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Células Estaminais
Catarina Brito
anabrito@itqb.unl.pt
Biotecnologia Molecular
FCUL
4 de Maio de 2009
Células Estaminais
Características
As células estaminais são definidas por 3 características fundamentais:
célula
estaminal • Indiferenciação
células não-especializadas.
AUTO
RENOVAÇÃO
DIFERENCIAÇÃO
• Capacidade de auto-renovação ilimitada
capacidade de se dividir durante períodos
indefinidos, muitas vezes durante toda a vida do
organismo, originando células indiferenciadas.
• Potencial de diferenciação
célula
estaminais
Sob condições apropriadas e / ou na presença
dos sinais adequados podem dar origem a
diferentes tipos de células, com características e
célula funções especializadas.
especializadas
4 de Maio de 2009
04/05/2009 1
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Laboratório de Tecnologia de Células Animais
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Células Estaminais
Características
Auto-renovação vs Diferenciação
4 de Maio de 2009
Células Estaminais
Características
Regulação da auto-renovação
Extrínseca - Apenas 1 das células-filha fique em contacto com o ambiente que confere a
identidade às células estaminais – o chamado nicho estaminal
4 de Maio de 2009
04/05/2009 2
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4 de Maio de 2009
Células Estaminais
do Cordão Umbilical
Células Estaminais da Placenta
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04/05/2009 3
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Plasticity ?
Plasticity ?
4 de Maio de 2009
04/05/2009 4
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NIH, 2008
4 de Maio de 2009
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04/05/2009 5
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- possibilidade de
reactivação dos genes de
vectores retrovirais, com integração no genoma
reprogramação
(oncogénicos) e/ou
Novos Métodos activação de oncogenes por
integração no genoma
formação de tumores
vectores adenovirais - sem integração no genoma
- expressão residual dos
transgenes poderá ser
responsável por diferenças
vectores plasmídicos - sem integração no genoma
observadas no potencial de
diferenciação de células iPS
4 de Maio de 2009
-proteínas recombinantes com caudas poliarginina … ainda pouco eficiente mas promissor
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4 de Maio de 2009
Laboriosos e difíceis
de adaptar a grande
escala
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4 de Maio de 2009
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DAPI SSEA-3
DAPI TRA-1-81
DAPI SSEA-4
DAPI TRA-1-60
corpos embrióides
-agregados esféricos de células estaminais
embrionárias
-assemelham-se a blastocisto – camada
externa de endoderme primitiva e presença
de células estaminais e ectoderme primitiva
no interior
-após alguns dias de cultura apresentam
células das 3 camadas germinativas
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04/05/2009 9
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4 de Maio de 2009
4 de Maio de 2009
04/05/2009 10
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cardiomiócitos
Uma célula estaminal adulta é uma célula indiferenciada (não especializada) que se encontra
num tecido especializado (diferenciado)
medula óssea
sangue periférico
mucosa olfactiva
córnea e retina
polpa dentária
fígado
pele
tracto gastrointestinal
pâncreas
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04/05/2009 11
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Terapia Celular
Definição
Consiste na prevenção ou tratamento de
doenças humanas através da administração de
células que foram seleccionadas, multiplicadas
e farmacologicamente tratadas ou alteradas
fora do organismo.
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04/05/2009 12
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Sangue periférico
Fonte mais recente (últimos 10 anos), desde que se
descobriu que as células migram da medula óssea para a
corrente sanguínea depois de injectar o dador com uma
citocina.
Protocolo: O dador é injectado com G-CSF dias antes da recolha
de células. As células são recolhidas através de um tubo
intravenoso inserido na veia do dador e passam através de um
sistema de filtração que separa as células CD34+, sendo todas as
outras células devolvidas ao dador.
Cerca de 5-20% das células recolhidas são de facto células
estaminais
4 de Maio de 2009
Embora o sangue de cordão umbilical represente uma fonte valiosa de HSCs, não existem dados
conclusivos sobre diferenças qualitativas entre as células obtida desta fonte e as obtidas da medula
óssea ou sangue periférico
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Características:
- suporte do crescimento e da expansão das células estaminais hematopoiéticas,
promovendo igualmente o seu enxerto quando aplicadas em conjunto.
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Células estaminais
multipotentes
Células Estaminais Neuronais
Características:
- capacidade de diferenciar nos 3
tipos de células neuronais:
neurónios, astrócitos,
oligodendrócitos;
-crescimento em neurosferas
Day 44
Astrócitos (GFAP)
Neurónios (NF-L)
Núcleos
50 µm
4 de Maio
Sa Santos et al (2007) Journal de 2009 Research, 85: 3386-97
Neuroscience
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CÉLULAS ESTAMINAIS
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in vitro Toxicology
Drug Screening
Cellular Therapy
Tissue Engineering
DIFERENTIATION
AMOUNT and PURITY (e.g. eliminate undiferentiated cells to avoid teratomas
formation after transplantation)
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Challenges:
Development of culture strategies capable of integrating
both expansion and differentiation processes in
bioreactors
Scalability Automation
Scale-
Scale-up of differentiated cells to clinically relevant numbers
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stirred-
stirred-tank bioreactors for
3D-
3D-culture of clinical relevant cells Å aggregates
Å capsules
agitation
Non invasive monitoring:
Controlled Cell expansion;
pH Environment pO2
Cell viability;
Metabolic performance;
temperature Cell function.
However...
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-Expression of pluripotent
stem cell markers;
-Can give rise to cells of the 3
germ layers.
Retinoic Acid
Treatment
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Transplantation
Specific culture conditions
SUCCESSFUL ENGRAFTMENT
ANIMAL MODELS:
RA treatment MI treatment
Replate Replate
Limitations...
8 Laborious 8 Difficult to control
8 Low differentiation efficciency (3.2%) 8 Scaleability
8 Time consuming (2 months) 8 Reproducibility
8 Monitoring
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AIM
Improvement of a reproducible bioprocess for the up-scaling
expansion of human neurons
Æ Inoculum density
Æ Culture operation mode
2 SP- 0.4
Day 3 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
t (day)
SP-1 SP- 4
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Glucose Fed-batch
Æ Reduce lactate production
Glucose feeding was performed twice a day and maintaned at low levels (<1.4 mM) throughout culture time
• Culture Operation Mode: Batch (SP-4), Fed-batch (SP-4FB) and Media Exchange (SP-4ME)
20
SP- 4 SP-4FB SP-4ME SP-4ME
Cell Concentration
16
(x 105 cell/mL)
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
t (day)
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• Culture Operation Mode: Batch (SP-4), Fed-batch (SP-4FB) and Media Exchange (SP-4ME)
day 2 day 4 5
Ammonia
q GLC (nmol.10-6cell.day -1) qGLC day 3 day 5 4 SP-4
30
Am m onia (m M)
3 SP- 4FB
20
SP-4ME
2
10
1
0
0
SP-4 SP-4FB SP-4ME
0 1 2 3 4 5 6 7 8
2,5
t (day)
30 SP- 4FB
1,5
qLDH cum
20 1
SP-4ME
10 0,5
0
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
SP-4 SP-4FB SP-4ME
t (day)
2
Decrease in viability from day 5 onwards
to accumulation of toxic metabolites
Accumulation of toxic metabolites (Ammonia)
Possibly depletion of essential nutrients
DAY 0
Inoculum (Control)
BIOREACTOR
CULTURE
DAY 3
Exponential growth
DAY 6
After expansion
100 μm
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DAY 0
Inoculum (Control)
94.8% 88.7%
positive cells positive cells
DAY 3
Exponential growth
97.2% 94.6%
positive cells positive cells
The high levels of Oct-4 and TRA-1-60 obtained for the cells of the
inoculum were maintained at day 3 of the bioreactor culture
DAY 0
Inoculum (Control)
BIOREACTOR
CULTURE
DAY 3
Exponential growth
DAY 6
After expansion
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DAY 0
Inoculum (Control)
BIOREACTOR
CULTURE
DAY 3
Exponential growth
DAY 6
After expansion
The differentiated neurons were identified by MAP2 and βIII-Tub positive staining
12
BR- 4ME
8
Next step: 4
0
● Integrate neuronal differentiation step in the 0 1 2 3 4 5 6 7 8
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Expansion
1. Neuronal differentiation was induced by addition of
retinoic acid (10μM) when cells achieved the middle of
DAY 3 the exponential growth phase – day 3
BIOREACTOR CULTURE
Differentiation
2. Neuronal differentiation period was prolonged for 3
weeks
DAY 9
1 week
DAY 16
2 weeks During neuronal differentiation:
Cryosection
Differentiation
Immunofluorescence
Microscopy
DAY 9 3 days
Nestin Æ precursor cells
1 week
βIII-Tub Æ neurons
3 days
DAY 16
2 weeks
3 days
DAY 23
3 weeks
3 days post-seeding
y Cultures derived from neurospheres harvested at day 23 were richer in neurons and
presented more developed neuritic networks than the neurosperes harvested at day 16
y On neurospheres harvested earlier, precursor cells predominated
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Expansion
4. Neurons were harvested after 7 days of culture on coated flasks
by selective trypsinization
DAY 3
MI cultivation
BIOREACTOR CULTURE
Differentiation
BIOREACTOR STATIC
CULTURE CULTURE
DAY 9
1 week
7 days 0.1%
16 days
DAY 16
2 weeks
7 days 17,2%
23 days
DAY 23
3 weeks 7 days 37.4%
30 days
3.2%
48 days
Number of neurons
7 days post-seeding N Diff efficiency =
Number of total cells harvested from the bioreactor
y The fraction of neurons increased throughout bioreactor culture time
y The bioreactor culture improved the neuronal differentiation efficiency by up to 10-fold and reduced the time of
the differentiation process, when compared to static culture
y At the end of the process pure cultures of neurons (99-100%) were obtained
Conclusions
Large scale expansion of human neurons was successfully developed
using stirred bioreactors, by integrating human NT2 cell expansion and
differentiation in a two-step bioprocess
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Bibliography
BOOKS
•Lanza et al (eds) “HandBook of Stem Cells” (2004)
•“Cell Culture Technology for Pharmaceutical and cell based therapies” S Ozturk and
Wei-Shou Hu (2006)
•J.R. Masters, B.O. Palsson and J.A. Thomson (eds.): Human Cell Culture, Volume
VI. Embryonic Stem Cells (2007).
•Santos SS, Leite SB, Sonnewald U, Carrondo MJ and Alves PM (2007). Stirred vessel cultures
of rat brain cells aggregates: characterization of major metabolic pathways and cell population
dynamics. J Neurosci Res 85, 3386-3397
•Serra M, Leite SB, Brito C, Costa J, Carrondo MJ and Alves PM (2007). Novel culture strategy
for human stem cell proliferation and neuronal differentiation. J Neurosci Res 85, 3557-3566.
•Serra M, Brito C, Leite SB, Gorjup E, von Briesen H, Carrondo MJ and Alves PM (2009). Stirred
bioreactors for the expansion of adult pancreatic stem cells. Ann Anat 191, 104-115.
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