!

"# $ %
 !" # !$% &

'& % () * &
" & ' ( ' )
' ' *# & " * '
' + "
#

& ( + ! * ( !" , &

# '
' ' ( ' , * ,
' ' ' '
* , * * *#

+ " & )
' ) +
) # , ' &
) ' * $ ' ", * "
( ' ,!! , + ) ,
' ( ) -./ 012, ' (
15
* -.1 .1 33 14 ' ( ) 0
$ ) & ) ' (
$ $ ' 6 $
* , *, " '
' ) 7809, '
' ) & : & '
# * '
* ' (
* , ( '
: * & * ' ' , ,
, & & * ' ' ,
* ; $ 6 * & , ,
' 6
, * ' , ' &
* ' , " (
7 * , ( , ' , '

1 + # ',
& ) ' ( * '
) '

-& %
) . ( " ! /# &
& $ # 6 &
# < *+ ' '
' ' " $
' )

-&
'0 ( % ( ! %% % 1 2&
 # , " + <; ,
' 6 $ # <; *

3) '4 <;

$ <; * 6 ' '

# * ' 6 + * ' ,
' '

-& " (( . ( ( &

) ' * ' # <;
=7>7 91
67951,=1> 1 70 6795/,=/> ?,
81 6795@ =0> AA9679577 "
& ' * , *
& ' ' 6 $
' * < ' ) , * * "
' ) ' ' ) ' ) *
' ) , ) ' ,
& , # 6 * * " &
'
, ' <; " .0B,./B5,.1B115,
.B/5 B05

-&
- %5 &
# .0B ) ,- 1.1 C1.13 * ",
' # ' ' " ' )
' '$ " ' 7/9D 70AD
* " ' '

E( $ , - 1.1 C1.13
6 ' & - ,'
( * , 6 ' ,
' & ' * ' ' ' )
' )
, ' ' ' ' # F9D
" ) A9G "

-&
6 !" , ( ! %
. &
 <; ' " * & ,
' * ), "
# ) 7 7, ( ' ) ' ( '
' *
*2 2 B05 *B/5
/2
2 B05 B5
<; " 6 ' ) ' & &
, $ ' & &
' $ ) ,
* ' " ' ( $ ,
( & )
" $ "
) = B ' ' ( ' <; '
' * ), & & ' '
' B05 #
2
2 B05 B 50 2
= B > H B 50 2I
H 2IHB05I

%* 7 8
*2 1 7 679@
*12 0 8679F
12
A967979
12
? 1 6797/
12
% 1 7 67970
- 12 0 1 6797F
12
? / 6797F
/2
7 / 6797?
/ '4 ) ' ( '

-&
9 ( ( " %%
) &
6 * 199 ' *# & *
' # <; *
*# & &
# " ' )
, ' ( & '
) " " 795? 795@
* ; ' #
) " ' # )
& ' * , * ' &
' ' # $ '
5 15
.13 2 .1! .! 2 ./32 =7 > A6795@
J(
15 /5
.13 2 .! ! 2 ./32. =1 > 1 F 679571
(

3 $" & # (*
, * ; ' K
#
' ( # * ;,* ( ,
.1! 5 < ,' # (
'. @ # ' & ' .!-15 '
# . ' & " , ' ( 6
# , & ) ( ' * 6
<; , ) " " )
5
! 2 .B/5 .! 15
2 B15
J(
* ; ' ( (
# ,' ) '
) '
: ) * ; & '
' ' * ) '
,& , & ' '#
' ' * ;, "

-* ; *

-&
: ) 5 ( %%
) * &
12
A99 999A99 ) <; 99799 '. 799
' 99,7A9,1A9,A99,?99 <;

'& 4
12
' > 5 *H I > 5 *H
999A99I > 1 /

& ( '9& ! ( &

H 12
I> " 12
CH 12
I K " <; CH <; ])
12
L 2" <;
12
H I > A99 C999A99 K 7A9 C99799 > 7 A0 6795/
A99 2 7A9

' > 5 *7 A0 6795/ > 1 F7

-& ( 9& ! ( 1"% & ;) 5 2&

H 12I

= BM> = B Cα > H B15I

H 12IH
BM I
= B > A967979
< " α '. 799 / A67957
= B Cα > A9679 C/ A67957 > 7 @A67979
79
12
' & " B15, & &
H B15I * / / 6795/
)

H B15I > 1A9 C99799 > / / 6795/

A99 2 1A9
12
# H I>H
BNI,
7 @A67979 > / / 6795/
H 12I1
12 5/ 79 P
H I > / / 679 O7 @A679 > 0 /0 6795@

' > 5 *0 /0 6795@ > ? /?

6& ( 9 & ! ( &

12
' & " 6 <;
' (
,H B15I > HBM
I
= BM> H B15I > 7 @A67979
H 12IHBM
I
12
H I> 7 > 7 > A@7 679577
79
= BM 7 @A679

' > 5 *A@7 679577 > 7910

9& ( : & ! ( &

H B15I > A99 C999A99 > 1 1@ 6795/
A99 2 ?99

H
BMI > ?99 C99799 K A99 C999A99 > / 7F 6795/
A99 2 ?99

= BM> 1 1@ 6795/ > 7 @A67979

12
H I C/ 7F 6795/
12
H I > 0 9F 679577

' < = *0 9F 679577 > 79/8

 :& > + &
12

10

pCa
6

0 20 40 60
mL de EDTA

-& " ( %%
) &
%) * ( %&
' 6 09 ' ' )
' ) <; #
' '
12
' ( ' , '
& ' *12 - , '
' ) Q '& Q
* ) <; ) "
* ;< ' ' ),
' * ' ( * < '$
& ' ( , <;
" * ' * ' *
; ' ' , <;
& * ' ) '
) $ + ' # '
' ' '

%
) * " % &
' + ' ) &
' ( <; ' '
$ $ ' ' &
<; ) & * *
6 ) ' ) <; &
) ' , 6 <; '
) ' ) * ' * ;
& ' , )
& & ' ( *
 ' $ +
& ' ' ' '
& ' ) ' ( ,
6 <; " ) ' '

$% ( " ( " ?! %&

) ' ' , Q ) 6
) & ' ( *5 <; R 5 <;
' ( & * , * *
) '
*B15 2 12
B15 2 *12
12
< ' ) & *
) ' ) <;
$ ' '
' # &

-&
@ " ( %%
) &
' 6 $ <; ' '
) '# # , 6 ' )
# <; ' (
, ' " ' ' & "
" - , * '. '
( ' , * ' "
' " '. )
7 '. & "
* ", & " ' (
"
< # *, ,& &
<; & * ,' '
* '. @ ) *
; " ' ' &
* , & & '.
+ * " ' )
' Q * " , , *
' & ' ' ( '
( ' , ' *
' ' ) * '
, , , & , ' ;
' ( ' ' )
<;

6& / 3 +
A&
S *< ,T < - 78FF U V 6 ) W X5
.
T * E 78F1 U V 6
 ) % " 5 % ( / % &

7 <

1 Y &$ ' *
' 6 $ Z

/ Y &$ + Q '& Q *B15 *

& Z

0 Y # & , - ;Z

A Y & 6 Z

? Y $ ) Z

) % " 5 ( ")$ ( / % &

7 < 6' & ( '

' ' 6 %

1 ' ' ) <; " / FA/ * - 1.1B C1.13,'

, * 7 99 + ) ,
& 6 9/G

/ ' ' ) " /9* - 1.1B C1.13

' 6 * A999
*12 9990A7@ ) ' /1 // +
) <;

0 " 1F0 * ' )6 6

=! /A0 99F8?- Y #
' ( - 131 ' Z

A " ) 99A99 <; '

9170A* 3/
12
? 799 99799 ) <; 99799 '. 77 9
< ' 9,79,1A,A9,@A,799,7A9 199 <;
* ' " " <;
B C

B D

& E 4< ; J !- ![- < !3 B W- !3 - :- : ;J < W:

3; E

& D 4 ' 6 $

& F 4
" ' ( , $ # & )
' ( # " ) )
# ) # * ' (
& ) ' ' #
& & # $ # " $ : )
) ' ( #' ,
& ' ' '
" ' ' ) " ) '

) ) ' ( '
" ), # * * ' &
' ( " # $ "
) ' ' *
' ( * * * ' ' ' )
) # ' *
( ' , ) ' -D #6
0 $ ) -./ ' '
'
R .13 012 2 -./ R -./ .13 /12 2 .13
12
R -./ .13 / 2 -./ R -./ 1 .13 112 2 .13
12
R -./ 1 .13 1 2 -./ R -./ / .13 12 2 .13
12
R -./ / .13 2 -./ R -./ 012 2 .13

' ) ' ' ' (

& # ) *
' ( $ ' " ), ' ( *
* ' ' ' " ' 6 $
: ' #
" * & ' ' "
' # , * #
) # * , ( 6
' ) * ' ( ' & ) ' (
) 5 *
, ' ( # &
* * ) ' '
* ' & , "
* ' " ),
' ) " ' ( $ # &
 # $ , <; , # ' (
* ' # ' 6 ) $

< , .0B,' # ') #

* ' *

.0B .2 2 ./B5 =7 > 7 9967951

./B5 .2 2 .1B15 =1 > 1 7? 6795/
.1B15 .2 2 .B/5 =/ > ? 81 6795@
.B/5 .2 2 B05 =0 > AA9679577

# ' * ) "
* ' , " '
' ' ) & & "
* , <; ' ( #
12
2 .1B15 B15 2 1.2
/2
2 .1B15 B5 2 1.2
02
2 .1B15 B 2 1.2

) * ) ' ( 5 <; '

2
2 B05 B 50

& 4
$ & # ) ( ' ' *
& " ' #
$ * : ) & *
' " ) ' ( <; ,
" '. 71 - 3. *12
12
* 3. 1 ' ),
# ) ' '
# ' '. 79 -*
;
' , * , ' '
) * ' % /2
' " , ' (# -5

& 8
-* ;
) <;

'
*
>989*O , ' 6 1AG
\ > 7 78*O , ' 6 /@G

& F
7 ) ' ) 7 ,'
' 6 ) 97 * 6 7 999 * 3/ ' ) , * * *
* . 7 7 * * , " ' ,
) ; " " < 7
* " * ' * * ) W
'
1 ) <; J # ' ' ' ) A99 )
<; 997 % ' 6 ) 97 *
; " A99
" * ' " "
9799* * 1 * W '
/ ) * '. 79 7 < A@9 ) -./
' 989 @9* -.0 ' 6 7
0 ) -; 7 < " 9199 * -; )
' 7A A

>&
7 -3J !R ![- < 3 : ![- < <; '
'' " $ 6 199 ) ' )
751 ) * '. 8579 -./O
-.0 * * * 0
* -; ) <; " (
(" 5 '
J* "

1 < ; J !- ![- < <:J R ;3; '

'' " $ 6 A99 * '
; ' '. 8579 ) * 0 * )
-; ; ) <; " ( J*
" 6' 6' $ ''
3/

- W 6' *
7D% $ > 79 * 3/ O
7D! *$ > 79 * 3/ O
@99
7D # > 79 * 3O

G& 0
'' 3/ > * 3/ O <; 6W <; 67999

&
7 6' & ' &$ * ' ( <; ' )
' ' (
1 $ ' ' ) <;
/ Y &$ ) *
' '.> 79Z
0 A99 * ' , ' -;
<; 997 * 7F A " (
(" ' 6' * '' 3/,D%,
D! D