“UNIDAD 3”

MI C R O S C O P Í A

ELABORADO POR:
M. EN C. LUZ EDUVIGES GARAY MARTÍNEZ
M. EN C. JULIA AURORA PEREZ MONTAÑO
 MICROSCOPIO
Instrumento óptico que consiste en una
combinación de
lentes para conseguir imágenes aumentadas o
agrandadas de objetos diminutos.
HISTORIA DEL MICROSCOPIO
El microscopio se invento, hacia 1610, por
Galileo, según los italianos, o por Jansen, en
opinión de los holandeses. La palabra
microscopio fue utilizada por primera vez por los
componentes de la "Accademia dei Lincei" una
sociedad científica a la que pertenecía Galileo y
que publicaron un trabajo sobre la observación
microscópica del aspecto de una abeja.

Sin embargo las primeras publicaciones

importantes en el campo de la microscopía
aparecen en 1660 y 1665 cuando Malpighi prueba
la teoría de Harvey sobre la circulación sanguínea
al observar al microscopio los capilares
sanguíneos y Hooke publica su obra Micrographia
HISTORIA DEL MICROSCOPIO
A mediados del siglo XVII un comerciante
holandés, Leenwenhoek, utilizando
microscopios simples de fabricación propia
describió por primera vez protozoos,
bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos.

Durante el siglo XVIII el microscopio sufrió diversos

adelantos mecánicos que aumentaron su estabilidad
y su facilidad de uso aunque no se desarrollaron
mejoras ópticas. Las mejoras mas importantes de la
óptica surgieron en 1877 cuando Abbe publica su
teoría del microscopio y por encargo de Carl Zeiss
mejora la microscopía de inmersión sustituyendo el
agua por aceite de cedro lo que permite obtener
aumentos de 2000A principios de los años 30 se
habia alcanzado el limite teórico para los
microscopios ópticos no consiguiendo estos,
aumentos superiores a 500X o 1000X sin embargo
existia un deseo científico de observar los detalles de
estructuras celulares ( núcleo, mitochondria... etc.).
HISTORIA DEL MICROSCOPIO

El microscopio electrónico de
transmisión (T.E.M.) fué el primer
tipo de microscopio electrónico
desarrollado este utiliza un haz de
electrones en lugar de luz para
enfocar la muestra consiguiendo
aumentos de 100.000 X. Fue
desarrollada por Max Knoll y Ernst
Ruska en Alemania en 1931.
Posteriormente, en 1942 se
desarrolla el microscopio electrónico
de barrido (SEM).
MICROSCOPIOS
MICROSCOPIOS

• LUZ (OPTICOS)
* Campo luminoso
* Campo oscuro
* Luz ultravioleta
* Fluorescencia
* Contraste de fases

• ELECTRÓNICOS
*Barrido
*Transmisión
COMPONENTES DEL MICROSCOPIO
COMPONENTES DEL MICROSCOPIO
 OCULARES
Están colocados en la parte superior del
tubo. Se denominan así, porque están
muy cercanos al ojo. Su función es la
de captar y ampliar la imagen formada
en en los objetivos. En los modernos
microscopios hay dos oculares
MONOCULAR (microscopios binoculares) que
están unidos mediante un mecanismo
que permite ajustar la distancia
interpupilar. En general los mas
utilizados son los de 10X ( producen un
aumento de 10 veces ).

BINOCULAR
Brazo

Es una columna
perpendicular al pie.
Puede ser arqueado o
vertical y une al pie con el
tubo
Objetivos
Están colocados en la parte
inferior del tubo insertados en una
pieza metálica, denominada
revolver, que permite cambiarlos
fácilmente. Generan una imagen
real, invertida y aumentada. Los
mas frecuentes son los de 4, 10,
40, y 100 aumentos. Este último
se llama de inmersión ya que para
su utilización se necesita utilizar
aceite de cedro sobre la
preparación. En la superficie de
cada objetivo se indican sus
características principales,
aumento, apertura numérica, y
llevan dibujado un anillo coloreado
que indica el número de aumentos
( rojo 4X, amarillo 10X, azul 40X y
blanco 100X )
Objetivos

• Amplificar la imagen
real del objeto que forma
el objetivo.

•Corregir algunos de los

defectos del objetivo.

•Reflejar retículas,
escalas u otros objetos
que se coloquen en el
ocular.
Objetivos
 Capacidad de amplificación:

Se calcula como el producto del poder de

amplificación del objetivo y el del ocular.

• OBJETIVO OCULAR AMPLIFICACION

10x 10 100
20x 10 200
40x 10 400
100x 10 1000
Refracción en
un microscopio
compuesto
usando aceite
de inmersión
PLATINA
Es una plataforma horizontal con un orificio
central, sobre el que se coloca la
preparación, que permite el paso de los
rayos procedentes de la fuente de
iluminación situada por debajo. Dos pinzas
sirven para retener el portaobjetos sobre la
platina y un sistema de cremallera guiado
por dos tornillos de desplazamiento
permite mover la preparación de delante
hacia atrás o de izquierda a derecha y
viceversa. En la parte posterior de uno de
los laterales se encuentra un nonius que
permite fijar las coordenadas de cualquier
campo óptico; de esta forma se puede
acudir a el cuando interesa.
CONDENSADOR

El condensador es un sistema de lentes

situadas bajo la platina su función es la de
concentrar la luz generada por la fuente de
iluminación hacia la preparación. En el
interior del condensador existe un
diafragma-iris cuya función es limitar el
haz de rayos que atraviesa el sistema de
lentes eliminando los rayos demasiado
desviados
FUENTE DE ILUMINACION

Se trata de una lámpara halógena

de intensidad graduable. Esta
situada en el pie del microscopio.
Se enciende y se apaga con un
interruptor y en su superficie
externa puede tener una especie
de anillo para colocar filtros que
facilitan la visualización.
 PIE
Sirve como base del microscopio y tiene un
peso suficiente para dar estabilidad al
aparato. En los microscopios antiguos tenía
forma de herradura o de trípode pero en la
actualidad suele ser una plataforma
rectangular. En él se integra la fuente
luminosa
 Macrométrico y
micrométrico

Son tornillos de enfoque, mueven la

platina hacia arriba y hacia abajo. El
macrométrico lo hace de forma rápida y
el micrométrico de forma lenta. Llevan
incorporado un mando de bloqueo que
fija la platina a una determinada altura.
Todos los
microorganismos, excepto
los virus, pueden ser
observados mediante
microscopios ópticos
 Escalas microscópicas
Qué vemos a simple vista
· De gran tamaño: kilómetros de montañas o de mar.
· De tamaño humano: una persona, un animal...
· De 1 centímetro: moscas, abejas...
· De 1 milímetro: garrapatas, pulgas y otros insectos.

Qué vemos al microscopio óptico

· Amebas y protozoos: Una décima de milímetro.
· Glóbulos rojos y otras células: Una centésima de milímetro.
· Bacterias: Milésimas de milímetro.

Qué vemos con el microscopio electrónico

· Cromosomas: décimas de micra o diezmilésimas de milímetro
· Virus: centésimas de micra
· Moléculas: milésimas de micra, o nanómetros

Qué vemos con los microscopios de efecto túnel y de fuerza atómica

· Átomos: un ángstrom.
Relación de tamaños de
varios especímenes
 Poder de resolución

Cercanía a la que pueden estar dos objetos sin que dejen

de percibirse como estructuras separadas.

Capacidad de distinguir dos puntos adyascentes como

distintos y separados.

Poder de resolución= longitud de onda de la luz (λ)

AN objetivo + AN condensador

PR, está en función de la longitud de onda de la luz y la AN

Factores que afectan el Poder de Resolución del
Objetivo

Naturaleza de la luz

Apertura Numérica

Indice de refracción del espacio situado ante

la cara frontal del lente

Anchura del haz luminoso

El Poder de Resolución es proporcional a la anchura del haz luminoso
 El valor de θ se
determina según
se indica en la
figura y se
necesita para
calcular la
apertura
numérica (AN)

Mayor AN mayor el PR
y mayor finura de los
detalles
Rayos luminosos del espectro de luz
RECORRIDO DE LUZ
A TRAVÉS DE UN
MICROSCOPIO
COMPUESTO
 BACTERIAS

ACTINOMYCES ( TINCIÓN GRAM ) PNEUMOCOCO ( TINCIÓN DE CÁPSULA )

 BACTERIAS

MYCOBACTERIUM
PNEUMOCOCO
(TINCIÓN Z-N)
(TINCIÓN GRAM )
 HONGOS MICROSCOPICOS

ASPERGILLUS SPP MICROSPORUM CANNIS

 HONGOS MICROSCOPICOS

HISTOPLASMA CAPSULATUM CANDIDA SPP.

Microscopio de campo claro: usa como fuente de luz
directa bien una bombilla bien la luz solar. Ya que los
microorganismos son transparentes es difícil
distinguirlos con este tipo de microscopía y es por lo
que se suelen teñir.

Microscopio de campo oscuro: usa un microscopio

óptico equipado con un condensador y objetivo especial
que iluminan los microorganismos en la muestra frente
a un fondo oscuro. Este método se utiliza para
visualizar microorganismos vivos sin
teñir.(Principalmente preparaciones húmedas o en gota
pendiente).
 MICROSCOPÍA DE LUZ ULTRAVIOLETA

Ø Permite un mayor poder de resolución con útiles y

mayores ampliaciones que las de un microscopio
simple.

Ø Su longitud de onda es más corta (180 a 400 nm)

Ø Su principal ventaja estriba en devolver la absorción

específica de varias sustancias visibles.

Ø La absorción UV característica de ciertas sustancias,

permite su localización, distinción y medición en
especímenes adecuados, incluso en estado vivo.
Microscopio de fluorescencia: la muestra
se tiñe con una sustancia fluorescente que
absorbe la energía de las ondas cortas de la
luz (azul) y emite la luz de longitudes de
ondas más largas (verde). Se utiliza en
inmunofluorescencia, técnica en la cual una
sustancia fluorescente se une a un
anticuerpo específico de ciertos
microorganismos. Si el anticuerpo
fluorescente se une al microorganismo, este
microorganismo emite fluorescencia y se
puede identificar. Esta técnica se usa en
clínica.
Principio de la
inmunofluorescencia

Los colorantes fluorescentes

se acoplan químicamente
con los anticuerpos
 Microfotografías de organismos en
microscopio de fluorescencia

Cianobacteria Excitada con luz 546 nm Leucothrix mucor teñida

El color rojo se debe a con colorante naranja
la autofluorescencia de de acridina (fluorece en
la clorofila y otros color verde)
pigmentos
Microscopio de contraste de fases: es un
microscopio óptico modificado que permite
contrastar sustancias de diferente grosor o
densidad. Mediante un condensador y un objetivo
especial se controla la iluminación de tal manera que
vaya en diferentes rutas a través de las distintas
partes de una célula. El resultado es una imagen con
diferentes grados de brillo y oscuridad. Con este
método, el material denso aparece brillante,
mientras que las partes de la célula que tienen una
densidad cercana al H2O (citoplasma) aparecen
oscuras. Se utiliza para visualizar estructuras
celulares sin necesidad de usar colorantes o matar
microorganismos.
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASES

• Sirve para controlar el contraste en la imagen

y hacer visibles microorganismos vivos sin
teñir, así como sus pormenores citológicos.

• Mejora la visibilidad de material teñido sin

gran contraste
Luz Campo oscuro Contraste de fases
Contraste de fases
 MANEJO DEL MICROSCOPIO
Conectar el aparato a la corriente eléctrica.
Colocar la preparación y asegurarla con los tornillos de la
platina
Rotar el revolver al objetivo de menor aumento y cerrar el
diafragma del condensador.
Acercar la platina al objetivo hasta que tope con ayuda del
tornillo macrométrico.
Adecuar los oculares a su distancia interpupilar.
Encender el foco
Enfocar utilizando el tornillo macro y micrométrico
Cambiar el objetivo a otro de mayor aumento (40x o 100x)
si es necesario enfocar con el tornillo micrométrico.
Si utiliza el objetivo de inmersión (100x) colocar una gota
de aceite inmersión sobre la preparación.
Una vez terminada la observación apagar el foco
Bajar la platina y retirar la preparación
Limpiar los objetivos
Desconectar el microscopio
Microscopio
electrónico
de eléctrico
MICROSCOPIO DE TRANSMISION ELECTRONICA
• Extraordinaria amplificación

• Poder de resolución 100 veces mayor que el

microscopio óptico por la corta longitud del haz
electrónico para ampliar el especímen.

• Ondas de electrones y campos magnéticos para

producir la imagen mientras que el microscopio de luz
hace uso de ondas luminosas y lentes de vidrio.

• Se distinguen objetos de 10 angstroms

• Ampliaciones de 200 000 a 400 000.

Tamaño relativo de
microbios,
moléculas y átomos
y los límites útiles
de microscopios
Comparación de sistemas de imagen
Técnicas en microscopía de transmisión
electrónica
• Sombreado (capa de metal en ángulo oblicuo sobre
el organismo)

• Cortes ultrafinos (ultramicrotomo)(Usa colorante

especiales como el uranio y lantano).

• Tinción negativa (Actúa como colorante el ác.

Fosfotúngstico que delimita el objeto)

• Criofractura (No utiliza tratamiento químico en el

proceso de fijación; la muestra se corta en bloque de
hielo.)
Técnicas en microscopía de transmisión
electrónica

• Localización de constituyentes celulares (los cortes

finos de una célula se tratan con anticuerpo marcado
con ferritina).

• Localización de enzimas en cortes finos (coloración

específica, se basa en la formación de sales de Pb
insolubles)

• Autorradiografía (es un método citoquímico en el que

se estudia la localización de los constituyentes
químicos delos tejidos registrando la posición del
material radioactivo incorporado a la muestra).
MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO
MICROSCOPIO ELECTRONICO DE EMISION DE
BARRIDO
 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO
• Menor resolución que el microscopio de transmisión.
• Da una imagen tridimensional.
• Pone de manifiesto la topografía superficial de la muestra
• El especímen se seca (cámara de vacío y de esta manera
la célula se muestra en un estado de metabolismo
activo). El proceso de desecación altera las
características morfológicas.
• Escaso poder de penetración del rayo de electrones.
• Se requiere experiencia para su manejo.
De transmisión Barrido