados de
especies que originaron los mayores valores.
Como consecuencia de la integración de los Métodos Multivariados y de
los Análisis de Varianza (ANOVA) realizados a las variables que mayor
influencia ejercieron sobre la conducta de los tratamientos, se obtuvo
que las cepas y los concentrados de especies empleados se comportaron
de la siguiente forma: G. intraradices - S1 > G fasciculatum - S1 > G.
fasciculatum - S2 y concentrados de especies de Selva y de Desierto
ambos en el sustrato 1.

68
 Colonización
(%)
A
45 a
b ab
40 c c c
cd de
35 e e
30
25
20
15 g f
10
5
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Sustrato 1 Sustrato 2

Densidad Visual B
(%)
1.4
a
1.2 b
b b
1
c cd cde de
0.8 ef
f
0.6
0.4
g g
0.2
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Sustrato 1 Sustrato 2

Leyenda: 1 y 7: G. clarum; 2 y 8: G. fasciculatum; 3 y 9: G. intraradices; 4 y 10: Selva; 5 y 11: Desierto y 6 y

12: Controles.
Sustrato 1: Sunshine # 3
Sustrato 2: Sunshine # 3 + Vermiculita (2:1)
Barras con letras desiguales difieren entre si significativamente para p≤ 0.05 según Test de
Rangos Múltiples de Duncan.

Figura 4. Efecto de la aplicación de diferentes inoculantes micorrízicos y sustratos sobre

plántulas de papa expresado en las variables fúngicas Porcentaje de
Colonización (A) y de Densidad Visual (B).

69
 Tasa Fotosintética A
(umol CO2. m-2.s-1)
10 a
9 ab ab
b b
8 a
10
7 c b
6 8
5 6
4
3 4
2 2
1
0
0
Sustrato 1 Sustrato 2
G. fasc.
G. clar.

G. intr.

Cont.
Selva

Des.

Eficiencia en el uso del agua

B
(%)
0.0025
a a
0.002 a a a 0.002 a
0.0019
0.0015 b
0.0018 b
0.001 0.0017
0.0016
0.0005
0.0015
Sustrato 1 Sustrato 2
0
G. clar.

G. fasc.

G. intr.

Cont.
Selva

Des.

Leyenda: G. clar.=G. clarum; G. fasc.= G. fasciculatum; G. intr.= G. intraradices; Des.= Desierto y

Cont.= Control.
Sustrato 1: Sunshine # 3
Sustrato 2: Sunshine # 3 + Vermiculita (2:1)
Barras con letras desiguales difieren entre si significativamente para p≤ 0.05 según Test de
Rangos Múltiples de Duncan.

Figura 5. Efecto de la aplicación de diferentes inoculantes micorrízicos y sustratos sobre plántulas

de papa expresado en las variables fisiológicas Tasa fotosintética (A) y Eficiencia en el
uso del agua (B).

70
 Magnesio A
(%)
(%)
0.35 a a
ab ab
0.3 bc bc bc c
cd cd cd
0.25 d
0.2
0.15
0.1
0.05
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Sustrato 1 Sustrato 2

Masa seca total

B
(g)
2 a
b
1.5 c c
d d d
e e e
1 f
g
0.5

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Sustrato 1 Sustrato 2

Leyenda: 1 y 7: G. clarum; 2 y 8: G. fasciculatum; 3 y 9: G. intraradices; 4 y 10: Selva; 5 y 11:

Desierto y 6 y 12: Controles.
Sustrato 1: Sunshine # 3
Sustrato 2: Sunshine # 3 + Vermiculita (2:1)
Barras con letras desiguales difieren entre si significativamente para p≤ 0.05 según
Test de Rangos Múltiples de Duncan.
Figura 6. Efecto de la aplicación de diferentes inoculantes micorrízicos y sustratos sobre
plántulas de papa expresado en el porcentaje de Magnesio (A) y la Masa seca
foliar (B).

71
La introducción de hongos micorrizógenos arbusculares como inoculante
en la fase adaptativa de la micropropagación de plantas ha tomado auge
en los últimos años, involucrando un gran número de cultivos de interés
económico (Fortin y col., 2002).
Sin embargo, no abundan los trabajos en los que se incluyan mediciones
de tasa fotosintética y otras variables fisiológicas para evaluar la
respuesta de las plantas a la micorrización en este estadio, así como
tampoco se reportan estudios que empleen diferentes combinaciones de
cepas, concentrados de especies y/o sustratos con este enfoque y que
además se refieran a este cultivo en particular.
En este estudio se presentan claramente dos aspectos fundamentales y
de marcado interés: (1) la interacción cepas ó concentrados de especies
- sustratos y (2) el efecto diferenciado de la cepas sobre el crecimiento
y desarrollo de las plantas
Desde el punto de vista de un manejo eficiente de los HMA en esta y en
cualquiera de sus otras aplicaciones, uno de los aspectos decisivos
resulta la dependencia que existe entre la eficiencia de los hongos
micorrizógenos y la riqueza nutricional del sustrato, definida por sus
componentes.
La mezcla de turba de musgo Sunshine # 3 es muy utilizada en
numerosos países como México para realizar la adaptación de
vitroplantas de gran variedad de cultivos como la papa, la fresa, el
agave, el chile, etc. Esta mezcla posee un tamaño de fibra pequeño y
contiene una carga media de fertilizantes, además de cal dolomítica la
cual provee de calcio y magnesio y yeso como servidor de azufre y
calcio.
Indiscutiblemente, el empleo de este sustrato permitió no solo el exitoso
desarrollo y establecimiento de la asociación micorrízica, expresado en
cada una de las variables estudiadas, sino que también garantizó,
conjuntamente con la micorrización, el adecuado crecimiento y
adaptación de las plántulas.
La efectividad de las cepas está indisolublemente ligada a la riqueza del
sustrato, por lo que el hecho que las cepas presentaran un mayor efecto
en los tratamientos sin vermiculita sugiere o indica que la disminución
de los nutrientes provocada por la mezcla con este sustrato limitó en
alguna medida el suministro de nutrientes para las plantas micorrizadas,
originando un comportamiento diferenciado de las cepas en función del
sustrato empleado: Glomus intraradices (sustrato 1) > G. fasciculatum
(sustrato 1) > G. fasciculatum (sustrato 2) > Concentrado de especies de
Selva y Desierto (sustrato 1).
De forma general, la micorrización resulta eficiente cuando las plantas
se desarrollan en condiciones de suministro subóptimo de nutrientes con
respecto a plantas no micorrizadas (Harley y Smith, 1983, Fernández,
1999 y Sánchez, 2001), de manera que exista una ganancia neta para la

72
planta con esta asociación y que la energía y productos del metabolismo
de la planta que son utilizados para el desarrollo de la micorriza, sean
largamente retribuidos a través de los incrementos en absorción y en la
tasa de crecimiento neto (Marschner y Dell, 1994; Smith y col., 1994).
Estudios previos realizados por Fernández (1999) y Sánchez (2001) en
posturas de cafeto sobre la respuesta a la inoculación con variadas
cepas de HMA en diferentes tipos de suelos, permitió establecer la
existencia de una alta dependencia entre la efectividad y eficiencia de la
micorrización y la riqueza del sustrato, definida en ese caso por el tipo
de suelo y su fertilidad asociada, así como por la relación suelo / abono
orgánico utilizada para conformar los sustratos. Aunque los trabajos
realizados por estos autores estuvieron enfocados a posturas de cafeto,
no cabe duda que la ocurrencia de este fenómeno es extensiva para
cualquiera de los sistemas de cultivo empleados.
Al respecto han sido publicados algunos trabajos en los cuales se
estudió el efecto de diferentes sustratos sobre el desarrollo de la
micorrización en plántulas micropropagadas en estadio adaptativo, como
los de Noval y col. (1995 y 1997), quienes estudiaron el desarrollo de
vitroplantas de piña y banano respectivamente, encontrando un
comportamiento diferenciado de las cepas frente a los diferentes
sustratos, así como variadas respuestas de las plantas en función de los
contenidos nutricionales de estos.
En cuanto al comportamiento de las cepas se destacan G. intraradices y
G. fasciculatum por su mayor efecto sobre el desarrollo integral de las
plantas de papa, no obstante, el empleo de concentrados de especies
también originó efectos positivos, aunque inferiores a los encontrados
con la inoculación de cepas individuales, lo cual puede estar relacionado,
no solo con la concentración de propágulos, sino también con la
capacidad de adaptación de las diferentes cepas a nuevos ambientes,
así como con las relaciones de competencia que pueden establecerse
entre ellas.
Dentro de las especies pertenecientes al Orden Glomales existen
marcadas diferencias en cuanto a su distribución en los ecosistemas y a
la eficiencia de sus mecanismos de colonización (Sieverding, 1991).
Precisamente, las especies pertenecientes al género Glomus poseen de
manera general un amplio rango de distribución funcional,
predominando en ecosistemas de alta y media fertilidad en los cuales
resultan extremadamente eficientes y competitivas (Barros, 1987 y
Sieverding, 1991).
Según Duc y col. (1989) y Vierheilig (2001) en las paredes celulares de
sus esporas e hifas se encuentra con relativa abundancia el compuesto
1, 3 β Glucano, similar a como ocurre en grupos de hongos más
evolucionados, el cual, al ser reconocido, es hidrolizado por
determinadas enzimas de las plantas, las que pueden activar y acelerar

73
sus mecanismos de germinación y crecimiento, provocando una rápida
colonización radical, todo lo cual le confiere una mayor ventaja y rapidez
en los mecanismos de infección sobre los otros integrantes del orden al
cual pertenecen. En las otras familias que lo componen no se presenta
con tanta claridad este fenómeno debido a la falta o escasez de este
compuesto en sus paredes celulares, por lo que los mecanismos de
colonización son, por lo general, más lentos y dependen en mayor grado
de los procesos químico - biológicos normales del suelo (Gianinazzi -
Pearson y col., 1993).
En estudios realizados en posturas de cafeto por Fernández (1999) y
Sánchez (2001) sobre diferentes tipos de suelos y combinaciones de
sustratos empleando gran número de cepas de HMA se encontró,
igualmente, que en cualquiera de los suelos estudiados los mejores
efectos sobre el crecimiento de las plantas estuvieron relacionados con
cepas pertenecientes al género Glomus.
Al respecto se pronunciaron Dodd y Thompson (1994) al plantear que la
respuesta a la inoculación es dependiente no sólo de la infectividad y
eficiencia de la cepa aplicada, sino que además es consecuencia de la
existencia y cantidad de propágulos de la misma.
Resultados similares fueron reportados por Fernández (1999) al inocular
posturas de cafeto con concentrados de especies nativas y cepas
independientes y comparar su efecto sobre el crecimiento y desarrollo de
las plantas, encontrando en todos los casos un mayor efecto de las
cepas individuales respecto a los concentrados.
Por otra parte, las variables fúngicas de porcentajes de Colonización y
de Densidad Visual reflejaron ampliamente el comportamiento
micorrízico, no obstante, la segunda logró realizar una mejor
diferenciación del efecto de los sustratos, lo cual resulta lógico si
tenemos en cuenta que la colonización cuantifica solamente la presencia
del hongo en la raíz y no la intensidad de la misma.
Sobre este aspecto se han referido pocos autores como Herrera y col.
(1995); Fernández (1999); Sánchez (2001) y Hart y Reader (2002),
pero todos coinciden en que la Densidad Visual expresa la intensidad
infectiva del simbionte tomando en consideración niveles visuales de
ocupación fúngica en el interior radical, a diferencia del porcentaje de
Colonización que solo tiene en cuenta la presencia del simbionte.
Resulta de gran importancia el papel que pueden jugar estos
microorganismos sobre el estado fisiológico y nutricional de las plantas
colonizadas (Varma y Schuepp, 1994; Cordier y col., 1996; Dolcet - San
Juan y col., 1996; Davies y col., 2000 y Yao y col., 2002).
Su impacto en este sistema de cultivo responde a su capacidad de
colonizar ampliamente el sistema radical, participando activamente en la
absorción de los diferentes nutrientes (macro y micronutrientes) y el
agua.

74
Según Barea y col. (1991) y Smith y Read (1997), por cada metro de
raíz colonizada se producen entre 7 y 250 metros de hifas externas de
hongos micorrizógenos arbusculares, dependiendo de la especie
implicada y de las condiciones de crecimiento.
El micelio extramatrical ha mostrado ser capaz de captar muy
eficazmente agua y nutrientes (George y col., 1995), en especial fósforo
(Jakobsen, 1995 y Carreón y col., 2000), nitrógeno (Tobar y col., 1994 y
Ruiz, 2001), y actualmente se reconoce el efecto directo de las
micorrizas sobre la absorción de prácticamente todos los elementos
esenciales minerales (George 2000), a partir de estructuras captadoras
de nutrimentos muy similares a los arbúsculos intraradicales (Bago y
col., 2000).
En este caso, en particular, la micorrización eficiente de las plantas de
papa provocó incrementos en las variables fisiológicas estudiadas
producto, no solo de una mayor absorción del fósforo y otros nutrientes,
sino también por incrementar la fortaleza de la raíz y del sistema aéreo
como sitios de consumo y garantizar una mayor absorción y retención
del agua en los tejidos de las plántulas inoculadas.
En consecuencia se han manifestado algunos autores, quienes aseguran
que la micorrización de los sistemas radicales de las plantas tiene un
efecto positivo sobre la asimilación del carbono (Schwob y col., 1998;
Wright y col., 1998), especialmente bajo condiciones de estrés (Sánchez
- Díaz y col., 1990 y Shrestha y col., 1995).
Primeramente, existen evidencias de que la fotosíntesis puede ser
regulada por la fortaleza de los sumideros o sitios de consumo como
determinadas estructuras de almacén, frutos u otros órganos (Wright y
col., 1998 y Douds y col., 2000).
Un segundo mecanismo puede ser a través de incrementos en la
nutrición de la planta, mediante lo cual el hongo puede incrementar la
tasa fotosintética de su hospedero.En relación con el fósforo
específicamente, se plantea que los niveles de Pi citoplasmático en la
hojas regulan la exportación del carbono y por lo tanto la fotosíntesis, a
través del translocador de triosa - P / Pi que se encuentra en la
membrana cloroplástica. Los bajos niveles de Pi permiten reconstituir el
almidón en los cloroplastos, lo cual puede disminuir la tasa fotosintética
(Douds y col., 2000).

75
Por otra parte, las relaciones con el agua también pueden verse
afectadas a causa de la colonización micorrízica, al presentar, las
plantas micorrizadas, mayores valores de conductancia estomática y de
potencial de agua de las hojas bajo condiciones de estrés. Las hifas son
capaces de absorber agua a potenciales más bajos que los pelos
radicales lo que provoca una mayor absorción del agua y por tanto, que
las plantas micorrizadas tengan mayores tasas fotosintéticas y
contenidos de agua que las no micorrizadas.

Los mecanismos involucrados aún no están totalmente dilucidados, no

obstante las hipótesis elaboradas al respecto relacionan diferentes
aspectos como: efectos indirectos a partir de incrementos en la
absorción de P; aumentos en la toma de agua a través de los sistemas
micorrizados, ya sea por incrementos en la conductividad hidráulica de
la raíz o por variación de su arquitectura; modificaciones bioquímicas en
la regulación del agua en la planta hospedera por cambios en las
señales hormonales o una inducción de respuestas osmorreguladoras de
las plantas inoculadas comparadas con los controles (Hernández -
Sebastia y col., 1999).
En un trabajo similar al aquí presentado empleando vitroplantas de
guayaba micorrizadas, se concluyó que la tasa fotosintética de las
plantas inoculadas incrementó como consecuencia de su estado
nutricional, refiriendo además, que el incremento pudo haber ocurrido
independientemente de los niveles de fósforo (Douds y col., 2000).
De igual forma, obtuvieron que los mayores valores de masas secas
foliares, radicales y de los tallos estaban relacionados con los
tratamientos inoculados, que además mostraron las mayores tasas
fotosintéticas, así como un mejor estado nutricional, expresado en un
aumento de la absorción de P, Mg, Cu y Mo con relación a los controles.
Por otra parte y coincidiendo con este trabajo se encuentra el realizado
por Valencia y col. (2000), quienes evaluaron la influencia de Glomus
fasciculatum sobre el intercambio de gases y la calidad de los tubérculos
de plantas de papa (Variedad Alfa) en condiciones de campo.
Estos autores reportaron marcados incrementos de las plantas
micorrizadas con respecto a sus homólogas en cuanto a la masa seca
total, el número de tallos, la tasa fotosintética, la eficiencia en el uso del
agua y el rendimiento.
Los primeros trabajos sobre el estudio de la simbiosis micorrízica y sus
efectos nutricionales sobre las plantas, estaban enfocados
principalmente al fósforo como elemento fundamental involucrado en el
intercambio de nutrientes entre ambos simbiontes (George, 2000), sin
embargo fue demostrado por trabajos subsecuentes que producto de la
micorrización ocurren efectos directos sobre la nutrición de
prácticamente el resto de los elementos minerales esenciales,

76
beneficiándose otros elementos como el K, N, Ca, Mg, Mn, Zn, Cu, Cd,
Fe y Mo (Marschner y Dell, 1994; George y col., 1995; Jakobsen, 1995 y
Smith y Read, 1997).
Diferentes estudios relacionados con la aplicación de hongos
micorrizógenos arbusculares en la fase de adaptación de vitroplantas se
han referido a este tema en particular, destacando el efecto positivo de
la inoculación sobre la absorción de nutrientes.

77
CONCLUSIONES.

Tarea 01.

™ Se obtiene por primera vez en el mundo un inoculante

micorrizógeno de Glomus fasciculatum y Glomus clarum en
soporte líquido con una viabilidad demostrada de 8 meses de
almacenamiento.

™ Los propágulos fúngicos presentes en los inoculantes líquidos

estudiados mantuvieron su capacidad germinativa y su capacidad
colonizadoras de plantas, después de 8 meses de incubación.

™ El medio líquido micorrizógeno puede mezclarse a altas

concentraciones con el complejo 20-6-6 (NPK) sin pérdida
significativa de la viabilidad de las esporas. Las mezclas con los
complejos 10-40-10 y 18-18-18 sin bien pueden inducir mayores
pérdidas de viabilidad de las esporas, ésta permanece a niveles
aceptables y en mezclas más diluidas no cabría esperar la
ocurrencia de estos comportamientos.

™ Se encontró una marcada autofluorescencia en la especie Glomus

clarum a partir de la excitación, no sólo a la longitud de onda de
480 nm, sino que por primera se informa excitación en la zona del
ultravioleta (280 nm) y en la luz roja (690 nm).

™ Se cuenta con una antisuero específico para la detección de

Glomus clarum mediante la metodología de ELISA

™ La reacción del antisuero desarrollado contra Glomus clarum

resultó mucho más intensa con valores indeterminados de
absorbancia. A partir de 1/1000 y hasta la dilución 1/3000 el
antisuero policlonal solo reconoció las esporas de esta especie, sin
que se evidenciaran reacciones cruzadas con las otras especies de
Glomus estudiadas.
.

Tarea 02.

™ La desinfección de esporas de Glomus clarum con Cloramina T

(2%) y Cefalexina (200 mg.ml-1) en medio Agar Agua y en
tiempos de exposición de dos y seis minutos fue efectiva, no solo
para el control de la contaminación microbiana, alcanzando

78
 valores de 3.3 y 3.2 % de contaminación respectivamente, sino
también para garantizar la germinación de las esporas, aunque
con porcentajes de solo 44.0 y 44.6 % a los 25 días de
incubación.

™ La incubación de las esporas previamente desinfectadas en

atmósfera de CO2 (5%) posibilitó la rápida y homogénea
germinación de las mismas, garantizando el 100 % de las esporas
germinadas y asépticas en solo tres días de incubación, listas para
ser empleadas en los estudios de inoculación de plantas en
condiciones in vitro.

™ Las variables Germinación (%) y Contaminación (%) mostraron

una relación inversa en su comportamiento presentando
coeficientes de determinación superiores a 0.95***, lo cual indicó
una dependencia altamente significativa entre ambas.

Tarea 03 y 05.

™ El nuevo medio de cultivo (N) diseñado como soporte para el

cultivo dual, no satisfizo las necesidades nutricionales de las
plántulas de papa, las cuales mostraron serias afecciones
relacionadas con su crecimiento, sin embargo posibilitó el
establecimiento de la colonización micorrízica.

™ El efecto depresivo provocado por el medio N fue más intenso en

los casos de las plantas inoculadas, lo cual indica un incipiente
proceso de reconocimiento simbiótico afectado por la escasez de
nutrientes, puesto de manifiesto a partir de un crecimiento
atrofiado y poco armónico y cambios sustanciales en el coloración
de las hojas que se tornaron purpúreas.

™ Las plántulas de papa inoculadas y desarrolladas sobre el medio

de cultivo Mínimo (M) reflejaron el efecto positivo de la inoculación
micorrízica, llegando a alcanzar valores, en las variables
estudiadas, similares estadísticamente a los de las plantas
controles cultivadas sobre medio Murashige & Skoog (MS).

Tarea 05.

™ En los estudios de inoculación post in vitro las plantas de papa

mostraron una alta respuesta a la inoculación con las diferentes
cepas y los concentrados de especies de HMA, dependiente de los

79
 sustratos empleados, siendo los mejores tratamientos los
siguientes: G. intraradices y G fasciculatum, en el sustrato 1,
seguidos por G. fasciculatum en el sustrato 2 y los concentrados
de especies de Selva y de Desierto ambos en el sustrato 1.

™ Los Análisis Multivariados de Componentes Principales y de Cluster

permitieron definir dos componentes que explicaban en un 64,09
% la variabilidad total del experimento, estando caracterizada la
primera componente por las siguientes variables: Colonización,
Densidad Visual, Tasa Fotosintética, EUA y contenido de Magnesio
foliar y la segunda por: Masa seca foliar y contenido de
Manganeso foliar.

™ El efecto positivo de la inoculación micorrízica se expresó, no solo

a través de incrementos en las variables fúngicas Colonización y
Densidad Visual, sino que también se reflejó en el resto de las
variables estudiadas, demostrando la factibilidad del uso de la
micorrización en esta etapa de la micropropagación del cultivo de
la papa.

80
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS DEL PROYECTO

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