LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS

DEPARTAMENTO DE PRODUCCIÓN E INDUSTRIA ANIMAL
CÁTEDRA DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA DE LA LECHE

MICROBIOLOGÍA DE LA L ECHE II

GUÍA P RÁCTICA

M ARACAIBO, OCTUBRE 2003

PARTE I. D ETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES EN LA LECHE Y SUS PRODUCTOS
ü PRUEBAS PRESUNTIVAS
- En medio liquido
o NMP EN CLBVB
- En medio sólido:
o Agar - Lactosa - desoxicolato
o Agar - bilis - rojo neutro - cristal violeta.
ü PRUEBAS CONFIRMATIVAS
- A partir de medios liquido:
o Repique en medios sólidos.
o Agar de Levine.
o Agar de Endo.
- A partir de medio sólido:
o Repique en medio liquido:
o CLBVB.
ü PRUEBAS COMPLETAS
- A partir de medio sólido:
o Repique en :
§ CLBVB
§ Agar nutritivo inclinado
§ Observación microscópica al Gram.
- A partir de medio liquido:
§ Repique en Agar de Levine.

PARTE II. PRUEBAS DE DIFERENCIACIÓN

ü PRUEBAS BIOQUÍMICAS DEL IMVIC:
- Indol (I)
- Rojo de metilo (M)
- Voges-Proskauer (V)
- Asimilación del citrato (C)
 PARTE I
DETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES EN LA LECHE Y SUS PRODUCTOS

INTRODUCCIÓN
Dentro del llamado "grupo coliforme" se incluyen todos los bacilos Gram negativos,
aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, capaces de fermentar la lactosa con
producción de gas y ácido en 48 horas, en medios de cultivo sólidos o líquidos. Los géneros
que integran este grupo son Escherichia, Enterobacter, Citrobacter y Klebsiella (Flia.
Enterobacteriaceae), siendo las especies mas importantes Escherichia coli y Enterobacter
aerogenes El primero en particular es huésped normal del tracto intestinal del hombre y los
animales de sangre caliente, por lo cual se encuentra en grandes cantidades en las heces y el
estiércol. El segundo (E. aerogenes) también se presenta en las heces, pero mas
frecuentemente se origina del suelo y materia vegetal en descomposición. La presencia en el
agua de estos microorganismos se considera inaceptable, asociándose con contaminación fecal
y por ende con la posible presencia de otros microorganismos patógenos de origen intestinal,
como por ejemplo las especies del género Salmonella productoras de la fiebre tifoidea y
disenterías bacilares.
La leche cruda se contamina corrientemente con bacterias coliformes, derivadas directa
o indirectamente del tracto intestinal de las vacas, animales que afortunadamente no sufren las
infecciones entéricas propias del hombre. Esta contaminación puede provenir del estiércol,
polvo, suelo, alimentos del ganado, agua, insectos (especialmente moscas) o del contacto con
residuos lácteos que quedan en los utensilios de ordeño y tanques de transporte o
almacenamiento, mal lavados y saneados; donde esas bacterias suelen desarrollarse con gran
facilidad. Por estas razones, es sumamente difícil producir leche cruda libre de coliformes,
dándole a su presencia una significación diferente que en el agua, y aunque es indeseable, se
tolera. No obstante, altas cuentas bacterianas de coliformes son indicativas de condiciones
insanas de producción, transporte o almacenamiento y producen defectos en la leche (sabores
desagradables), razones suficientes para evitar su desarrollo, mediante buenas prácticas de
producción.
En la leche pasteurizada, a diferencia de la leche cruda, la presencia de bacterias
coliformes es inaceptable ya que a las temperaturas de pasteurización se destruyen. Por lo
tanto, una prueba de coliformes positiva en productos lácteos pasteurizados denota mala
pasteurización y aunque este hecho generalmente se descubre por la prueba de fosfatasa, la
colimetria a veces resulta mas sensible. Además, un resultado coliforme positivo puede indicar
recontaminación post-pasteurización, bien sea por los equipos sucios o defectuosos (escapes
de leche cruda, escapes de vapor condensado, etc.) por los trabajadores (manos, ropa, etc.) o
por envases mal desinfectados. Ahora bien, como no hay forma de establecer si los coliformes
se originaron en la vaca o de un ser humano, cuyas heces si pueden ser portadoras de otros
microorganismos patógenos, la leche pasteurizada coliforme–positiva debe rechazarse.
De la anterior discusión se deduce, que la determinación de bacterias coliformes en la
leche y otros productos lácteos pasteurizados, es sumamente importante tanto en los
laboratorios de control de calidad de las industrias del ramo como la de las agencias
gubernamentales de sanidad. Ello puede efectuarse por diferentes métodos, siendo los mas
comunes las llamadas pruebas de fermentación, las cuales han sido clasificadas en presuntivas,
confirmativas y completas. Estas determinaciones pueden continuarse con pruebas de
diferenciación de especies de coliformes, siendo muy recomendables las pruebas bioquímicas
del IMViC y McKeenzie.

1.- PRUEBAS PRESUNTIVAS

Las pruebas de fermentación presuntivas, para establecer la presencia de coliformes en
la leche y derivados, pueden efectuarse siguiendo dos procedimientos:
a. Utilizando un medio liquido selectivo en tubos de fermentación (tipo Durham)
como el caldo lactosado-bilis-verde brillante (CLBVB) o el caldo lactosado-
peptona-ricinoleato- formiato. Estos medios se recomiendan cuando se desea
analizar volúmenes relativamente grandes de leche (5 a 100 mL). En el CLBVB, el
colorante (verde brillante) y la bilis actúan como inhibidores del crecimiento de las
bacteria Gram positivas, pero permiten el desarrollo de las Gram negativas; la
lactosa sirve como sustrato a las bacterias coliformes que la fermentan en 48 horas
a 32 o 35ºC, formando ácido y gas el cual es recolectado en los tubos de
fermentación, demostrando el crecimiento de las bacterias coliformes. Cuando se
emplean 5 tubos del medio liquido para cada una de 3 diluciones diferentes de
leche (10, 1 y 0,1 mL) es posible obtener valiosa información, que con la ayuda de
 tablas especiales permite hacer un calculo aproximado del numero de bacterias
posiblemente presentes en la muestra, resultado que se expresa en términos del
"Número Mas Probable" de coliformes por unidad de volumen (Ej.: NMP/100 mL).
En forma similar puede emplearse el caldo lactosado peptona-ricinoleato-formiato,
en el cual el ricinoleato sódico actúa como inhibidor de las bacterias Gram
positivas, pero no de las Gram negativas, en tal forma que los coliformes crecen
formando gas a partir de la lactosa, reacción que es acelerada por el formiato de
sodio.
b. Utilizando un medio selectivo sólido en placas como el agar- lactosa- desoxicolato-
formiato o agar bilis-rojo neutro-cristal violeta. Los medios sólidos se emplean
generalmente para el control sanitario de leches pasteurizadas, con el objeto de
establecer si cumplen las normas sanitarias (máximo conteo de bacterias/mL).
Tienen la ventaja de que permiten obtener resultados cuantitativos en una sola
placa. Sin embargo, no se emplean cuando se necesita utilizar volúmenes grandes
de muestra. Los coliformes crecen fácilmente en el agar lactosa-desoxicolato-
formiato, ayudados por la presencia de lactosa que fermentan produciendo ácido
que hace cambiar el pH y virar el indicador (rojo neutro) de amarillo a rojo; el
desoxicolato inhibe el crecimiento de los germenes Gram positivos. El periodo de
incubación de las placas con este medio, no deber ser mayor a las 24 horas,
preferiblemente 20 horas, ya que otros microorganismos pueden crecer
ocasionando confusión. Por ello solo se cuentan aquellas colonias rojas de diámetro
mayor a los 0,5 mm, rodeadas de un alo de desoxicolato de sodio precipitado.
Además, las placas se deben preparar con una capa fina superficial de medio,
superpuesta, para obtener las colonias de coliformes ligeramente por debajo de la
superficie y evitar sean confundidas con colonias superficiales. De manera similar
se usa el agar bilis-rojo neutro-cristal violeta, donde la bilis y el colorante inhiben
el desarrollo de los microorganismo s Gram positivos, mientras que el rojo neutro
actúa como indicador. Las bacterias coliformes crecen en este medio en 24 horas,
formando colonias de color rojo púrpura (por debajo de la capa superpuesta) de 1-
2 mm de diámetro, rodeadas de una zona rojiza de bilis precipitada.
 1.1.- PRUEBA PRESUNTIVA EN M EDIO LIQUIDO. D ETERMINACIÓN DEL "N ÚMERO
MAS PROBABLE" DE COLIFORMES .

Materiales, Equipos y Medios de Cultivo :

ü Tubos de fermentación de Durha n con 10 mL de CLBVB (simple) o 20 mL de
CLBVB (doble); Pipetas estériles de 10 mL (o de 11 marcadas a 10 y 11 mL);
Pipetas estériles de 1,1 mL; Blanco de dilución 99 mL; Estufa de incubación;
Equipo individual.
ü Caldo lactosado - bilis - verde brillante 2 %.

Simple Doble
( 10 mL/tubo) (20 mL/ tubo)
Peptona 10 g 15 g
Lactosa 10 g 15 g
Bilis de buey desecada 20 g 30 g
( o bilis de buey fresca ) (200 g) (300 g)

Verde brillante 0,1 % 13,3 mL 20mL

Agua destilada c.s.p. 1L 1L

pH 7,2 ± 0,1

Muestras:
ü Leche cruda y Leche pasteurizada

Procedimiento:
1. Siembra en tubos de fermentación empleando cualquiera de los dos medios
líquidos indicados, proceder de la siguiente manera:
a. Con pipetas estériles, inocular 3 tubos conteniendo 20 mL de caldo doble
estéril, con 10 mL de la muestra asignada homogénea.
b. Con pipeta estéril de 1,1 mL, inocular 3 tubos conteniendo 10 mL de caldo
simple, con porciones de 1 mL de la muestra homogénea. Simultáneamente,
 inocular otros 3 tubos de caldo simple (10 mL) con porciones de 0,1 mL de la
muestra.
c. Si se requiere hacer mayores diluciones, preparar una 1:100 transfiriendo 1 mL
de la muestra a un blanco de dilución e inoculando porciones de 1 y 0,1 mL en
dos series de 3 tubos de caldo simple, con lo cual se obtienen diluciones de
1:100 y 1:1000.
d. Incubar los tubos, debidamente rotulados, colocados en una gradilla
identificada con el número del equipo, en la incubadora a 32 o 35ºC, por 48
horas.
e. Pasado el tiempo de incubación, observar las tres series de 3 tubos, para
establecer la formación de gas, lo cual se interpreta como desarrollo positivo de
coliformes (presuntivo).

2. Calculo del Número Más Probable (NMP) de coliformes:

a. Determinar el número de tubos positivos (con gas) de cada serie de 3 tubos.
Registrar los resultados en la forma que se ejemplariza a continuación:
suponiendo que en los tubos de 10 mL de muestra resultaron 3 de 3 positivos,
en los de 1 mL: 1 de 3 y en los 0,1 mL: 0 de 3:

10 mL 1 mL 0,1 mL
3/3 1/3 0/3

b. Con ayuda de la tabla para coliformes se establece el NMP de coliformes por

100 mL.
c. De la misma forma debe procederse cuando se trabaja con series de 5 tubos,
pero utilizando en ese caso las tablas especificas para esa situación.
d. Utilizar los tubos de fermentación positivos para la prueba en medio sólido.

Observaciones: El método anterior se aplica en forma similar al agua y derivados

lácteos, haciéndose las diluciones necesarias. En general, cada producto lácteo se trata en
forma igual a la señalada para el recuento estándar en placas y luego se procede como en la
leche.

1.2.- PRUEBA PRESUNTIVA EN MEDIO SÓLIDO

Materiales y Equipos:
ü Pipetas estériles de 1,1 mL; Placas de Petri estériles; Blancos de dilución 99 mL;
Estufa de incubación; Equipo individual.
ü Agar bilis-rojo neutro-cristal violeta.

Muestras:
ü Las mismas empleadas en la parte anterior.

Procedimiento:
1. Con pipeta de 1,1 mL, transferir porciones de 1 y 0,1 mL de la muestra homogénea
a placas de Petri estériles, debidamente rotuladas (diluciones 1 y 10-1 ).
2. Cuando se requieren mayores diluciones (10-2 , 10-3 ) preparar una dilución 1:100
(10-2 ) transfiriendo 1 mL de la muestra a un blanco de dilución (99 mL). Mezclar
bien y sembrar volúmenes de 1 y 0,1 mL en placas rotuladas. En general el
procedimiento es similar al del recuento estándar en placa.
3. Verter 10-12 mL del medio sólido fundido (45 ± 1ºC) y mezclar.
4. Después que el medio se haya solidificado, agregar a cada placa un pequeño
volumen adicional (3-4 mL) del medio fundido para obtener una fina capa
superpuesta.
5. Incubar las placas a 32 o 35 ºC por 18 - 24 horas.
6. Terminado el periodo de incubación, contar las colonias rojas típicas que presenten
un diámetro de 0,5 mm o mayor; multiplicar el recuento por la dilución
correspondiente y expresar el resultado en términos de "ufc de coliformes por 100
mL".
7. Utilizar las placas con colonias típicas rojas para la prueba confirmativa en medio
líquido.
 2.- PRUEBAS CONFIRMATIVAS
Cuando se requiere confirmar la evidencia obtenida en una prueba presuntiva sobre la
posible presencia de bacterias coliformes, se acostumbra continuar el análisis con una prueba
confirmativa. Esta puede efectuarse por dos procedimientos:
a. Utilizando un medio selectivo sólido para “repicar” o "transplantar" los
microorganismos (presuntamente coliformes) cuando la prueba presuntiva previa se
ha hecho en medio liquido. Con tal fin se utiliza comúnmente el agar de Levine, en
el cual las bacterias coliformes se “confirman” por las características de sus
colonias. En este medio, las colonias de Escherichia coli se presentan planas o
ligeramente cóncavas, de color oscuro con el centro negro, brillo metálico verdoso
(a la luz refleja) con tendencias a unirse y con un tamaño de 2-3 mm. En cambio,
las colonias de Enterobacter aerogenes se observan mas levantadas, marcadamente
convexa s, de color menos oscuro que la especie anterior, con el centro marrón, sin
el brillo metálico que caracteriza a las de Escherichia, y con un tamaño mayor,
generalmente de 4-6 mm. El medio en si es de color púrpura. Para este fin también
puede emplearse el agar Endo. Ambos medios se incuban a 32 o 35 ºC por 18 - 24
horas, seleccionándose las colonias típicas para la prueba completa, cuando esta se
requiere.
b. Empleando un medio selectivo liquido para “repicar” los microorganismos
cultivados en la prueba presuntiva precedente en medio sólido. Con este fin se
emplean comúnmente el mismo caldo lactosado-bilis- verde brillante al 2%
(CLBVB). El desarrollo de gas en este medio, confirma la presencia de coliformes,
si ocurre en 48 horas a 32 o 35 ºC.

2.1.- PRUEBA CONFIRMATIVA EN M EDIO SÓLIDO (A PARTIR DE MEDIO LIQUIDO)

Materiales, Equipos y Medios de Cultivos:
ü Placas preparadas con agar Levine esterilizado; Estufa de incubación;
ü Equipo individual
ü Agar de Levine ( agar - eosina - azul de metileno ):
Muestras:
ü Tubos de fermentación positivos (con gas) obtenidos en la prueba presuntiva de
coliformes.

Procedimiento:
1. Sobre placas estériles con agar de Levine, sembrar por estría, líquido de tubos de
fermentación positivos obtenidos en la prueba presuntiva.
2. Incubar a 32 o 35ºC durante 18 - 24 horas.
3. Observar las colonias típicas.
4. Utilizar las placas que presentan colonias típicas para la prueba completa.

2.2.- Prueba Confirmativa en Medio Liquido (a partir de medio sólido)

Materiales, Equipos y Medios de Cultivo:
ü Tubos de fermentación de Durham con CLBVB simple estéril; Equipo individual.

Muestras:
ü Placas de medio sólido con colonias típicas, obtenidas en la prueba presuntiva en
medio sólido.

Procedimiento:
1. Seleccionar varias colonias típicas de la placa de medio sólido. Si el medio
empleado fue agar lactosado-rojo neutro-cristal violeta, escoger colonias típicas
que se hayan desarrollado por debajo de la superficie, de color rojo intenso.
2. Con la aguja de Kolle estéril, transferir material de las colonias seleccionadas a
tubos de fermentación con CLBVB.
3. Incubar a 32 o 35ºC por 48 horas. Si al cabo de ese periodo ningún tubo presenta
gas, la prueba confirmativa puede considerarse negativa. Si por el contrario hay
formación de gas, la prueba se toma como positiva.
4. Emplear los tubos positivos para la prueba completa.
 3.- PRUEBAS COMPLETAS
Cuando se quiere comprobar definitivamente la presencia de los coliformes
confirmados mediante las pruebas anteriores, el análisis puede continuarse con las llamadas
pruebas completas. Estas prueban son necesarias cuando aún existe cierta duda sobre la
identidad de las colonias aisladas, especialmente en placas con profusión de colonias; o
cuando además de lactosa, existe en el cultivo otra sustancia que pudiera fermentar, como
ocurre cuando se siembra helados en tubos de caldo lactosado. Los procedimientos que se
emplean pueden ser dos:
a. Si la prueba confirmativa se ha logrado en medio sólido y en este ultimo se han
aislado bien colonias típicas de coliformes, esto es, colonias planas o cóncavas,
rodeadas de un área con brillo metálico, se seleccionan y se “repican” en tubos de
fermentación con caldo lactosado (CLBVB) que se incuban a 32 o 35ºC durante 48
horas y en tubos de agar nutritivo inclinado que se incuban a 32 o 35ºC durante 24
horas. La prueba completa se considera positiva si se observa formación de gas en
los tubos de fermentación y si al microscopio del frotis de ambos cultivos,
demuestra el desarrollo de bacteria en forma de bastoncitos, Gram negativas, no
esporuladas.
b. Si la prueba confirmativa previa se ha hecho “repicando” de medio sólido a liquido
y se ha obtenido formación de gas (generalmente en 18-24 horas) la prueba
completa se obtiene "repicando" de nuevo en medio sólido (agar Levine) que se
incuba a 32 o 35ºC por 18-24 horas. Seguidamente se hacen "repiques" de colonias
típicas seleccionadas como se ha indicado en (a), es decir, haciendo cultivos
sucesivos en tubos de fermentación con caldo lactosado, en tubos de agar nutritivo
inclinado y examen microscópico de los cultivos teñidos al Gram.

3.1.- PRUEBA COMPLETA (A PARTIR DE MEDIO SÓLIDO )

Materiales, Equipos y Medios de Cultivos:
ü Tubos de fermentación de Durhan con CLBVB (simple) estériles; Tubos de agar
nutritivo inclinado estériles; Estufa de incubación; Equipo individual.
Muestras:
ü Placas de medio sólido con colonias típicas, obtenidas en la prueba confirmativa.

Procedimiento:
1. Seleccionar colonias típicas de coliformes de las placas de medio sólido obtenidas
en las pruebas confirmativas y “repicar” (a partir de cada placa) en un tubo de
fermentación con CLBVB y otro con agar nutritivo inclinado.
2. Incubar el primer tubo (CLBVB) a 35ºC por 48 horas y el segundo (agar nutritivo
inclinado) a la misma temperatura, por 24 horas.
3. Al observar indicios de crecimiento bacteriano hacer frotis, colorear con Gram y
observar al microscopio con objetivo de inmersión.
4. Interpretar las observaciones, así como todos los resultados obtenidos a través de
las diferentes pruebas de fermentación.

3.2.- PRUEBA COMPLETA (A PARTIR DE MEDIO LIQUIDO)

Materiales, Equipos y Medios de Cultivo:
ü Tubos de fermentación tipo Durham con CLBVB (simple) estériles; Tubo de agar
inclinado esterilizado; Placas de Petri preparadas con agar Levine ; Estufa de
incubación; Equipo individual.

Muestras:
ü Tubos de fermentación con CLBVB positivos, obtenidos en la prueba confirmativa
en medio liquido (con gas).

Procedimiento:
1. A partir de tubos de fermentación positivos, sembrar placas preparadas con agar
Levine. Hacer las siembras por estría, con capa superpuesta. Encubar a 35ºC por
18-24 horas.
2. En caso de obtener colonias típicas de coliformes, repetir la prueba completa a
partir de medio sólido. Interpretar todos los resultados obtenidos en las diferentes
pruebas de fermentación.
 PARTE II
PRUEBAS DE D IFERENCIACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES

Una vez confirmada la presencia de bacterias coliformes, mediante pruebas de

fermentación presuntivas, confirmativas y completas, utilizando medios selectivos líquidos y
sólidos; y aisladas las bacterias en cultivos puros, el análisis puede continuarse con pruebas de
diferenciación para establecer la identidad de la especie bacteriana. Entre esas pruebas, son
recomendables las del IMViC y de McKenzie, cuyo estudio constituye el objetivo principal de
esta práctica. Debe recordarse además que la identificación de las especies de coliformes
puede también efectuarse por las características de desarrollo en medios selectivos ya sea en
placas o en tubos de cultivo, siendo los mas comunes los medios de Levine, Endo, McConkey
(en placas) y el medio de Costa y Vernin (en tubos). En este trabajo nos avocaremos
exclusivamente a las pruebas bioquímicas del IMViC.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS IMVIC

Las principales especies y variedades de bacterias coliformes pueden diferenciarse
mediante cuatro pruebas bioquímicas comúnmente agrupadas bajo la denominación de
IMViC, las cuales son: Indol, rojo de metilo, Voges-Proskauer y asimilación del citrato. La
tabla I, presenta los resultados que dan las especies más importantes de bacterias coliformes
cuando se someten a estas pruebas, cuyos fundamentos específicos se explican a continuación.

§ Prueba del Indol: Esta prueba, ideada por Kovacs, consiste en sembrar el
organismo que se estudia en caldo triptona e incubar a 35°C por 24 horas. En este
medio ciertos microorganismos forman Indol por descomposición del aminoácido
triptofano (indol-alanina) presente en la triptona. Después del periodo de
incubación, la presencia del Indol se reconoce con el reactivo de Kovacs, integrado
por p-dimetil-amino-benzaldehido, alcohol amílico y HC l concentrado, con el cual
forma un estrato superficial de color rojo en el tubo de reacción. La cepa más
común de Escherichia coli (variedad I) da esta reacción positiva, mientras que la
cepa más común de Enterobacter aerogenes (variedad I) la da negativa.
§ Prueba del Rojo de Metilo y Voges-Proskauer: Estas pruebas pueden
desarrollarse simultáneamente utilizando el medio M.R.-V.P. (caldo glucosado-sal-
peptona) en el cual se siembra el organismo en estudio y se incuba a 35ºC. Después
de un periodo de incubación de 24-48 horas, parte del medio se utiliza para la
reacción de Voges-Proskauer, que consiste en establecer la formación de acetil-
metil-carbinol o acetoína, producida por ciertos microorganismos a partir de la
glucosa, con el reactivo de Barrit, constituido por alfa- naftol y KOH. Escherichia
coli da esta reacción negativa, mientras que Enterobacter aerogenes la da positiva.
El resto del medio M.R.-V.P. no utilizado en la reacción anterior, se continua
incubando hasta completar 5 días (a 35ºC) para ser luego sometido a la prueba del
rojo de metilo, la cual consiste en la adición de gotas del indicador para observar la
reacción del medio. Escherichia coli fermenta la glucosa produciendo una cantidad
de ácido tal, que lleva el pH del medio por debajo del punto de viraje del indicador
(amarillo a rojo, pH 5,1); por consiguiente, cuando el microorganismo en estudio
corresponde a esta especie, el medio toma un color rojo. Por el contrario,
Enterobacter aerogenes, aunque también fermenta la glucosa con formación de
ácido, solo baja el pH hasta un valor de aproximadamente 6,0 en 5 días, todavía por
encima de la zona de viraje del indicador y por ello al adicionarlo al cultivo de este
microorganismo, se obtiene un color amarillo que se interpreta como una reacción
negativa, un color intermedio entre el rojo y el amarillo se debe interpretar como
dudoso e indicativo de purificación incompleta del cultivo.

§ Prueba de Asimilación del citrato: Esta prueba se efectúa sembrando en agar-

citrato de Simmons a 35ºC por 72-96 horas. En medio contiene sales minerales y
citrato de sodio como única fuente de carbono y azul de bromotimol como
indicador. Por su mismo funcionamiento, este medio debe sembrarse con una
cantidad mínima, nunca con pipeta, para evitar la introducción de material nutritivo
en la transferencia, que afectaría los resultados por incorporación de otras fuentes
de carbono. Escherichia coli no crece en este medio, mientras que Enterobacter
aerogenes por tener la capacidad de utilizar el citrato de sodio como fuente de
carbono, se desarrolla, produciendo carbonato que alcaniliza el medio, haciéndolo
 virar del color verde al azul. Este viraje se interpreta como una reacción positiva, lo
mismo que la presencia de crecimiento microbiano.

Tabla I. Diferenciación de coliformes por el IMVIC

Microorganismo INDOL Rojo de Metilo Voges-Proskauer Citrato
Escherichia coli
Variedad I + + - -
Variedad II - + - -
Enterobacter aerogenes
Variedad I - - + +
Variedad II +/- - + +

Materiales, Equipos, Medios de Cultivos y Reactivos:

ü Tubos bacteriológicos estériles conteniendo los siguientes medios: Caldo triptona
(I); RM-VP (M-P) y Agar citrato de Simmons (c)
ü Estufa de incubación (35-+0,1ºc)
ü Reactivos de Kovacs (INDOL); Reactivo de Barrit (Voges-Proskauer); Solución
indicadora de rojo de metilo.
ü Caldo Triptona en tubos (10 mL c/u); Medio R.M.-V.P. en tubos (10 mL c/u); Agar
citrato de Simmons en tubos (10 mL c/u)

Muestras:
ü Tubos con crecimiento positivo en CLBVB o agar nutritivo inclinado, obtenido en
la prueba de fermentación completa
ü Placas de medios de cultivo selectivo sólidos con cultivos puros, aislados
anteriormente.

Procedimiento:
1. Prueba del Indol
a. Inocular tubos estériles, conteniendo caldo-triptona, con el cultivo puro
aislado en los medios selectivos, e incubar a 35ºC por 24 horas.
 b. Cumplido el tiempo de incubación, adicionar 0,2-0,3 mL (2 a 3 gotas) de
reactivo de Kovacs y agitar. Dejar en reposo por 10 minutos, observar e
interpretar los resultados.

2. Prueba de Voges-Proskauer:
a. Inocular tubos estériles, conteniendo medio R.M-V.P con el cultivo puro e
inocular a 35ºC.
b. Después de 48 horas de incubación, transferir asépticamente 1 mL del
cultivo a otro tubo y adicionar 0,6 mL o de la solución A ( Alfa- naftol) más
0,2 mL de la solución B (KOH) que integran el reactivo de Barrit.
c. Dejar en reposo por no más de 2-4 horas, observar e interpretar los
resultados.

3. Prueba del rojo de metilo:

a. Incubar el tubo con medio R.M-V.P. inoculado en la prueba anterior
(Voges-Proskauer) y mantenerlo a 35ºC hasta completar 5 días.
b. A 5 mL de cultivo, adicionar 5 gotas de la solución ind icadora de rojo de
metilo.
c. Observar e interpretar los resultados.
d. Las pruebas 2 y 3 pueden también efectuarse separadamente con diferentes
tubos.

4. Prueba de asimilación del citrato.

a. Incubar tubos estériles de agar citrato de Simmons con el cultivo puro. Esta
siembra debe hacerse haciendo un trazo con la aguja de Kolle poco cargada,
evitando transferir medio de cultivo.
b. Incubar a 35ºC durante 72-96 horas y luego observar si ha habido desarrollo
del cultivo o cambio del color verde al azul. Interpretar los resultados
obtenidos.
AUTOEVALUACIÓN
 1. ¿Cuales son los requisitos exigidos por la Comisión Venezolana de Normas
Industriales (COVENIN) para bacterias coliformes en la leche cruda y pasteurizada?
2. ¿Por qué existe un criterio diferente sobre el significado de los coliformes en la leche
cruda y en la pasteurizada?
3. ¿Qué importancia tiene el estudio de los microorganismos coliformes en leche cruda?
4. ¿Cuánto debe emplearse una prueba presuntiva en medio líquido y cuando en medio
sólido? Indique las ventajas y desve ntajas de cada una de estas técnicas.
5. ¿En la prueba del NMP, cuales son las características a observar que permiten presumir
el crecimiento de bacterias coliformes?

REFERENCIAS SELECCIONADAS

§ "Normas para el examen de productos lácteos". Organización panamericana de la

salud,1501 New Hampshire Av.,N. W., Washington 6, D.C., U.S.A. (1963).
§ "Laboratory manual. Methods of Analysis of Milk and its products" p113-115, 130-135.
Milk Industry Foundation, 1145 19 th St., N.W.,Washigton, U.S.A.(1964).
§ Foster E.M.,P.E. Nelson, M.L SEECK,R.N. DOETSCH and J. C OLSON. " Dairy
Microbiology", p.205-227. Pretice-Hall, inc, Englewood Cliffs,NewJersey, U.S.A.(1957).
§ Lampert L.M. "Modern Dairy Products", p.96-106 .Chemical Publishing Co., Inc. New
York, N.Y., U.S.A.(1965).
§ WITTER L.D Psycrophilic Bacteria-A Review. Jourmal of Dairy Science 44: 983-100
(1961).