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“AÑO DEL DEBER CIUDADANO”

UNIVERSIDAD NACIONAL “SAN LUIS GONZAGA”


DE ICA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD
ANTIMICROBIANA IN VITRO DE LOS
EXTRACTOS ETANÓLICO E HIDROALCOHÓLICO
DE LAS SEMILLAS DE Carica papaya L. “PAPAYA”

Para obtener el título profesional de:


QUÍMICO FARMACÉUTICO

Presentado por:

Bach. PALOMINO MENDOZA, Maryori Ysabel


Bach. URIBE CANALES, Cinthia Pamela

Asesores:
Q.F. CHANG CANALES, Artemio
Q.F. KLINAR BARBUZA, Silvia
Q.F. VARGAS PONCES, Hugo

ICA – PERÚ
2007
A Dios y mi ángel por guiarme cuando
lo necesite y cuidarme siempre.

A mis padres Miguel y Rosa que


siempre me brindaron su apoyo en mi
formación hasta llegar a ser una
profesional; y a mis hermanas Regina
y Marie que me apoyaron
incondicionalmente en todo momento
de mi vida. Pamela Uribe Canales

Pamela Uribe Canales

- Al Padre Eterno y Altísimo que me


enseñó a caminar bajo su dirección
fortaleciéndome para la culminación
de este trabajo.

- A mis padres, hermano y cada miembro


de mi familia como primeros partícipes
de mi formación profesional por el
apoyo desmedido que me brindaron
para alcanzar mi meta trazada.

Maryori Palomino Mendoza


AGRADECIMIENTO

− A los asesores: Q.F. Artemio Chang Canales, Q.F. Silvia Klinar Barbuza, Q.F.

Hugo Vargas Ponce; por su guía y colaboración en el desarrollo de la tesis.

− Un agradecimiento muy especial a quienes desinteresadamente no midieron su

tiempo ni las circunstancias para brindarnos gran ayuda en la realización de este

trabajo: Blgo. Cartagena Siguas, Q.F. Rocío Córdova, Blgo. Andrés Herrera.

− A Laboratorios Fitofarma E.I.R.L. por permitirnos sus instalaciones, equipos y

materiales para el desarrollo de la parte Fitoquímica de nuestra investigación.

− Al Laboratorio de Microbiología de la facultad de Ciencias de la Universidad

Nacional de San Luis Gonzaga de Ica y al personal técnico por permitirnos la

investigación de la parte Antimicrobiana de nuestra tesis.

− A cada uno de nuestros amigos por ayudarnos amablemente en diferentes

necesidades que hallamos, desde el inicio hasta la culminación de esta

experiencia investigadora.
ÍNDICE

RESUMEN

SUMARY

INTRODUCCIÓN 1

1. GENERALIDADES 3

1.1 Aspectos botánicos de Carica papaya L. “papaya” 3

1.1.1 Historia 3

1.1.2 División taxonómica 4

1.1.3 Hábitat 6

1.1.4 Descripción 6

1.1.5 Cultivo 11

1.1.6 Usos medicinales 13

1.1.7 Otros usos 15

1.1.8 Composición química 17

1.1.9 Referencias Farmacológicas 18

1.1.10 Referencias Toxicológicas 22

1.2 Actividad antimicrobiana 24

1.2.1 Definición 24

1.2.2 Determinación de la actividad antimicrobiana 24

1.2.3 Antibiograma 24

2. MATERIALES Y MÉTODOS 25

2.1 Materiales 25

2.1.1 Del estudio fitoquímico 25


2.1.2 Del estudio antimicrobiano 27

2.2 Métodos 29

2.2.1 Del estudio fitoquímico 29

2.2.1.1 Preparación del material vegetal 29

2.2.1.2 “Screening” fitoquímico 34

2.2.1.2 Obtención de los extractos etanólico e hidroalcohólico 40

2.2.2 Del Estudio de la actividad antimicrobiana 46

2.2.2.1 Material microbiológico 46

2.2.2.2 Medios de cultivo 46

2.2.2.3 Controles 47

2.2.2.4 Interpretación de resultados 47

2.2.2.5 Método de difusión mediante excavación en placa 48

2.2.2.6 Preparación de medios de cultivo líquido 52

2.2.2.7 Determinación de la concentración mínima bactericida

y bacteriostática (CMB) 54

3. RESULTADOS 59

4. DISCUSIÓN 66

CONCLUSIONES 68

RECOMENDACIONES 69

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 70

ANEXOS 77
SUMARY

The research was developed to determine the antimicrobial activity of Carica

papaya L, “papaya” seeds. These were obtained through the percolation of ethanolic

and hydroalcoholic (2:3) extracts of dry and fat-free dry seeds, and their

antimicrobial activity was determined through diffusion by an excavation method in

presence of the following microorganisms: Candida albicans ATCC 10231,

Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Pseudomonas

aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923. Furthermore, a

phytochemical screening of the samples was made.

Tanines, triterpenoids and/or steroids and flavonoids were detected in both

dry and fat-free dry seeds.

The hydroalcoholic extracts of the dry and fat-free dry seeds displayed

antimicrobial activity in presence of the 5 confronted microorganisms, whereas the

ethanolic extracts of dry and fat-free dry seeds showed activity in presence of

Enterococcus faecalis and Staphylococcus aureus.


RESUMEN

Se realizó el presente trabajo de investigación para determinar la actividad

antimicrobiana de las semillas de Carica papaya L. “papaya”. Se obtuvieron por

percolación los extractos etanólico e hidroalcohólico (2:3) de semillas secas y

semillas secas desengrasadas, y se determinó su actividad antimicrobiana mediante el

método de difusión por excavación frente a los siguientes microorganismos: Candida

albicans ATCC 10231, Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC

29212, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC

25923. Así mismo se realizó un “screening” fitoquímico de las muestras.

Tanto en las semillas secas y semillas secas desengrasadas, se detectaron:

taninos, triterpenoides y/o esteroides y flavonoides.

Los extractos hidroalcohólicos de las semillas secas y semillas secas

desengrasadas evidenciaron actividad antimicrobiana frente a los 5 microorganismos

confrontados, mientras que los etanólicos de las semillas secas y semillas secas

desengrasadas mostraron actividad frente a Enterococcus faecalis y Staphylococcus

aureus.
INTRODUCCIÓN

En los últimos años, la resistencia a los antimicrobianos se ha convertido en

un problema mundial y se ha analizado con mayor interés en muchos países,

reconociéndose oficialmente que el incremento de la resistencia bacteriana a los

antibióticos amenaza la salud pública.1

Se sabe que las plantas han sido usadas por muchos cientos de años con una

amplia variedad de propósitos. Así mismo se puede afirmar que presentan una

complejidad de propiedades medicinales, entre ellas la acción antimicrobiana. Por tal

motivo algunas plantas medicinales se pueden considerar como una posible

alternativa de tratamiento efectivo de las enfermedades infecciosas.

La especie vegetal Carica papaya L. “papaya”, considerada como una planta

cosmopolita de amplio cultivo en nuestro país, presenta diferentes constituyentes

químicos distribuidos en toda su estructura: raíces, tallo, hojas, flores, frutos y

semillas, lo que le confiere un indudable efecto medicinal.4


La investigación científica, basada en el uso popular medicinal de esta

especie, demuestra la relación que existe entre su composición química y su

propiedad terapéutica, encontrándose antecedentes de la actividad antimicrobiana de

las semillas, además de su buena acción ya conocida contra los parásitos intestinales.

De lo antes mencionado se planteó la presente investigación teniendo como

objetivo determinar la actividad antimicrobiana in vitro de los extractos etanólico e

hidroalcohólico de las semillas de Carica papaya L., para llegar a probar su eficacia

en modelos in vitro frente a cepas de microorganismos patógenos, con el propósito

de ampliar el conocimiento sobre su acción antimicrobiana. Así mismo, se consideró

adicionalmente la realización del “screening” fitoquímico de las muestras en estudio.


1. GENERALIDADES

1.1 Carica papaya L.

1.1.1 Historia 2,3,7,8,9,10

Es una planta originaria de América tropical; sin embargo el

centro de origen botánico de la especie cultivada no puede ser establecido

con exactitud. Algunos autores consideran a las Antillas como su centro

de origen y otros a México, América Central y aún al Perú como los

lugares de donde proviene esta especie.

Según Linneo, Fernández había llamado a esta fruta “Higo de

Mastuerzo”, y tuvo la idea de clasificarla como un higo (carica en griego)

y además se dice que las muestras que le llevaron provenían de la India, y

especialmente de una región del Asia que se llamaba en ese tiempo

Carica, bautizó este genero con el vocablo Carica y lo apellidó con la

denominación ya universal Papaya.

Los españoles se encargaron de llevarla a todo el trópico del orbe,

la introdujeron en la Republica Dominicana (1525), la presentaron a los

reyes de España (1535) y a las Filipinas (1550) diseminándola luego por

el África, Malasia y por todas las Islas del Pacífico.

Desde fines del siglo XVIII, se sabía que algunos grupos

indígenas sudamericanos usaban las hojas del papayo para envolver la

carne de los animales que se cazaban con el objeto de hacerla mas suave y

sabrosa; otros acostumbraban frotar la carne dura con una tajada de

papaya verde para que se ablande o añadían un pedazo de papaya verde al


agua donde se hierve la carne. Edlicher y Vanquelin reportaron en 1756,

la acción vermicida y digestiva del látex. Posteriormente Wurtyz en 1880,

comunicó al mundo científico el descubrimiento de la Papaína una

sustancia que Chittenden calificó como fermento vegetal en 1883.

Hubo después una serie de investigaciones y descubrimientos

complementarios que progresivamente fueron atrayendo la atención de

empresarios industriales.

Actualmente la industria de la papaína es muy importante en la

economía agrícola de muchos países.

1.1.2 División taxonómica

De acuerdo al Sistema de Clasificación de Cronquist (1988)

evaluado por el Herbario San Marcos del Museo de Historia Natural, de la

Universidad Nacional Mayor de San Marcos, se determinó como:

ƒ Reino: Plantae.

ƒ División: Magnoliophyta.

ƒ Clase: Magnoliopsida.

ƒ Orden: Violales.

ƒ Familia: Caricaceae.

ƒ Género: Carica.

ƒ Especie: Carica papaya L.


• Sinónimos 2,3,8,9

Vasconcellea cestriflora, Vasconsellea pubescens, Carica

cundinamarcensis, Carica candamarcensis Hook, Carica

cestiflora, Carica pubescens, Papaya cestiflora, Papaya

cundinamarcensis, Papaya pubescens, Carica chiriquensis

Woodson, Carica monoica, Carica pantagona, Carica glandulosa,

Carica candicans, Carica gouditiana, Carica peltat, Carica

gondotiana, Carica quinqueloba, Carica comunis Noroña,

Papaya carica, Papaya cubensis.

• Nombres vulgares 2,8, 11,12,13,14

Chilhualcán, Chiblocán, Chamburo, Siglolón, Siglalón, Sigloalón

(Ecuador); Papayuela, Lechosa (Puerto Rico y Colombia); Mamao

(Brasil); Fruta bomba (Cuba); Melón-zapote (México); Mamón

(Argentina, Paraguay, Tahití y Hawai); Papaya de tierra fría,

Chihualcan, Papaya (Chile); Olocotón (Nicaragua); Mountain

papaya (Estados Unidos); Papaya (Guatemala, Nicaragua y Italia);

Papai (Haití); Pawpaw (Dominica, Inglés); Papaya, Pucha

(Shipibo, Conibo); Capucha (Pano); He-i, Kupaoyo,

Noompucha(Cashibo); Pampucho (Coshibo); Chamburú, Milikane

(Tahití y Hawai); Ababaya; Ababi (Caribe); Papayabaum

(Alemania); Papaya, Papayer (Francia); y otros como: Papayero;

Mamona; Mapaña; Higo de mastuerza; Put.


1.1.3 Hábitat 2,9,10,15

Nativa de laderas bajas de los Andes orientales, la cuenca

amazónica y Centro América en clima tropical húmedo en alturas hasta

1600 msnm. Introducida en los trópicos del viejo mundo, donde se

produce comercial y artesanalmente.

El cultivo del papayo se extiende en la faja del planeta

comprendido entre los 22° latitud norte y 32° latitud sur. En condiciones

de ambiente ecológico favorable, calor y humedad apropiados,

aproximadamente, a partir de los 10 meses de su plantada, crece

satisfactoriamente en un rango de temperatura entre 22°C y 32°C. Las

plantaciones con este frutal se efectúan en áreas protegidas de los vientos,

con un rango de humedad relativa de 70% y 80%.

1.1.4 Descripción 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16

Planta de naturaleza herbácea, de porte variado de 3 a 10 m. de

altura. Es una planta frutal perennifolia, dioica con tallo único raras veces

ramificado, frondosa en la parte superior y productora de látex. Es una

especie polígama, diferenciando plantas femeninas, masculinas y

hermafroditas.

• Tallo.- Es cilíndrico, hueco, desnudo, erecto y tiene un diámetro

hasta de 30 cm.; en la base adelgazándose hacia arriba; es carnoso,

poroso, y jugoso. Las cicatrices foliares grandes que presenta en la


superficie del eje de la planta, marca la ubicación de hojas y frutos

que se han desprendido.

• Hojas.- Ubicadas en el extremo superior del tallo, en una especie de

roseta espiral formando una corona o sombrilla; son alternas,

simples y palmeadas sin estipulas; tienen largos pecíolos entre 50 a

90 cm. de diámetro, presenta entre 5 a 13 lóbulos; de matiz verde

oscuro en el haz y verde claro en el envés, con pocas vellosidades de

70 cm. con un diseño redondo pero con profundas escotaduras y sus

nervaduras son muy prominentes en el envés.

• Raíces.- Consta de pocas ramificaciones, relativamente gruesas, las

mismas que en su extremo distal están provistas de numerosas

raicillas.

• Flores.- Las flores emergen de las axilas de las hojas, son solitarias,

pentámeras; nacen agrupadas en una inflorescencia cimosa hay

masculinas, femeninas y hermafroditas.

Flor Femenina.- Es de forma redondeada y el estigma en forma

de abanico. Son muy numerosas, pedunculadas, de color blanco,

solitarias en las axilas foliares, cáliz pequeño, sésiles de 8 cm. de

largo; corola con 5 pétalos angostos separados entre sí,

triangulares de 5 a 7 cm. de largo; gineceo con ovario supero y

ovoide, tri o penta carpelar; unilocular; y 5 placentas con

numerosos óvulos. Tienen un pistilo formado por la fusión de 5

estigmas de color amarillo.


Flor Masculina.- Aparecen en ramilletes que están en el

extremo del pecíolo (15 - 20 cm.) de 4 cm. de largo, de color

blanco cremoso a veces verdosas o amarillentas; se compone de

un tubo corto, en que abre 2/3 partes de su longitud formando 5

pétalos, ubicándose a su alrededor 10 estambres con anteras

amarillas. La corola es tubular (2 - 3 cm.) con 5 lóbulos cortos y

un pistilo rudimentario y muy delgado, careciendo de estigma.

Son flores fragantes muy atractivas para los insectos diurnos y

nocturnos; éstas raras veces forman frutos o si los forma son

deformes y carecen de valor comercial.

Flor Hermafrodita.- Puede ser flor pentandría, intermedia y

alargada; son escasas y mas anchas que las masculinas. Poseen 5

pétalos gruesos de color verde claro, de ápice pubescente,

agudo; posee de 5 a 10 estambres. Los filamentos son largos, de

dorso algo hendido, blancos adheridos al pétalo. Las anteras

poseen un conectivo verde y encorvado; el ovario con 5

estigmas desiguales papilosos y gruesos. Los frutos pueden ser

globulosos, alargados y deformes.

• Fruto.- Tiene forma variada: esférica, periforme, ovalado, alargado

y otras. Es una baya grande de hasta 40cm. de diámetro y 15 a más

cm. de largo; tiene una piel delgada, savia lechosa, posee una pulpa

dulce, suave. El fruto consta de 5 carpelos que se unen para formar


una cavidad y el fruto con menos de 5 carpelos forman frutos

alargados.

El peso varia desde 0.2 a 7.0 Kg.; el color de la pulpa puede ser de

amarillo anaranjado pálido, anaranjado rojo hasta rosado oscuro. La

cavidad está casi vacía con las abundantes semillas cubriendo las

paredes.

• Semillas.- Un fruto normal contiene hasta mil semillas ovoides de 5

a 7 mm. de diámetro; negras y recubiertas por un arilo o envoltura

mucilaginosa, gelatinosa que le da a la semilla una falsa cubierta lisa

y brillante; con la superficie rugosa. Es de sabor picante; el embrión

es pequeño y los cotiledones están bien desarrollados.

Ramas y hojas de Carica papaya L.


Flor de Carica papaya L.

Fruto verde de Carica papaya L.


Fruto maduro de Carica papaya L.

Semillas de Carica papaya L.

1.1.5 Cultivo 7,9,10,15,17,18,19

Debido a su gran importancia actual en el comercio frutero y en la

industria, el cultivo ha sido perfeccionado hasta llegar a ser una verdadera

especialidad gastronómica.

A nivel mundial se encuentra ampliamente distribuido

principalmente en Brasil seguidamente por México, Tailandia, Indonesia,


India, Colombia y Cuba; en el año 1990; notándose un incremento en la

producción. Los principales países importadores de papaya son Reino

Unido, Alemania, Francia e Italia y en menor cantidad Estados Unidos,

Canadá, Suiza.

A nivel nacional había 2893 hectáreas plantadas con papaya en

1984 (Ministerio Agricultura. Estadística Agraria 1984).

A continuación mostramos en un cuadro los 5 principales

departamentos del Perú en la producción, superficie cosechada y

rendimiento de papaya.

Producción Superficie Rendimiento


Departamento
(t) (ha) (kg/ha)
Huánuco 50 706 2 653 19 113
Junín 34 046 3 402 10 008
Ucayali 23 619 2 791 8 463
San Martín 17 447 1 456 11 983
Cajamarca 14 208 1 009 14 081

Fuente: Ministerio de agricultura

En los países donde se cultiva la papaya, las variaciones

encontradas entre los numerosos tipos son muy amplias dependiendo del

tamaño, calidad y otras características que le dan los diferentes cultivares

como: “Solo”, “Sunrise”, Subset”, “Cariflora”, “Vista Solo”, “Criolla”,

“Waimando”, “Higgis”, “Wilder”, “Gold”, “Petersen”, y otros híbridos.

La papaya crece fácilmente en cualquier clima tropical o

subtropical. No es tolerante al frío, y muere fácilmente con temperatura


cercana a 0°C. Necesita buena lluvia o buen riego, pero bien drenada no

tolera el encharcamiento por más de 24 horas. Tolera la brisa marina, pero

no el terreno salado o salitroso; es de suelo franco, ligero, poroso, rico en

materia orgánica y con un buen abono; pH 5,5 - 6,7. Se propaga bien con

semillas a las que se les lava el arilo y se secan. Tardan 30 - 45 días en

germinar y pueden transplantarse a los 3 - 6 meses. Comienza a producir

en un año y puede vivir produciendo hasta los 20 años pero su producción

ideal es entre los 3 - 5 años, para algunas variedades que rinden 20 a 40

frutos por año. Deben ser plantados a una distancia de 2 x 2 metros. Se

cosechan cuando el 80% tiene color amarillo o anaranjado.

La producción del látex no esta siempre relacionado al buen sabor

de la fruta, este puede tenerse por fisuras en el fruto verde, que luego se

torna amarillo al endurecerse y su recolección no hace daño a la calidad

del fruto.

1.1.6 Usos medicinales 2,3,7,12,13,14,20,21,22,23,24,25,26,27

Es conocida su buena acción contra los parásitos intestinales,

especialmente contra los ascárides se usa el polvo de las semillas secas

25-30g.; una infusión de raíz (2-3 cucharadas al día); semilla fresca

licuada con miel o el látex disuelto en agua (una cuchara grande para un

adulto) puede seguir usándose con aceite de ricino u otro purgante.

Las hojas de papaya en infusión se usa para controlar la disentería

amebiana; las hojas secas se fuman contra el asma, en infusión o


decocción se usan para afecciones cardiacas, infusión de hojas tiernas se

aconseja como tónico cardiaco.

El látex es utilizado para el tratamiento tónico de diversos

procesos de la piel; se usa el látex (o un trozo de papaya verde, o una

porción de hojas mojadas) para extirpar verruga, suavizar un callo, hacer

desaparecer una peca o atacar el nido de una nigua. En preparación con

glicerina se usa para aliviar la soriasis, controlar la hiperhidrosis de las

manos o axilas. Puro o diluido se usa para limpiar heridas o llagas

infectadas y necróticas. Una pincelación de la faringe con una mezcla de

látex y glicerina ayuda a controlar la presencia de costras, secreciones en

la difteria y otras faringitis graves. Se usa tópicamente para tratar

afecciones dérmicas (eczemas, erisipela, tinea), induraciones, cáncer y

tumores. Por vía oral se usa para tratar esplenomegalia, catarro intestinal

y parásitos intestinales (oxiuros, tricocéfalos, tenias). También se puede

usar para el mismo fin el látex diluido en alcohol.

El cocimiento de cogollos se usa para sacar las lombrices y tratar

paludismo y dispepsia.

Se alega también que el fruto verde molido con sus semillas y

disuelto en cerveza para quitarle el mal sabor, es un buen emenagogo y

puede provocar el aborto; en otros empleos menos generalizados se

prepara jarabes para la tos a partir de la fruta madura o de una infusión de

las flores, el jarabe también se usa por vía oral contra afecciones

digestivas (constipado, diarrea, disentería, dispepsia, enteritis, parásitos


intestinales) y respiratorias (asma, catarro, difteria, tos, tuberculosis),

enfermedades venéreas, fiebre, hipertensión, locura, oliguria; se dice que

el fruto mejora la digestión y previene el reumatismo.

Además la maceración o infusión de raíz se usa para uretritis,

sífilis y contener hemorragias, se dice que en infusión concentrada puede

ser abortivo. En Loreto las mujeres consumen media papaya madura en

ayuna en los días de la menstruación con fines anticonceptivos y con el

mismo fin también usan las flores masculinas en infusión (1 taza de flores

en 3 tazas de agua), tomar 1 taza 3 veces al día 3 días antes de la

menstruación. Así mismo se usa el jarabe de flores para tratar ictericia,

bronquitis y otras afecciones respiratorias.

En otros usos medicinales se indica como sedante, el cocimiento

de raíces gruesas y añejas (20g/L de agua) tomar un vaso 3 veces al día;

como carminativo el cocimiento de semillas secas y molidas (20g/L de

agua) tomar un vaso 3-4 veces al día y como galactogogo el cocimiento

de las hojas verdes de la planta madura (3-4 hojas en 2L de agua) tomar 2

vasos 3 veces al día.

Se le atribuye propiedad amebicida, anodina, antibiótica,

antiflogística, bactericida, cardiotónica, carminativa, colagoga, digestiva,

diurética, emenagogo, estomáquica, expectorante, fungicida, insecticida,

laxante, pectoral, pediculicida, proteolítica, tónica y vermífuga.


1.1.7 Otros usos 2,7,10,13,14,15

La pulpa del fruto es jugosa, blando y dulce, es muy apetecida y se

come fresca, en jugo o mermelada; el fruto tierno puede comerse cocido o

en “pie”; las hojas tiernas se comen cocidas. Industrialmente se prepara

fruta confitada a partir de la fruta verde; y néctar de papaya, papaya en

almíbar y mermelada a partir de la fruta madura.

Del látex se obtiene la papaína de amplio uso industrial,

alimenticio y medicinal; las cáscaras y hojas se usan para ablandar la

carne. Las hojas usadas como substituto del jabón son muy útiles para

remover manchas.

La papaína la usan también en el laboratorio de bacteriología para

preparar determinados tipos de cultivos. Otros afirman su uso en la

preparación industrial de cerveza para la clarificación de la bebida; en la

industria del caucho natural, para acelerar la maduración del producto. En

la industria textil se usa para evitar el encogimiento de la lana y dar mas

brillo a la seda; en las curtiembres, para facilitar el batimiento del cuero y

mejorar la calidad del producto.

Así mismo también es usado en la industria del queso

reemplazando a la renina para obtener calidades específicas; en

Norteamérica es indispensable las enzimas de la papaya en la industria de

la goma de mascar. Y a la vez se menciona su uso en cosmética,

dentífrico y otros productos de tocador.


1.1.8 Composición química 2,7,11,12,14,15,17

El fruto contiene:

Agua 90%
Azúcares (levulosa, sacarosa, glucosa) 8 - 10%
Proteínas 0,5%
Grasas 0,1%
Vit. A en carotenos activos
2000 - 3000UI
(criptoxantina, violaxantina, licapeno, zeaxantina, fitoeno, etc)

Vit. C 75mg%
Ac. no volátiles (cítrico, málico, acetogluterico)
Vit. B1 (Tiamina) 0.02 - 0.04mg

Vit. B2 (Riboflavina) 0.02 - 0.06mg


Vit. B3 (Niocina) 0.22 - 0.55mg
Sales 0.50g
Calorías 23 - 25
Ac. ascórbico 35.5 - 71.3mg
Fibra cruda 0.5 - 1.3g
Ceniza 0.31 - 0.66g
Calcio 12.9 - 40.8mg
Fósforo 5.3 - 22mg
Hierro 0.25 - 0.78mg
Triptófano 4 - 5mg
Metionina 1mg
Lisina 15 - 16mg
Fuente: 2,7,11,12,14,15,17

Las semillas contienen:

Aceite 25%
Proteínas 24%
Ac. grasos (oleico, miristico, palmítico, esteárico)
Glucosido (caricina, carposenina)
Mirosina
Derivados de isotiocianato de bencilo (tropaeolina)
Fuente: 2,7,11,12,14,15,17
Las hojas contienen:
Humedad 83.3g
Proteína 5.6g
Grasa 0.4g
Carbohidratos 8 - 11g
Fibra cruda 1g
Ceniza 1.4g
Calcio 0.406g
Hierro 0.0063g
Caroteno 28.9000UI
Ac. Ascórbico 38,6%
Magnesio 0.035g
Ac. fosfórico 0.225g
Carpaína 0,25%
Taninos 0.5 - 0.6%
Pseudocarpaína, isocarpaína, dihidrocarpaína I y II
Glicosidos cianogéneticos
Fuente: 2,7,11,12,14,15,17

La corteza contiene: pentaalcohol, xilitol, saponósidos.

La raíz contiene: alcaloides (isocarpaína, dihidrocarpaína), taninos.

El látex contiene: papaína, quimopapaína, carpósido.

1.1.9 Referencias Farmacológicas

La papaína es una enzima proteolítica que actúa sobre las

proteínas rompiendo los enlaces peptídicos para dar lugar a compuestos

más simples que son los aminoácidos los cuales están unidos entre sí por

enlaces peptídicos. Cuando estos enlaces son destruidos por un fermento

o enzima proteolítica como la papaína, la proteína se desintegra, rota en

pedazos como un collar de perlas destruido o como una cadena

desarticulada.7

Los helmintos que parasitan en el intestino humano tiene su

cuerpo protegido para que no sea digerido por jugos digestivos normales,
todo el cuerpo esta recubierto por una sustancia proteica que se llama

quitina con una capa de células epidérmicas muertas. Los fermentos

proteolíticos vegetales como la papaína son capaces de destruir las

proteínas muertas y la quitina; son así como los gusanos desnudos son

fácilmente eliminados y por esta razón se dice que son sustancias

antihelmínticas.7

Se han obtenido buenos resultados con la tenia, los oxiuros, el

ancylostoma, los trichuris, etc. pero la acción más específica parece ser

sobre los ascarides. Algunos afirman que puede usarse 10g de papaína

pura para un niño de 1 – 2 años, 10 – 15g entre 2 – 6 años y 15 – 20g

después de los 6 años siguiendo media hora después con una dosis de

aceite de ricino.7

También se reporta que el alcaloide carpaína tiene un interesante

efecto sobre el músculo cardiaco, parecido al de la digital; se dice que en

su marcha farmacológica deprime primero la actividad auricular, después

la concentración ventricular y puede producir la detención del corazón a

altas dosis. Se indica que a dosis de 5mg/Kg./vía oral mata a un conejo

pero no perjudica a un gato. Es relajante de la musculatura lisa de los

bronquios, del intestino y del útero, lo que explicaría la acción del humo

de las hojas sobre los síntomas del asma.7 En la Universidad Nacional San

Luis Gonzaga de Ica – Perú, a través de una investigación se comprobó la

actividad cardiotónoca e hipotensora de la papaya utilizando el extracto


etanólico de las hojas sobre corazón “in situ” de sapos y una aurícula

aislada de cobayo respectivamente.36

El xilitol es un diurético reconocido, antihelmíntico y productor de

los niveles de bilirrubina en ratas experimentalmente intoxicadas por

inyecciones saponósicas.11

En Alemania y Checoslovaquia usan especialidades farmacéuticas

como TROMALYT y UROGAN para el tratamiento de infecciones

urinarias resistentes.11

En África se demostró la actividad antihipertensiva de la papaya a

dosis de 0.01mg por el principio activo carpaína, la misma que inhibe in

vitro cepas de Mycobacterium tuberculosis.11

Estudios antibacterianos demuestran que el extracto de semillas y

fruto tierno y maduro son activos contra bacterias Gramnegativas; los

extractos etanólicos de hojas son activos contra Escherichia coli y

Staphylococcus aureus. Se tienen reportes sobre los extractos acuosos de

varias partes del fruto que no tienen actividad antimicrobiana.5

Estudios de Nigeria mostraron que el extracto etanólico de la hoja

seca administrado por vía intraperitoneal en ratas tiene efecto analgésico a

la dosis de 20mg/Kg., anticonvulsivante en dosis de 20mg/Kg. y

100mg/Kg., relajante del músculo esquelético a la dosis de 50mg/Kg.,

cronotropo positivo a 20mg/Kg. y tranquilizante a la dosis de 10mg/kg. 11


Por otro lado se ha demostrado que el extracto metanólico no tiene

actividad antiinflamatoria en el edema de la oreja del ratón inducido por

acetato de tetradecanoilforbol.5

El extracto acetónico del látex pulverizado contiene un factor que

acelera la coagulación sanguínea y otro que la previene.5 También

presenta actividad antifúngica in vitro especialmente frente a Candida

albicans (CL100=138µg/mL).11

En Londres se curaron las heridas de una operación de transplante

de riñón con tiras del fruto, se dejaron durante 48 horas, después que los

medicamentos modernos habían fracasado.5

Los extractos butánolico y en alcohol isopentílico respectivamente

ejercen una actividad espasmolítica sobre el ileon aislado de cobayo a la

concentración de 0.2mg/mL.11

El fruto y la semilla por vía intraperitoneal en la rata tienen efecto

anticonceptivo por impedir la implantación del huevo o cigote en el

útero.11

Así mismo se reporta que en estudios con animales, la ictericia

provocada por la administración de saponósidos desapareció rápidamente

al administrar el extracto de Carica papaya.11

De las semillas frescas machacadas se ha aislado la aglicona de

glucotropaeolin bencil isotiocianato (BITC) que tiene actividad

bacteriostática, bactericida y fungicida; la dosis efectiva única es de 4 –


5g. (25 – 30mg. BITC). La tropoeolina también ha sido usada como

agente bactericida en infecciones intestinales y urinarias en dosis de 6µg.5

Estudios en Alemania afirman que el extracto etanólico de las

semillas de Carica papaya no presenta actividad antibacteriana contra

microorganismos Grampositivos o Gramnegativos.28

En una investigación realizada en Japón, se indica que las

semillas y frutos de la papaya presentan actividad antibacteriana y

antioxidante.30 Mientas que en Camerum demostraron la actividad

antimicrobiana frente a especies de Salmonella.34

Por otro lado en Jamaica, mediante un estudio realizado sobre el

efecto antibacteriano de los frutos y semillas de Carica papaya, se

demostró que éstas últimas son portadoras de una actividad antibacteriana

que inhibe el crecimiento de los microorganismos Grampositivos y

Gramnegativos. Así mismo no se produjo zona de inhibición alguna por

parte de los extractos de epicarpio y endocarpio.31

También se ha comprobado la acción antiparasitaria de las

semillas frente al parásito nematodo Haemonchus contortus en una

investigación realizada al Oeste de África,32 y en Perú frente a Ascaris

lumbricoides. 37,38 Así mismo se relaciona la actividad antihelmíntica con

el contenido de bencilisotiocianatos.33 A su vez se considera a la papaya

como una buena alternativa para las quemaduras en pacientes pediátricos

en el caso de infecciones, tejidos necrosados y rupturas de implantes en la

piel.35
1.1.10 Referencias Toxicológicas

La carpaina actúa a nivel del corazón como los digitálicos y es

susceptible de provocar a fuertes dosis parálisis y depresión cardiaca.11

La quimopapaína tiene un efecto inmunogénico marcado en el

hombre, por lo que se ha limitado su utilización clínica en instilación in

situ (tratamiento de hernias discales), produce choque anafiláctico en el

1% de los pacientes sometidos a dicho procedimiento. En el perro la vía

intradiscal fue bien tolerada a dosis de hasta 25mg/Kg., no se observó

ninguna toxicidad después de varios meses. Se ha establecido la DL50 por

vía intravenosa en el ratón: 79mg/Kg.; en la rata: 120mg/Kg.; en el

conejo: 15mg/Kg. y en el perro: 17mg/Kg. Además la papaína provoca

enfisema pulmonar por inhalación en el perro, en el hámster y en la rata.11

La DL50 del extracto acuoso de semilla, en el ratón, es superior a

10mL/Kg.11

Los extractos acuosos y etanólicos de hoja y corteza (500 ppm)

son tóxicos a peces del género Mollinesia.5

El fruto verde y el exceso de semillas pueden ser abortivos; la raíz

en enema se usa como abortivo; el látex fresco es irritante y vesicante

sobre todo a la mucosa ocular y su ingestión puede causar gastritis,

también puede producir dermatitis y otras formas de alergia, el polen

puede causar severas alergias respiratorias.5

El extracto acuoso de semilla produjo esterilidad irreversible a

ratas albinas machos (se dio una disminución en la motilidad de los


espermatozoides por interferencia motora de los vasos deferentes),

probablemente se debe a una acción antiandrogénica.11


1.2 Actividad antimicrobiana

1.2.1 Definición

Sustancia química, producida por un microorganismo o por

síntesis, que es capaz de matar o inhibir el crecimiento de los

microorganismos.

La actividad antimicrobiana se mide in vitro para determinar: la

potencia de un agente antibacteriano en solución, su concentración en

los líquidos del cuerpo o en los tejidos, y la sensibilidad de un

microorganismo dado a concentraciones conocidas del medicamento.

1.2.2 Determinación de la actividad antimicrobiana

Para evaluar la actividad es preciso conocer el modelo

microbiano perfectamente y tenerlo controlado en las condiciones de

laboratorio, ya sea por procedimientos in vitro o in vivo.

Utilizando un microorganismo estándar apropiado de prueba y

una muestra conocida de medicamento para la comparación, pueden

emplearse dos métodos principales: dilución o difusión para estimar

tanto la potencia del antibiótico en la muestra como la “sensibilidad”

del microorganismo.

1.2.3 Antibiograma

Esquema o patrón de sensibilidad de un microorganismo a una

batería de agentes antimicrobianos.


2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Materiales

2.1.1 Del estudio fitoquímico

Material botánico: La muestra corresponde a las semillas secas de la

especie Carica papaya L. “papaya”.

Material de laboratorio:

- Agitadores

- Alcoholímetro

- Aros

- Balones

- Embudos

- Espátulas

- Fiolas

- Gotero

- Gradillas

- Matraces

- Nueces

- Papel de filtro

- Papel tornasol

- Peras de bromo

- Pipetas
- Pinzas

- Probetas

- Soporte universal

- Tubos de ensayo

- Vaso de precipitación

Reactivos y solventes:

- Ácido sulfúrico c.c.

- Ácido clorhídrico

- Agua destilada

- Alcohol amílico

- Alcohol rectificado

- Anhídrido acético

- Cloruro de sodio

- Diclorometano

- Reactivo Dragendorff

- Éter de petróleo 60º - 90º C

- Reactivo Hager

- Hidróxido de sodio

- Limadura de magnesio

- Reactivo Mayer

- Solución de gelatina

- Sulfato de sodio anhidro


- Tricloruro de fierro

Equipos de laboratorio:

- Balanza analítica

- Balanza de humedad

- Baño Maria

- Cocinilla eléctrica

- Equipo de agitación

- Equipo de destilación (Obtención del solvente)

- Equipo de percolación

- Equipo de reflujo (Screening fitoquímico)

- Estufa

- Molino manual

2.1.2 Del estudio antimicrobiano

Material biológico: Se usaron cepas proporcionadas por el INS Instituto

Nacional de Salud.

- Candida albicans ATCC 10231

- Escherichia coli ATCC 25922

- Enterococcus faecalis ATCC 29212

- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

- Staphylococcus aureus ATCC 25923


Material de laboratorio:

- Algodón

- Asa de platino

- Baguetas

- Cinta de control de esterilidad

- Espátulas

- Gradillas

- Matraces

- Papel aluminio

- Papel kraff

- Pabilo

- Pinza para tubo de ensayo

- Pipetas

- Placas petri

- Probeta

- Sacabocado

- Tubos de ensayo de 13 x 100 mm.

- Tubos de ensayo de 8 x 60 mm.

- Tubos de ensayo 16 x 160 mm.

- Viales

Equipos:

- Autoclave
- Balanza analítica

- Baño María

- Cocina eléctrica

- Estufa

- Horno de esterilización

- Mechero de Bunsen

- Refrigeradora

Reactivos y solventes:

- Agua destilada

- Antibiótico de referencia (control positivo): Gentamicina

80mg/2mL

- EtOH-Agua (3:2)

Medios de cultivo:

- Agar Müeller Hinton (MH)

- Agar Tripticasa Soya (TSA)

- Caldo Nutritivo (CN)

2.2 Métodos

2.2.1 Del estudio fitoquímico

2.2.1.1 Preparación del material vegetal


Recolección.- Para obtener las semillas de Carica papaya L., se

recolectaron los frutos en el distrito de Juan Guerra, provincia de

Tarapoto, departamento de San Martín en el mes de agosto del

2006 posteriormente se empacaron con protección adecuada para

ser trasladados a la ciudad de Lima donde fueron cortados para

obtener las semillas, las mismas que se limpiaron con un paño

retirando los restos de pulpa del fruto.

Ubicación
geográfica del
distrito de
Juan Guerra,
provincia de
Tarapoto

Secado.- Inicialmente se realizó el secado al natural bajo sombra

por un tiempo de tres semanas en un ambiente adecuado con

buena ventilación y finalmente secado en estufa a temperatura de

38oC por un tiempo de dos semanas, debido a la elevada humedad

que presentan las semillas, controlando la pérdida de peso

diariamente hasta llegar a peso constante, asimismo se determinó

la humedad de la muestra.
Secado en estufa de las semillas de Carica papaya L.

Fragmentación.- Esta etapa la se realizó utilizando un molino

manual en buenas condiciones de limpieza obteniendo una

muestra finamente triturada.

Fragmentación de las semillas de Carica papaya L.

Almacenaje.- Las semillas trituradas se almacenaron en frascos

de vidrio color ámbar herméticamente cerrados y se conservaron

en un ambiente fresco y seco.


Fluxograma 1. Recolección y preparación de las semillas secas.

Droga
Semillas de Carica papaya L.
“papaya”

Recolección (*)

Inicialmente a sombra.
Secado (*)
Luego a 38ºC en estufa.

Molino manual
Fragmentación (*)

Almacenamiento (*) Ambiente freso y seco

(*) En cada uno de estos pasos se realizó una selección del


material vegetal en base a las características organolépticas.
Fluxograma 2. Recolección y preparación de las semillas secas

desengrasadas.

Droga
Semillas de Carica papaya L.
“papaya”

Recolección (*)

Secado (*) En sombra

Con éter petróleo


Lavado (*)
60º-90º

Secado (*) En estufa a 38ºC

Fragmentación (*) Molino manual

Almacenamiento (*) Ambiente freso y seco

(*) En cada uno de estos pasos se realizó una selección del


material vegetal en base a las características organolépticas.
2.2.1.2 “Screening” fitoquímico

Es una de las etapas iniciales de la investigación

fitoquímica, que permite luego orientar las extracciones y/o el

fraccionamiento de los extractos eligiendo los grupos de mayor

interés para el investigador.

Se realizó una marcha fitoquímica como se indica en el

Fluxograma Nº 3, para una determinación preliminar cualitativa

de los principales grupos de constituyentes químicos de la planta,

llamados metabolitos secundarios. Haciendo uso de solventes

apropiados para la extracción se obtuvo 6 fracciones denominadas

A, B, C, D, E y F. Para realizar un estudio comparativo se hizo el

screening fitoquímico con muestras de semillas lavadas y sin

lavar.

Obtención del Extracto

Se pesan 20 gramos del material vegetal seco y molido ya

seleccionado, y se maceran con cantidad suficiente de etanol

durante 48 horas.

Se somete a reflujo por 8 horas, luego se prosigue con la

obtención de las fracciones.

Obtención de Fracciones:

1. El extracto obtenido por reflujo, se filtra en caliente y

lleva a volumen final de 50 mL. Se separan 10 mL del

extracto etanólico, lo que constituye la fracción A.


2. Los 40 mL restantes se secan a temperatura reducida

3. Extraer el extracto seco con 15 mL de HCl 2 % a

50ºC. Si es necesario agregar más solución del ácido,

evitando que el volumen final exceda de 15 mL. El

insoluble se lava con agua destilada y se disuelve con

diclorometano en caliente, se filtra y lleva a un

volumen final de 10 mL; esto constituye la fracción B.

4. La solución ácida se neutraliza con NaOH o KOH,

controlando con papel tornasol. Se extrae con 2

porciones de 15 mL de diclorometano, se juntan las

dos fases orgánicas, se filtran sobre sulfato de sodio

anhidro y llevan a volumen final de 10 mL; esto

constituye la fracción C.

5. A la solución acuosa se le agregan 2 g de NaCl y se

extraen con 2 porciones de 15 mL de diclorometano-

etanol (3:2), se juntan las 2 fases orgánicas, se filtran

sobre sulfato de sodio anhidro y llevan a volumen final

de 10 mL; esto constituye la fracción D.

6. La solución acuosa restante se lleva a un volumen final

de 10 mL, esto constituye la fracción E.

7. 1 g de la muestra seca y molida se extrae con agua por

ebullición durante 10 minutos, se filtra y se lleva a

volumen final de 10 mL, esto constituye la fracción F.


Fluxograma 3. “Screening” fitoquímico

Muestra
seca y molida 20g.

Separar 10 mL Macerar con Etanol por 48 horas, reflujar por 6 horas y


filtrar en caliente. Llevar a volumen final de 50 mL.

Fracción A

40mL de extracto etanólico

Llevar a sequedad. y extraer con 15 mL


de HCl 2% a 50°C.

Insoluble Solución ácida


Insoluble

Lavar con agua Neutralizar con NaOH ó KOH.


destilada. Extraer con CH2Cl2 (2 x 15 mL)
Disolver en
CH2Cl2 en
caliente. Filtrar
y concentrar a
10 mL Fase orgánica Fase acuosa

Fracción B Agregar 2 g de NaCl.


Extraer con CH2Cl2 –
Filtrar sobre
EtOH 3: 2 (2 x 15mL)
Na2SO4
anh.
Concentrar
a 10 mL.

Fase orgánica Fase acuosa


Muestra
seca y molida 1g. Fracción C
cc
Filtrar sobre 10 mL
Na2SO4 anh.
Concentrar a
Extraer con 20 mL de agua por 10 minutos 10 mL
(ebullición). Filtrar y concentrar a 10 mL.

Fracción F Fracción D Fracción E


Identificación de metabolitos secundarios:

FRACCIÓN A

2 mL de Muestra
A sequedad y disuelto con 2 mL de
agua destilada. Filtrar

Solución de Ensayo (S.E)

0.5 mL S.E. + 0.5 mL S.E. +


0.5 mL de sol. acuosa Cloruro férrico 0.5%
de Gelatina
DETERMINACIÓN
DETERMINACIÓN DE GRUPOS
DE TANINOS FENÓLICOS LIBRES

Turbidez o precipitado
Coloración intensa
azul, negro o verde

FRACCIÓN B

1. Reacción de Lieberman – Bourchard para determinar Triterpenoides y/o


Esteroides:

0,5 mL de Muestra + 0,5 mL de Anhídrido acético + 1 gt de Acido sulfúrico cc.

Coloración azul, verde o naranja

2. Reacción de Bornträger para determinar Antraquinonas:

0.5 mL de Muestra + 5 mL de NaOH 5 % (agitación)

Coloración roja
FRACCIÓN C

1. Reacción de Lieberman – Bourchard (Descrita anteriormente):

2. Reacción para Alcaloides:

2 mL de Muestra

A sequedad y disuelto con HCl 1 %


a 50 ºC

Solución de Ensayo (S.E)

0.5 mL de S.E. + 0.5 mL de S.E. + 0.5 mL de S.E.+


gts de R. Mayer gts de R. Hager gts de R. Dragendorff

Precipitado Precipitado Precipitado


color blanco color amarillo color anaranjado

FRACCIÓN D

1. Reacción de Lieberman – Bourchard:

0.5 mL de Muestra
A sequedad y disuelto con 1 mL.
diclorometano

Se procede igual que los casos anteriores.

2. Reacción para Alcaloides: ( Descrita anteriormente )


3. Reacción de Rosenhein para Leucoantocianidinas y Catequinas; y Reacción
de Shinoda para Flavonoides.

2 mL de Muestra
A sequedad y disuelto con 5 mL de etanol
a 50 ºC

Solución de Ensayo (S.E)

0.5 mL de S.E. + 0.5 mL de S.E. +


0.2 mL de HCl cc 0.2 mL de HCl cc +
Limadura de Magnesio
Calentar por 10 minutos a
100 ºC y enfriar. Reposar 5
minutos

+ 2 mL de Agua destilada
+ 2 mL de Alcohol amílico Aparece coloración
Agitación

Coloración rojo intenso a rojo


débil (Leucoantocianidinas)
o marrón (Catequinas).

FRACCIÓN E.- Sobre esta fracción se realiza directamente los ensayos de

Rosenhein y Shinoda (descritos en la Fracción D)

FRACCIÓN F.- Colocar 1 mL en un tubo de ensayo, tapar y agitar

fuertemente durante 15 minutos, luego de este tiempo se mide la altura de la

espuma. La reacción es negativa si la altura de la espuma es menor de 5 mm.


2.2.1.3 Obtención de los extractos etanólico e hidroalcohólico

Obtención de los extractos:

Se obtuvieron los extractos empleando EtOH-Agua (3:2) y

EtOH con la finalidad de comparar resultados en las diferentes

etapas de la investigación, obteniéndose al final del proceso el

extracto etanólico y el extracto hidroalcohólico seco.

De lo observado en los resultados de las primeras

percolaciones, debido a la presencia de abundante grasa en los

extractos se hizo un desengrasado de nuevas semillas secas

(segundo grupo de recolección), posteriormente se hizo las

percolaciones respectivas para cada tipo de extracto.

Muestra.- Para las semillas secas y fragmentadas se pesaron

100g. para cada equipo de percolación (4 equipos) separando

dos percolaciones por cada tipo de extracto. En el caso de las

semillas desengrasada y fragmentada se tomó 210g. para cada

equipo de percolación y por cada tipo de extracto.

Proceso de extracción por percolación.- se realizó a través

de las siguientes etapas:

- Primera Etapa

a. Estabilización: Comprende el Secado y la

fragmentación (descrito anteriormente).

b. Humectación: Para las semillas sin lavar se

dejó humectar la muestra por 4 horas y en las


semillas lavadas realizamos una humectación por

17 horas.

- Segunda Etapa

a. Llenado o carga: Posteriormente a la

instalación del equipo se procedió con el llenado.

La cantidad de solvente que se añadió al material

vegetal fue calculado tomando en cuenta la

siguiente fórmula:

Cantidad de Volumen Coeficiente


Proporción
solvente = final + de absorción x
de la droga
complementaria del extracto de agua de la droga

Se tomó como coeficiente de absorción de agua de

la droga 3.0 correspondiente a las semillas y la

cantidad de solvente complementaria empleada

para macerar las semillas sin lavar y lavadas fue de

400 y 840mL respectivamente.

b. Maceración: Se procedió a macerar la muestra

por un tiempo de 48 horas.

c. Lixiviación propiamente dicha: La extracción

se dio a una velocidad de flujo de 20 gotas por

minuto (lixiviación lenta) cuidando

minuciosamente el proceso, obteniendo de esta

manera el extracto líquido.


d. Extracto: Finalmente el volumen obtenido en el

extracto líquido fue llevado a concentración hasta

terminar en extracto seco para el caso del

hidroalcohólico y extracto líquido concentrado para

el etanólico.

Inicio del proceso de percolación

Obtención de los extractos


Extractos líquidos

Extractos secos
Fluxograma 4. Proceso de Lixiviación de semillas secas

Droga
Semillas de Carica papaya L. 100g
“papaya”

Etapas de Lixiviación

Primera Etapa Segunda Etapa

Llenado
Estabilización

48 horas.
EtOH y
Maceración
EtOH-Agua
(3:2)
Humectación
4 horas
Lixiviación
propiamente dicha

Obtención
del extracto líquido

Concentración

Extracto Etanólico Extracto seco


Hidroalcohólico
Fluxograma 5. Proceso de Lixiviación semillas desengrasadas

Droga
Semillas de Carica papaya L. 210g
“papaya”

Etapas de Lixiviación

Primera Etapa Segunda Etapa

Llenado
Estabilización

48 horas.
EtOH y
Maceración EtOH-Agua
(3:2)
Humectación
17 horas
Lixiviación
propiamente dicha

Obtención
del extracto líquido

Concentración

Extracto Etanólico Extracto


Hidroalcohólico
2.2.2 Estudio de la actividad antimicrobiana

2.2.2.1 Material microbiológico

Las cepas fueron proporcionadas por el Instituto

Nacional de Salud (INS):

Candida albicans ATCC 10231

Escherichia coli ATCC 25922

Enterococcus faecalis ATCC 29212

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Staphylococcus aureus ATCC 25923.

Cepas replicadas en incubación

2.2.2.2 Medios de cultivo

Los medios de cultivo que se utilizaron fueron: Agar

Müeller-Hinton (MH), Agar Tripticasa Soya (TSA), Caldo

Nutritivo (CN); para microorganismos en estudio.


2.2.2.3 Controles

Como control positivo se utilizó la Gentamicina para las

bacterias y como control negativo Etanol-Agua (3:2) para los

extractos etanólico e hidroalcohólico.

Extractos y Controles

2.2.2.4 Interpretación de resultados

Porcentaje de Inhibición Relativa (PIR)

Para la interpretación de los resultados se utilizó el

Porcentaje de Inhibición Relativa (PIR) la cual tiene por

finalidad comparar la actividad antimicrobiana de los extractos

frente al control positivo del antibiótico, obteniéndose un

porcentaje de inhibición.

a x 100
PIR =
b
Donde:

PIR = Porcentaje de Inhibición Relativa

a = Promedio del diámetro del halo de inhibición

del extracto.

B = Promedio del diámetro del halo de inhibición

del antibiótico estándar.

2.2.2.5 Método de difusión mediante excavación en placa

Preparación de medios de cultivo sólido

Todos los materiales de laboratorio (material de vidrio,

material de fierro, torundas, etc.) fueron previamente esterilizados

para realizar los ensayos microbiológicos; estos ensayos fueron

realizados por dos oportunidades por duplicado.

Se usó Agar Müeller-Hinton como medio. 25 mL del agar

fundido fueron asépticamente mezclados con una suspensión

bacteriana de 1 mL a la cual se hizo la comparación con el

nefelómetro de Mac Farland Nº 0.5 (1.5 x 108 UFC/mL) y vertido

en una placa petri esterilizada de 150mm. Al endurecerse el agar

se retiró 8 mm de diámetro usando un sacabocado estéril,

agregándose el extracto etanólico e hidroalcohólico de Carica

papaya L., en las excavaciones en el agar, también se tomó EtOH-


Agua (3:2) como control negativo y Gentamicina como control

positivo para bacterias grampositivas y gramnegativas. Los

ensayos se realizaron por duplicado.

Se midió la actividad antimicrobiana tomando en cuenta el

diámetro (mm) de la zona clara del halo de inhibición.

Proceso de llenado de excavaciones


Determinación de la Actividad antimicrobiana mediante difusión por excavación
de los extractos hidroalcohólicos y etanólicos.

Determinación de la Actividad antimicrobiana mediante difusión por excavación


de los extractos hidroalcohólicos.
METODO DE EXCAVACIÓN EN PLACA

Cepa del
microorganismo Cultivo microbiano 0.5 Mc Farland

Con pipeta estéril 1mL de Incorporación del Agar


Cultivo microbiano Müeller-Hinton

Agregando
extractos
Excavación con
sacabocado

Incubar a 37ºC x 24 h.

Lectura y Medición del halo de inhibición


2.2.2.6 Preparación del medio de cultivo líquido

Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (MIC)

Los cultivos microbianos fueron ajustados al estándar 0.5

de Mac Farland. Para hallar el MIC se prepararon baterías de 10

tubos previamente esterilizados y rotulados del número 1 al

número 10, la cual se utilizó para cada microorganismo.

Técnica de la Concentración Mínima Inhibitoria

- A partir del cultivo puro se tomó una asada cargada con el

inóculo, realizando la siembra por agitación en el medio

líquido (CN) contenido en el tubo de ensayo.

- Se flameó la boca del tubo y se tapó dejándolo en la gradilla

previamente rotulada según la bacteria replicada.

- Se incubó a 37ºC por 24 horas, cumplido el tiempo se ajustó al

estándar 0.5 de Mac Farland.

- Las baterías de tubos previamente estériles fueron enumerados

y rotulados por microorganismo y tipo de extracto.

- A partir del tubo Nº 2 hasta el tubo Nº 10 se agregó 0.5 mL del

Caldo Nutritivo.

- Seguidamente se coloca 0.5 mL del extracto al tubo Nº 1 y

tubo Nº 2, a partir del tubo Nº 2 se traspasa 0.5 mL al tubo Nº

3 mezclando, y así sucesivamente hasta el tubo Nº 9; del tubo


Nº 9 se cogió 0.5 mL y se descartó. El tubo de ensayo Nº 10

no recibió extracto.

- Posteriormente se agregó 0.5 mL del inóculo microbiano a

todos los tubos y se llevó a incubación a 37ºC por 24 horas.

Proceso de incubación de la Concentración Mínima Inhibitoria

Lectura

La lectura se realizó observándose la turbidez de cada una

de las baterías de tubos, el tubo con la menor concentración del

extracto que no presentó turbidez contuvo la concentración

mínima inhibitoria.
2.2.2.7 Determinación de la Concentración Mínima Bactericida y

Bacteriostática (CMB)

La concentración mínima bactericida se define como la

menor concentración del antimicrobiano que mata totalmente la

bacteria en estudio; y la concentración mínima bacteriostática,

como la concentración que no logra matar todos los

microorganismos.

Determinación de la Concentración Mínima Bactericida y

Bacteriostática (CMB).

Para determinar la Concentración Mínima Bactericida

(CMB) y Concentración Mínima Bacteriostática (CMB) se

procedió a partir de la concentración mínima inhibitoria.


- En una placa petri estéril previamente rotulada se dividió en

diez porciones en forma equitativa y enumerada del Nº 1 al 10.

- Se preparó agar Müeller-Hinton, para cada microorganismo.

- Con la ayuda del asa bacteriológica se cogió un inóculo del

tubo Nº 1 y se sembró por estrías en la división Nº 1 de la

respectiva placa, el asa se flamea al rojo vivo; y de la misma

manera se cogió una asada del tubo Nº 2, sembrándose en el

sector correspondiente de la placa petri, se sigue así

sucesivamente hasta la división Nº 10.

Proceso de Siembra Concentración Mínima Bactericida y Bacteriostática

- Concluida la siembra en la placa petri, se lleva a incubación a

37ºC por 24 horas.


Proceso de Incubación de Concentración Mínima Bactericida y Bacteriostática

Lectura

Se observa en cada una de las 10 divisiones de la placa

petri si hubo crecimiento microbiano, la fracción con la menor

concentración del extracto que no mostró ningún crecimiento, fue

la concentración mínima bactericida y la concentración que no

inhibió totalmente el crecimiento del microorganismo constituyó

la concentración mínima bacteriostática.


Determinación de la Concentración Mínima Bactericida y Bacteriostática MBC.
CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (MIC) Y CONCENTRACIÓN

MÍNIMA BACTERICIDA – BACTERIOSTÁTICA (CMB)

0.5 mL de Caldo del tubo Nº 2 al 10


Extracto

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Desechar


0.5 0.5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10(CN

0.5 mL del
inoculo

Estandarizar

Cultivo microbiano 0.5 Mc Farland

Incubar a 37ºC x 24 h. Lectura de resultados

10 1
9 2
1 1

8 3 Incubar a 37ºC x 24 h. 9 2

7 4 8 3
5
6
Siembra en placa con Agar Müeller-Hinton
7 4

6 5

Lectura de resultados
3. RESULTADOS
Estudio Fitoquímico (Cuadros elaborados por los Autores)

Cuadro 1

Resultados del secado de las semillas de Carica papaya L.

Secado Secado Peso Peso Humedad Humedad


Grupos en sombra en estufa inicial final
inicial final
Grupo Nº 1 25 días 15 días 2096g 361.0035g 76.58% 0.88%

Grupo Nº 2 20 días 10 días 3519g 626.5767g 78.27% 1.29%

Cuadro 2

Rendimiento de los Extractos Etanólico e Hidroalcohólico de las semillas de

Carica papaya L.

Extracto Peso semillas Rendimiento

Extracto EtOH-Agua (3:2) 100g 7,48%


Extracto Etanólico 100g 16,11%

Cuadro 3

Rendimientos de los Extractos Etanólico e Hidroalcohólico de las semillas

desengrasadas de Carica papaya L.

Extracto Peso inicial Rendimiento

Extracto EtOH-Agua (3:2) 210g 6.17%


Extracto Etanólico 210g 14.15%
Cuadro 4

Características organolépticas de los menstruos de la percolación etanólica de


semillas secas y semillas desengrasadas de Carica papaya L.

Extractos etanólicos
Aspecto: Translúcido
Color: Amarillo oscuro
Olor: Desagradable

Cuadro 5

Características organolépticas de los menstruos de la percolación


hidroalcohólica de semillas secas y semillas desengrasadas de Carica papaya L.

Extractos hidroalcoholicos
Aspecto: Ligeramente opaco
Color: Marrón claro
Olor: Desagradable

Cuadro 6

Características organolépticas de los extractos de etanólico e hidroalcohólico de

las semillas secas y desengrasadas de Carica papaya L.

Extracto Hidroalcohólico Extracto Etanólico


Aspecto: Opaco Opaco
Color: Marrón oscuro Marrón oscuro
Olor: Desagradable Desagradable
Cuadro 7

Resultados del “Screening” fitoquímico de las semillas de Carica papaya L.

Fracción Metabolitos Reacciones Resultado


Taninos Solución de gelatina +
Fracción A
Grupos fenólicos libres Solución de cloruro férrico +
Triterpenoides y esteroides Lieberman-Bouchard +
Fracción B
Antraquinonas Borntrager -
Triterpenoides y esteroides Lieberman-Bouchard -
Fracción C
Alcaloides Mayer, Hager, Dragendorff -
Triterpenoides y esteroides Lieberman-Bouchard -
Alcaloides Mayer, Hager, Dragendorff -
Fracción D
Leucoantocianidinas y catequinas Rosenheim -
Flavonoides Shinoda -
Leucoantocianidinas y catequinas Rosenheim -
Fracción E
Flavonoides Shinoda +
Fracción F Saponinas Prueba de la espuma -
+ (Presencia), - (Ausencia)
Estudio la Actividad antimicrobiana

CUADRO Nº 8

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LAS SEMILLAS DE LA ESPECIE Carica papaya L. POR EL


MÉTODO DE DIFUSIÓN: EXCAVACIÓN EN AGAR

Diámetro (mm) de la zona de inhibición a diferentes concentraciones


EXTRACTOS EXTRACTOS
HIDROALCOHÓLICOS ETANÓLICOS CONTROL
Microorganismos CONTROL
Extracto de Extracto Extracto de NEGATIVO
Extracto de POSITIVO
Semillas EtOH-Agua
Semillas de semillas
Desengrasadas GENTAMICINA
700 700 (3:2)
Concentración Puro Puro semillas Desengrasadas
mg/mL mg/mL
Candida albicans ATCC 10231 13 12 13 14 - - - -
Escherichia coli ATCC 25922 14 13 13 12 - - 32 10
Enterococcus faecalis ATCC 29212 12 13 20 19 19 19 25 -
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 12 11 19 18 - - 32 -
Staphylococcus aureus ATCC 25923 11 12 9 10 16 16 24 9

- : No presenta halo de inhibición


CUADRO Nº 9

PORCENTAJE DE INHIBICIÓN RELATIVA (PIR) DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS DE


SEMILLAS DE Carica papaya L. A DIFERENTES CONCENTRACIONES

PIR (%)
EXTRACTOS
EXTRACTOS HIDROALCOHÓLICOS
ETANÓLICOS
Extracto Semillas
Microorganismos Extracto Semillas Extracto
Desengrasadas Extracto
Semillas
Semillas
Desengrasadas
Total 700 mg Total 700 mg

Candida albicans ATCC 10231 - - - - - -

Escherichia coli ATCC 25922 44 41 41 38 - -

Enterococcus faecalis ATCC 29212 48 52 80 76 76 76

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 38 34 59 56 - -

Staphylococcus aureus ATCC 25923 46 50 38 42 67 67

- : No presenta halo de inhibición


CUADRO Nº 10

RESULTADOS DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (MIC) DE LOS DIFERENTES EXTRACTOS DE LAS


SEMILLAS DE Carica papaya L., FRENTE A LOS MICROORGANISMOS
CONCENTRACION DECRECIENTE DE LOS EXTRACTOS
HIDROALCOHÓLICOS
EXTRACTOS
MICROORGANISMOS Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo
Nº 1 Nº 2 Nº 3 Nº 4 Nº 5 Nº 6 Nº 7 Nº 8 Nº 9 Nº 10
Concentración mg/mL 500 250 125 62,5 31,25 15,63 7,81 3,91 1,95 CN
Pseudomonas aeruginosa Ext. Hidroalcohólico total -- -- + + + + + + + +
ATCC 27853 Ext. Hidroalcohólico total desengrasado -- -- + + + + + + + +
Staphylococcus aureus Ext. Hidroalcohólico total -- -- + + + + + + + +
ATCC 25923 Ext. Hidroalcohólico total desengrasado -- -- + + + + + + + +
Candida albicans Ext. Hidroalcohólico total -- -- -- -- -- + + + + +
ATCC 10231 Ext. Hidroalcohólico total desengrasado -- -- -- -- -- -- -- -- + +
Escherichia coli Ext. Hidroalcohólico total -- -- -- + + + + + + +
ATCC 25922 Ext. Hidroalcohólico total desengrasado -- -- -- + + + + + + +
Enterococcus faecalis Ext. Hidroalcohólico total -- -- + + + + + + + +
ATCC 29212 Ext. Hidroalcohólico total desengrasado -- -- + + + + + + + +
-- : Sin crecimiento microbiano
+ : Crecimiento microbiano
CN : Caldo Nutritivo solamente
CUADRO Nº 11

RESULTADOS DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA BACTERICIDA Y BACTERIOSTÁTICA (CMB) DE LOS DIFERENTES


EXTRACTOS DE LAS SEMILLAS DE Carica papaya L., FRENTE A LOS MICROORGANISMOS

CONCENTRACIÓN MÍNIMA CONCENTRACIÓN MÍNIMA


MICROORGANISMOS EXTRACTOS
BATERICIDA BACTERIOSTÁTICA

Pseudomona aeruginosa Ext. Hidroalcohólico total 250 mg/mL 125 mg/mL


ATCC 27853 Ext. Hidroalcohólico total desengrasado 250 mg/mL 125 mg/mL
Staphylococcus aureus Ext. Hidroalcohólico total 250 mg/mL 125 mg/mL
ATCC 25923 Ext. Hidroalcohólico total desengrasado 250 mg/mL 125 mg/mL
Candida albicans Ext. Hidroalcohólico total 31,25 mg/mL 15,63 mg/mL
ATCC 10231 Ext. Hidroalcohólico total desengrasado 3,91 mg/mL 1,95 mg/mL
Escherichia coli Ext. Hidroalcohólico total 125 mg/mL 62,5 mg/mL
ATCC 25922 Ext. Hidroalcohólico total desengrasado 125 mg/mL 62,5 mg/mL
Enterococcus faecalis Ext. Hidroalcohólico total 250 mg/mL 125 mg/mL
ATCC 29212 Ext. Hidroalcohólico total desengrasado 250 mg/mL 125 mg/mL
4. DISCUSIÓN

Las semillas de Carica papaya L. presentan en su composición gran cantidad

de grasa por lo que para evitar interferencias durante el proceso de “screening” se

procedió a desengrasarlas con éter de petróleo. Tanto a las muestras secas como a las

muestras desengrasadas se les realizó un “screening” fitoquímico, encontrándose en

ambos casos la presencia de taninos, triterpenoides y/o esteroides y flavonoides

(cuadro Nº 7).

En la extracción por percolación o lixiviación se presentan diferencias

marcadas en las características organolépticas de los menstruos etanólico e

hidroalcohólico (cuadros Nº 4 y 5). También en los rendimientos de cada extracto

obtenido (cuadros Nº 2 y 3), notándose mayor porcentaje en los etanólicos, esto

posiblemente se deba al mayor grado alcohólico; sin embargo no representa la mejor

actividad antimicrobiana. La lixiviación para la obtención de los principios activos

se realizó bajo las mismas condiciones para ambos extractos (extracto etanólico y

extracto hidroalcohólico).

En la determinación de la actividad antimicrobiana de las semillas de la

especie Carica papaya L. por el método de difusión mediante excavación en agar, se

observó que los extractos hidroalcohólicos evidenciaron actividad antimicrobiana

contra los 5 microorganismos confrontados, determinándose mayor actividad con los

extractos hidroalcohólicos de semillas desengrasadas frente a Enterococcus faecalis

y Pseudomona aeruginosa registrándose valores menores para los otros


microorganismos, siendo estos similares a los observados con los extractos

hidroalcohólicos de semillas secas; mientras que los extractos etanólicos mostraron

actividad frente a Enterococcus faecalis y Staphylococcus aureus (cuadro Nº 8). Al

parecer en los extractos etanólicos no se logra extraer a los metabolitos responsables

de la actividad contra bacterias gramnegativas, según lo observado en los resultados

donde si evidenció actividad antimicrobiana contra bacterias grampositivas; mientras

que los extractos hidroalcohólicos mostraron actividad antimicrobiana tanto frente a

microorganismos grampositivos y gramnegativos.

En la determinación de la concentración mínima bactericida y bacteriostática

(CMB) los extractos hidroalcohólicos, a la concentración de 250mg/mL, inhibieron

el crecimiento tanto de las bacterias grampositivas como gramnegativas. El extracto

hidroalcohólico de las semillas sin desengrasar presenta mayor actividad que el

extracto hidroalcohólico de semillas desengrasadas, frente a Candida albicans

ATCC 10231, con MIC de 3.91mg/mL y 31.25mg/mL respectivamente. Estas

concentraciones observadas menores para la Candida albicans ATCC 10231 y

mayores para las bacterias se deben a las diferencias estructurales constitutivas entre

microorganismos donde las bacterias presentan pared celular como estructura celular

más externa componente que no presenta la levadura Candida albicans ATCC

10231; siendo la parte vital mas periférica la membrana plasmática, así también estas

presentan un núcleo definido y diferentes organelas a comparación de las bacterias

que no presentan un núcleo verdadero (con envoltura celular) y solo ribosoma como

organela.
CONCLUSIONES

1. En el “screening” fitoquímico realizado a las semillas secas y semillas

desengrasadas se detectaron la presencia de los siguientes metabolitos

secundarios: taninos, triterpenoides y/o esteroides y flavonoides.

2. Los extractos etanólicos (de semillas secas y semillas desengrasadas) mostraron

actividad frente a Enterococcus faecalis ATCC 29212 y Staphylococcus aureus

ATCC 25923.

3. Los extractos hidroalcohólico (de semillas secas y semillas desengrasadas)

evidenciaron actividad antimicrobiana contra los 5 microorganismos

confrontados: Candida albicans ATCC 10231, Escherichia coli ATCC 25922,

Enterococcus faecalis ATCC 29212, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,

Staphylococcus aureus ATCC 25923.

4. Se determinó mayor actividad con el extracto hidroalcohólico de semillas secas

desengrasadas frente a Enterococcus faecalis y Pseudomona aeruginosa.

5. El extracto hidroalcohólico de las semillas sin desengrasar dio los siguientes

valores de MIC = 3,91mg/mL para Candida albicans ATCC 10231, con el

extracto hidroalcohólico total fue de 31,25mg/mL;

6. Ambos extractos hidroalcohólicos presentan MIC = 125 mg/mL. Para

Escherichia coli ATCC 25922.

7. Ambos extractos hidroalcohólicos presentan MIC = 250mg/mL. para

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923 y

Enterococcus faecalis ATCC 29212.


RECOMENDACIONES

1. Profundizar la investigación de la actividad antimicrobiana hallada en las

semillas de Carica papaya L. “papaya” con diferentes tipos de extractos y/o

cepas de microorganismos patógenos.

2. Realizar evaluaciones IN VIVO en animales de experimentación para comprobar

la actividad antimicrobiana y otras propiedades.


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ANEXO Nº 1
ANEXO Nº 2