Reacción en Cadena de La Poli

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Reacción en cadena de la polimerasa

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La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como

PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction),
es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por
Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de
copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un
mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese
fragmento original, o molde.
Gel de agarosa teñido con bromuro
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su de etidio que muestra varios
utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil productos de PCR obtenidos
identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias mediante distintos cebadores, con
causantes de una enfermedad, identificar personas un bajo nivel de especificidad.
(cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN
amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han
hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo
necesario para llevarla a cabo.
Contenido
■ 1 Fundamento e importancia
■ 2 Reactivos
■ 3 Ciclo de amplificación
■ 3.1 Inicialización
■ 3.2 Desnaturalización
■ 3.3 Alineamiento o unión del cebador
■ 3.4 Extensión o elongación de la cadena
■ 3.5 Elongación final
■ 3.6 Conservación
■ 3.7 Optimización de la PCR
■ 4 Tipos de PCR
■ 4.1 PCR anidada
■ 4.2 PCR in situ
■ 4.3 PCR múltiplex
■ 4.4 PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)
■ 4.5 PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR)
■ 4.6 Variaciones de la PCR básica
■ 5 Aplicaciones
■ 5.1 Investigación
■ 5.2 Medicina
■ 5.3 Paleontología, antropología biológica, y ciencias forenses
■ 5.4 Agronomía y diversidad
■ 6 Historia
■ 6.1 Guerras de patentes
■ 7 Referencias
■ 7.1 Citadas en el texto
http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa 13/01/2011
■ 7.2 Referencias generales

■ 8 Enlaces externos
Fundamento e importancia
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de
ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de
ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a
unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. La reacción en cadena de la polimerasa fue
desarrollada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California SA, en la década de
1980.
Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios
de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las
temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata
desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de
microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres
vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq),
Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth).
Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer
corrección de errores (Pfu, Vent).
Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante

un aparato llamado termociclador, que permite calentar y
enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura
necesaria para cada etapa de la reacción (ver más abajo).
Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto
Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos
simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos
usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece
una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance
rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los
termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de
cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de
reacción. Los termocicladores más antiguos que carecían de Termociclador: aparato en el que se
este sistema, solucionaban el problema de la condensación efectúa la PCR convencional.
con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de
reacción o con un poco de cera dentro de los tubos.
Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de

investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la
clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes,
el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas
forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.
Reactivos
Para realizar la técnica se necesitan:2
■ Los 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP),

sustratos para polimerizar nuevo ADN.
■ Dos cebadores o iniciadores (en inglés, primers),
oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a
una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas,
de entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de
18 a 22, que permiten que la polimerasa inicie la
reacción. Deben estar situados enfrentados y a no
mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a
amplificar, es decir, corresponden a los nucleótidos que
definen los extremos de la secuencia que se desea
replicar. Tubos de PCR que albergan la
■ Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), mezcla en un volumen total de 100
agregado comúnmente como cloruro de magnesio µL.
(MgCl2), o algún otro catión divalente. También se
puede emplear manganeso (Mn2+), para mutagénesis de
ADN mediante PCR, ya que altas concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error
durante la síntesis de ADN. Actúan como cofactores de la polimerasa.
■ Iones monovalentes, como el potasio.
■ Una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN
polimerasa.
■ ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70 °C
(la más común es la polimerasa Taq).
■ ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.
■ Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las
etapas que conforman un ciclo.
Ciclo de amplificación
El proceso de PCR por lo general consiste en una
serie de 20 a 35 cambios repetidos de
temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele
consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas.
La PCR común se realiza con ciclos que tienen
tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a
menudo están precedidos por un choque térmico Grado de amplificación según el número de
(llamado "hold") a alta temperatura (> 90 °C), y ciclos empleados. A: gel de agarosa (1: ladder, 2:
seguido por otro hold al final del proceso para la producto específico, 3: producto inespecífico); B
extensión de producto final o el breve concentración de ADN respecto del tiempo; C
almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo logaritmo de la concentración de ADN respecto
aplicado en cada ciclo dependen de gran del tiempo.
variedad de parámetros. Éstos incluyen la
enzima usada para la síntesis de ADN, la
concentración de iones divalentes y de los dNTP en la reacción, y la temperatura de unión de los
cebadores, así como la longitud del ADN que se desea amplificar. 2
Inicialización
Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si se está usando
una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo es necesario
para ADN polimerasas que requieran activación por calor.
Desnaturalización
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se

separan las dos hebras de las cuales está
constituido). Este paso puede realizarse de
diferentes modos, siendo el calentamiento (94-
95 °C) de la muestra la forma más habitual. La
temperatura a la cual se decide realizar la
desnaturalización depende, por ejemplo, de la
proporción de G+C que tenga la hebra, como
también del largo de la misma. Otros métodos,
raramente empleados en la técnica de la PCR,
serían la adición de sales o agentes químicos
capaces de realizar la desnaturalización.
Alineamiento o unión del cebador
A continuación se producirá la hibridación del

cebador, es decir, el cebador se unirá a su
secuencia complementaria en el ADN molde.
Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-
68 °C durante 20-40 segundos (según el caso),
permitiendo así el alineamiento. Los puentes de
hidrógeno estables entre las cadenas de ADN
(unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la
secuencia del cebador es muy similar a la
secuencia del ADN molde. La polimerasa une el
híbrido de la cadena molde y el cebador, y
empieza a sintetizar ADN. Los cebadores
actuarán como límites de la región de la
molécula que va a ser amplificada.
Extensión o elongación de la cadena
Actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN

molde para sintetizar la cadena complementaria
y partiendo del cebador como soporte inicial Esquema general de la PCR.
necesario para la síntesis de nuevo ADN. La
polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN
complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3',
uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN
creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende de la ADN polimerasa que
usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad está en 75-80 °C (comúnmente
72 °C). El tiempo de extensión depende tanto de la ADN polimerasa usada como de la longitud del
fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla comúnmente usada: en su temperatura
óptima, la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto.
Elongación final
Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tras el último
ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente
ampliado.
Conservación
Este paso se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para conservar la reacción a corto
plazo.
La PCR normalmente se realiza con un volumen de reacción de 15-100 µL, en pequeños tubos de 0.2
-0.5 mL que se colocan en el termociclador.
Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean técnicas de
electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga, esto es,
longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamaño: típicamente se
emplean la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes; en acrilamida, para los más
pequeños; y, de forma más rápida y aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente, la
electroforesis capilar.3 El/los tamaño/s de los productos de la PCR vienen determinados por un
marcador de peso molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamaño conocido, y
que se corre en el gel junto con los productos de PCR.
Optimización de la PCR
En la práctica, la PCR puede fallar por varias razones, pero normalmente es debido a su sensibilidad
a la contaminación, que a veces provoca la amplificación de ADN "falso". Por esto, se han
desarrollado un gran número de técnicas y procesos para optimizar la PCR:
■ La contaminación con ADN extraños puede solucionarse con protocolos y procedimientos que
separen las reacciones pre-PCR de los contaminantes potenciales del ADN. Esto normalmente
implica la separación espacial de las áreas de realización de la PCR de las de análisis o
purificación de los productos de PCR, y la limpieza exhaustiva de la superficie de trabajo entre
la realización de una PCR y la siguiente.
■ Las técnicas de diseño de cebadores son importantes en la mejora de la obtención de productos
de PCR y en evitar la formación de productos falsos, y el uso de componentes alternativos
para los buffers o las enzimas polimerasas pueden ayudar en la amplificación de regiones de
ADN largas o, de cualquier otra forma, problemáticas.
Tipos de PCR
PCR anidada
Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado como molde
para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia
amplificada. Este tipo de PCR es muy específica.
PCR in situ
La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los
productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada sobre
preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in situ se realiza una primera

amplificación de ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional con
sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas de genoma. Esta
tecnología es de gran alcance en la capacidad de amplificar específicamente una población de
secuencias de menor representación.
PCR múltiplex
PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. Emplea dos o más pares
de cebadores en único tubo con el fin de amplificar simultáneamente múltiples segmentos de ADN.
Consiste en combinar en una única reacción todos pares de cebadores de los sistemas que queremos
amplificar simultáneamente, junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades
suficientes. Sus ventajas: se obtiene la información de varios loci en una sola reacción, menor
cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de reactivos, rápida construcción de base de
datos.
PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)
Donde el molde inicial es ARN y se requiere de una transcriptasa inversa, como Tth, para realizar la
síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc).
PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR)
Reacción de PCR cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN
presentes en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN
específicas a partir de su temperatura de fusión (también denominado valor Tm, del inglés melting
temperature).
Se puede dividir en las técnicas basadas en fluorocromos no específicos y en las técnicas basadas en
sondas específicas.
En las técnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo, se
une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el
termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar sólo una secuencia por reacción
pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su realización. Es mucho más económica
que la que usa sondas específicas.
Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida
en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse); cuando la sonda está
intacta, presenta una transferencia energética de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET
no se produce cuando la sonda está dañada y los dos fluorocromos están distantes, producto de la
actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrón de
fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen.
La mayoría de estos inconvenientes se han solucionado con la introducción de la PCR realizada en

tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza la progresión
de la amplificación en el momento en que ocurre. A diferencia de la PCR convencional (en punto
final), que mide la acumulación del ADN al final de un número predeterminado de ciclos, con Q-
PCR esto se hace durante el proceso de amplificación usando fluorescencia, de forma que su
aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso se puede automatizar fácilmente
usando un sistema que realice la amplificación (termociclador) y que a su vez sea capaz de leer
fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el mercado. La mayoría pueden trabajar con
las diversas opciones de marcado fluorescente y son "abiertos", es decir, permiten programar las
condiciones de amplificación y lectura de forma que su uso no queda limitado a unos reactivos
determinados.
Variaciones de la PCR básica

■ PCR específica de alelo: esta técnica de diagnóstico o clonación es usada para identificar o
utilizar los polimorfismos de una sola base (SNPs).
■ PCR "assembly": consiste en la síntesis artificial de largas secuencias de ADN, realizando para
ello la PCR en un fondo de oligonucleótidos largos con secuencias solapantes cortas.
■ PCR asimétrica: es usada para amplificar preferentemente una cadena del ADN original con
respecto a la otra.
■ PCR de colonia: mediante esta técnica, colonias de bacterias Escherichia coli pueden ser
rápidamente examinadas para construcciones viables de vectores de ADN.
■ Amplificación dependiente de helicasa: esta técnica es muy parecida a la PCR convencional,

pero en ella se emplea la enzima helicasa y una temperatura constante en lugar de la
polimerasa de ADN y los ciclos repetidos de desnaturalización-extensión.
■ PCR hot-start: esta técnica reduce la amplificación inespecífica durante las etapas iniciales de
la PCR.
■ PCR específica de intersecuencia (ISSR): se trata de un método de PCR para su uso en huella
genética, que amplifica regiones entre repeticiones de secuencia simple para producir una
huella genética única de longitudes de fragmento amplificadas.
■ PCR inversa: es un método usado para poder realizar la PCR cuando sólo es conocida una
secuencia interna. Muy útil en la identificación de secuencias que flanquean insertos
genómicos.
■ PCR mediada por ligación: este método usa pequeños linkers de ADN ligados al ADN de
interés y múltiples cebadores hibridando estos linkers.
■ PCR específica de metilación (MSP): se usa para detectar metilaciones en islas CpG de ADN
genómico.
■ Amplificación Múltiple Dependiente de Sonda (Multiplex Ligation-dependent Probe

Amplification o MLPA): permite amplificar varias secuencias objetivo con un único par de
cebadores, evitando así las limitaciones de resolución de la PCR multiplex.
■ PCR cuantitativa: se usa para medir la cantidad de un producto de PCR (preferentemente en

tiempo real).
■ PCR-TAIL: la PCR termal de entrelazado asimétrico es usada para aislar una secuencia
desconocida que flanquea una secuencia conocida.
■ PCR touchdown: se trata de una variante de la PCR que se emplea cuando se desconoce la
secuencia exacta de los extremos de la secuencia a amplificar, de modo que se asume que
puede existir alguna base desapareada en el alineamiento cebador-secuencia. Su finalidad es
reducir el fondo no específico bajando gradualmente la temperatura de hibridación a lo largo
del progreso de la PCR.
■ PAN-AC: este método usa condiciones isotermas para la amplificación, y puede ser usado en
células vivas.
Aplicaciones
La técnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: ya en ciencia básica, como herramienta de
detección y/o generación de acervos de fragmentos de ADN de interés; ya en ciencia aplicada, como
elemento resolutivo en sí mismo, por ejemplo en diagnóstico clínico.
Investigación
La PCR convencional se emplea como base para multitud de técnicas en el laboratorio debido a su
robustez y rapidez. De este modo, la PCR de punto final permite controlar y detectar los fragmentos
de ADN de interés.
Una aplicación de la PCR de extrema importancia es la

clonación de secuencias de ADN en vectores, como pueden
ser los plásmidos. Para ello, se emplean cebadores que
contienen en su extremo 5' una corta secuencia que permite la
interacción posterior con otra complementaria situada en el
vector de clonación a emplear. Por ejemplo, se puede incluir
una diana de restricción en dichos cebadores, de modo que, y
si ésta no existía previamente en el fragmento y es única en el
vector, pueda efectuarse una ligación mediante la ligasa de
T4 tras la digestión con la enzima de restricción apropiada de
ambos elementos. Otro método asimilable a esta vía es el
empleo de la recombinación dirigida; esto es, se adapta al 5'
de los cebadores una secuencia que faculta a una
recombinasa la recombinación dirigida con un vector dado.4
Clonación de un segmento de ADN
Medicina mediante amplificación con
cebadores que contienen una
En medicina, la PCR se emplea fundamentalmente como secuencia apta para la
recombinación dirigida con un
herramienta de diagnosis (Coleman y Tsongalis, 2006): plásmido.
■ Permite el genotipar la especie o especies que provocan
un determinado cuadro infeccioso: para ello, se amplifica una zona del genoma bacteriano
cuyo producto de PCR posea unas características de tamaño o temperatura de fusión que
permitan identificarlo de forma inequívoca. En el caso de infecciones virales que implican la
integración del genoma del patógeno en el ADN del hospedador, como es el de la infección
por VIH, la PCR cuantitativa posibilita la determinación de la carga viral existente y por tanto,
del estadio de la enfermedad.5
■ La PCR también se puede usar en revisiones médicas rutinarias, como en los servicios de
donantes de sangre, para test de rutina. A través de esta técnica se pueden detectar infecciones
peligrosas en el donante (como VIH o Hepatitis B) mientras aún están en el periodo de
incubación. Dada la sensibilidad de los test de PCR se pueden tomar muestras colectivas o
"pools" (por ejemplo, 96 pruebas individuales). Si una de estas muestras colectivas da
positivo, se toman a partir de ella muestras progresivamente menores hasta que se encuentra el
causante.
■ El diagnóstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma es un proceso largo y
complicado que puede acortarse significativamente gracias a la PCR. Cada uno de los genes
prueba se pueden amplificar mediante sus correspondientes cebadores y posteriormente
secuenciar para detectar la existencia de mutaciones.
Paleontología, antropología biológica, y ciencias forenses
Los campos de la paleontología, antropología biológica y la medicina y antropología forense se han

visto enormemente beneficiados por esta técnica, puesto que todas ellas construyen con frecuencia el
conocimiento de sus correspondientes disciplinas gracias a restos o huellas de seres vivos. Uno de
los materiales biológicos que más información puede proporcionar es el ADN.
La relativa estabilidad de éste permite que, aunque fragmentado, se conserve durante largos períodos
si las condiciones son propicias.4 En ocasiones las muestras intactas con las que se puede contar son
extraordinariamente pequeñas o están deterioradas. La PCR soluciona ambos problemas y
proporciona cantidades útiles para posteriores pasos de análisis. En primer lugar aumenta la cantidad
de material recuperado a partir de muestras escasas, puesto que como ya se dijo anteriormente, en
teoría basta una sola molécula para que el proceso pueda tener lugar. También debido a la naturaleza
de la técnica y su propósito de amplificación de fragmentos pequeños, esta fragmentación no impide
que este ADN pueda ser empleado como molde para una reacción de PCR.
■ En paleontología y Antropología la PCR permite recuperar las escasas cantidades de ADN que
aún no se han degradado. Algunos lugares en que el ADN podría preservarse son la brea las
cenizas volcánicas, el ámbar, hielos históricos polares o glaciares y ambientes áridos,
sedimentos, así como en los cristales de apatita de restos de esqueleto,6 siendo posible de ese
modo caracterizar cadáveres, fósiles u otros restos mediante genotipado por análisis de
microsatélites o incluso genomas de taxones extintos, amplificados de este modo, como
pueden ser los realizados mediante el ADN genómico del hombre de Neanderthal.7 El
propósito sería utilizar este ADN amplificado para posteriormente realizar estudios
filogenéticos o etnográficos o de poblaciones mediante la comparación de secuencias de ADN,
o el estudio de las causas de la separación evolutiva de dos especies.
■ En las ciencias forenses se emplea para establecer la filiación de una persona o para obtener
pruebas a partir de muestras mínimas dejadas por el autor de un crimen como saliva, semen u
otros restos de tejidos (Butler, 2005).
Agronomía y diversidad
Tal y como la PCR multiplex permite producir huellas genéticas de individuos concretos, dentro del
marco de la genética forense, existen métodos basados en la PCR que permiten discernir entre
grupos infraespecíficos de cultivos de interés agronómico; por ejemplo, de cultivares.8 Para ello, se
emplean oligonucleótidos de un tamaño lo suficientemente pequeño como para que ceben de forma
relativamente inespecífica, aunque siempre de tal forma que produzcan un patrón de bandas discreto
e interpretable. De este modo, la pauta obtenida tras la electroforesis de los fragmentos tiende a
agrupar a los individuos de mayor semejanza, que poseen un comportamiento similar, de los que
divergen...
Historia
En 1971, un artículo publicado por Kleppe et al. en Journal
of Molecular Biology describió por primera vez un método
que usaba enzimas para replicar una secuencia pequeña de
ADN con cebadores in vitro.9 Sin embargo, este temprano
ejemplo del principio básico de la PCR no recibió mucha
atención, y la invención de la reacción en cadena de la
polimerasa en 1983 es generalmente atribuida a Kary
Mullis.10 11 Mullis ganó el Premio Nobel por su trabajo en Electroforesis de proteínas SDS-
PCR. PAGE resolviendo la polimerasa
Taq.
Algo muy a tener en cuenta en la PCR es que la ADN
polimerasa que se use sea capaz de soportar las altas
temperaturas de >90 °C necesarias para la separación de las dos hebras de ADN de la doble hélice
tras cada ciclo de replicación. Las ADN polimerasas que se utilizaron originariamente para los
experimentos in vitro previos a la PCR no eran capaces de soportar estas altas temperaturas, por lo
que los primeros procedimientos para replicar el ADN eran muy ineficientes, largos y requerían
grandes cantidades de ADN polimerasa.
El descubrimiento en 1976 de la polimerasa Taq, una polimerasa de ADN extraída de la bacteria

termófila Thermus aquaticus que habita medios de muy alta temperatura (50-80 °C), eliminó los
grandes inconvenientes del método de la PCR. Esta ADN polimerasa es estable a altas temperaturas,
permaneciendo activa hasta después de la desnaturalización del ADN, eliminando la necesidad de
añadir a la reacción nueva polimerasa tras cada ciclo. Este descubrimiento permitió automatizar el
proceso, antes tan tedioso, acoplándolo al uso del termociclador.
Al mismo tiempo que desarrollaba la PCR en 1983, Mullis trabajaba en Emeryville, California (EE
UU), para una de las primeras empresas biotecnológicas, Cetus Corporation, donde era responsable
de sintetizar cadenas cortas de ADN. Mullis afirma que concibió la idea para la PCR una noche
mientras cruzaba la Autopista de la Costa Pacífica (EE UU) en su coche.10 Estaba imaginando una
nueva forma de analizar mutaciones en el ADN cuando se percató de que, en lugar de eso, había
inventado un método para amplificar regiones específicas de ADN mediente ciclos de duplicación
repetidos usando ADN polimerasas. Mullis atribuye la invención de esta técnica a los efectos de la
droga psicodélica y alucinógena LSD.12
En la revista Scientific American, Mullis resumió el procedimiento: "Comenzando con una única
molécula del material genético ADN, la PCR puede generar 100 billones de moléculas iguales en
una tarde. La reacción es fácil de hacer, no requiere más que un tubo de pruebas, unos pocos
reactivos simples y una fuente de calor."13 Fue premiado con el Premio Nobel de Química en 1993
por su invención, y siete años después, él y sus colegas del Cetus llevaron a la práctica su propuesta.
Sin embargo, han aparecido controversias y diferentes versiones sobre las contribuciones
intelectuales y prácticas de otros científicos al trabajo de Mullis, y sobre si él fue el inventor único
del principio de la PCR.
Guerras de patentes
La técnica de la PCR fue patentada por Cetus Corporation, donde Mullis trabajaba cuando inventó la
técnica en 1983. La enzima polimerasa Taq fue también cubierta de patentes. Tuvieron lugar varios
pleitos relacionados con la técnica, incluyendo un pleito fracasado generado por DuPont. La
compañía farmacéutica Hoffmann-La Roche adquirió los derechos de las patentes en 1992 y
actualmente mantiene las que aún están protegidas.14 15
Referencias
Citadas en el texto
1. ↑ Bartlett & Stirling (2003)—A Short History of the Polymerase Chain Reaction. In: Methods Mol Biol.
226:3-6 (http://biomed.humanapress.com/index.php?
option=com_opbookdetails&task=chapterdetails&chapter_code=1-59259-384-
4:3&category=biomedprotocols)
2. ↑ a b Joseph Sambrook and David W. Russel (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.
edición). Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-576-5.
3. ↑ Mathews, C. K.; Van Holde, K.E et Ahern, K.G (2003). «6». Bioquímica (3 edición). pp. 204 y ss. ISBN
84-7892-053-2.
4. ↑ a b Watson, J, D.; Baker, T. A.; Bell, S. P.; Gann, A.; Levine, M. et Losick, R (2004). Molecular
Biology of the Gene (Fifth edition edición). San Francisco: Benjamin Cummings. ISBN 0-321-22368-3.
5. ↑ Scott L. Butler, Mark S.T. Hansen & Frederic D. Bushman (2007). «A quantitative assay for HIV DNA
integration in vivo (http://www.nature.com/nm/journal/v7/n5/abs/nm0501_631.html) ». Nature Medicine
(7): pp. 631-634. doi:10.1038/87979. http://www.nature.com/nm/journal/v7/n5/abs/nm0501_631.html.
6. ↑ Museo Victora de Melbourne sobre la preservación del ADN
(http://museumvictoria.com.au/scidiscovery/dna/preserved.asp)
7. ↑ James P. Noonan,Graham Coop, Sridhar Kudaravalli, Doug Smith, Johannes Krause, Joe Alessi, Feng
Chen, Darren Platt, Svante Pääbo, Jonathan K. Pritchard, Edward M. Rubin (17 de noviembre de 2006).
«Sequencing and Analysis of Neanderthal Genomic DNA
(http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/314/5802/1113) ». Nature Medicine 314 (5802):
pp. 1113 - 1118. DOI: 10.1126/science.1131412.
http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/314/5802/1113.
8. ↑ Jinguo Hu1 and Carlos F. Quiros (1991). «Identification of broccoli and cauliflower cultivars with
RAPD markers (http://www.springerlink.com/content/t6082u1363g08567/fulltext.pdf) ». Plant Cell
Reports 10 (10). DOI: 10.1007/BF00234583.
http://www.springerlink.com/content/t6082u1363g08567/fulltext.pdf.
9. ↑ Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R, Molineux I, Khorana HG (1971). «Studies on polynucleotides. XCVI.
Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases
(http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WK7-4DKM9WR-
36&_user=103681&_coverDate=03%2F14%
2F1971&_rdoc=10&_fmt=summary&_orig=browse&_srch=doc-info(%23toc%236899%231971%
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Enlaces externos
■ Wikimedia Commons alberga contenido multimedia sobre Reacción en cadena de la
polimerasa.
■ Animación PCR (http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm)
■ Nueva técnica más eficiente en PCR (http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/33/13/e110)
■ Please find all details about real-time PCR here: http://www.gene-quantification.info - The
reference in real-time PCR
■ Simulation online de reacciones de PCR frente a procariotas secuenciados
(http://insilico.ehu.es/PCR) .
■ Ejercicio online en el que se diseñan y simulan experimentos de PCR y PCR-RFLP
(http://insilico.ehu.es/edu/PCR_es) .
Obtenido de "http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa"
Categorías: Genética | Técnicas analíticas en biología molecular
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Reacción en cadena de la polimerasa - Wikipedia, la enciclopedia libre Página 1 de 12

Reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como

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