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VIII.

- Capítulo 13 biótico que permita evolucionar hacia una


agronomía menos reñida con la salud huma-
na y ambiental (principalmente sin bromuro
Aproximación biotecnológica
de metilo) y para que empresas viveristas lo-
integrada para un manejo sustentable cales puedan aprovechar las ventajas com-
del estrés biótico en frutilla parativas de exportación de plantines de
genética nacional en contraestación con los
Castagnaro, Atilio Pedro; países del hemisferio norte.
Salazar, Sergio Miguel; Zembo, Juan Carlos
Díaz Ricci, Juan Carlos Reconocimientos

Introducción En este capítulo se describen en forma


resumida los trabajos realizados y los logros
La frutilla cultivada (Fragaria x ananassa: obtenidos con este programa donde, ade-
2n=8x=56) es un poliploide con 56 más de los autores, participaron los siguien-
cromosomas resultante de la hibridación tes investigadores (en orden alfabético):
interespecífica entre dos especies de frutillas Marta Arias, Elsa Camadro, Nadia Chalfoun,
silvestres, también octoploides. Una de es- Paula Filippone, Gabriela García, Hugo Lázaro,
tas frutillas es originaria del sur (F. chiloensis: Cecilia Lemme, Alicia Inés Mamaní, Gustavo
2n=8x=56) y la otra del norte de América (F. Martínez Zamora, Luis Mroginski, Marta
virginiana: 2n=8x=56). La x en el nombre Ontivero, Graciela Terada, Ursula Tonello y
científico hace referencia a su condición de Gabriel Vellicce.
híbrido. Se trata de un importante fruto que
se consume en fresco o industrializado y que
1 Mejoramiento genético
es muy apreciado en prácticamente todo el
mundo. Su cultivo involucra dos actividades
El Pro\Frutilla se basa en un esquema de
agronómicas bien diferenciadas: la produc-
selección recurrente (Fig. 1) delimitado por
ción de frutas y la viverística, las cuales gene-
ran una gran demanda de mano de obra tres niveles de domesticación:
(alrededor de 500 jornales /Ha /año), por lo
cual en muchos países es considerado tam- 1) Poblaciones Comerciales, representa-
bién como un cultivo social. das en la Figura 1;
Si bien se realiza mejoramiento genético 2) Poblaciones Intermedias o Tampones,
en distintos lugares de Asia, Europa y Norte donde se intenta llevar a cabo hibridaciones
América, el mercado de variedades está do- interespecíficas;
minado por empresas estadounidenses. En 3) Poblaciones Silvestres, en las cuales se
Argentina, a partir de 1996 comenzó a fun- realizan cruzamientos dentro de cada espe-
cionar, en forma organizada, el Programa cie y/o nivel de ploidía.
Nacional de Mejoramiento Genético de la
Frutilla (Pro\Frutilla) a través de una iniciativa En una primera etapa, se realizaron reco-
interinstitucional (sectores público y privado) lecciones y se estableció un Banco de
e interdisciplinaria (combina el mejoramien- Germoplasma activo, constituido por
to genético convencional con los métodos genotipos de especies silvestres (Fragaria
surgidos de la biotecnología molecular), que vesca: 2n=2x=14; F. chiloensis: 2n=8x=56;
en 1999 representó a nuestro país en la ex- Duchesnea indica: serie poliploide 2n=8x y
posición «Flanders Technology International- 10x=56 y 70, respectivamente) y de la culti-
Technoland», en Gante, Bélgica. vada F. x ananassa. Estudiando caracteres
El objetivo general del Pro\Frutilla es ob- citogenéticos, morfológicos y anatómicos
tener cultivares argentinos adaptados a por pudo identificarse una nueva especie silves-
lo menos dos agroecosistemas o ambientes tre, Potentilla tucumanensis (2n=2x=14), que
de selección (el subtropical de Lules en es endémica del Noroeste Argentino y se
Tucumán y el templado del cinturón hortícola encuentra en peligro de extinción. Esta es-
del Gran La Plata, en Buenos Aires), con re- pecie fue clasificada de manera errónea a
sistencia incrementada a estrés de origen principios del siglo XX como Potentilla

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 367


norvegica, especie decaploide típica de los En la actualidad, se dispone de dos
países nórdicos. genotipos promisorios en etapas avanzadas
Paralelamente a la caracterización botá- de evaluación y selección clonal, llamados 96/

Figura1. Esquema de selección recurrente seguido en las poblaciones comerciales (mayor nivel de domesticación)

nica, en el marco de las mencionadas Pobla- 6-5 y 96/6-6, donde el número anterior a la
ciones Intermedias (2) y siguiendo un esque- barra, indica el año de cruzamiento (en este
ma dialélico incompleto, se realizaron 500 cru- caso 1996), el que le sigue indica la familia o
zamientos interespecíficos entre accesiones cruza, en este caso cv. Chandler x cv. Oso
silvestres de Fragaria vesca, Duchesnea in- Grande) y el último número es arbitrario y
dica, Potentilla tucumanensis y 9 genotipos responde a un ordenamiento interno del
de la cultivada F. x ananassa. Este estudio programa.
permitió detectar barreras pre y poscigóticas
de aislamiento reproductivo entre estas es- 2 Cultivo in vitro de meristemas,
pecies. A fin de conocer la naturaleza de las micropropagación y evaluación de la
barreras, se investigó el crecimiento del tubo variación somaclonal
polínico en el pistilo utilizando microscopia
de fluorescencia (Fig. 2) y se realizaron estu- Debido a que el cultivo de meristemas po-
dios histológicos de aquenios. Este conoci- sibilitaría sanear la mayor parte de las virosis,
miento permitirá diseñar estrategias que no se ha profundizado demasiado en el es-
posibiliten la transferencia de genes de inte- tudio y caracterización de los virus que afec-
rés agronómico desde los genotipos silves- tan a la frutilla y desde un punto de vista agro-
tres a los domesticados. nómico estas enfermedades no están den-
tro de los principales pro-
blemas del cultivo. Este
mismo razonamiento
podría aplicarse para la
enfermedad sistémica
(bacteriosis) provocada
por Xanthomonas
fragariae.
Figura 2. Compatibilidad del cruzamiento. Incompatible: Se estudiaron las condiciones de cultivo
el grano permanece sin germinar en el estigma (izda.). in vitro para sanear y multiplicar diferentes
Compatible: varios granos de polen crecen a través del genotipos de frutilla, entre ellos el cultivar
estilo (centro). Medianamente compatible: Sólo unos Camarosa, que es la variedad más cultivada
pocos granos de polen atraviesan el estilo (dcha.).
en el mundo. A su vez y mediante caracteri-

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zación fenotípica y marcadores genotípicos
del tipo RAPD (del inglés Randomly Amplified
Polymorphic DNA), se investigó la eventual
inducción de variación somaclonal en ciclos
sucesivos de multiplicación de este cultivar.
La tasa de multiplicación de las plantas in
vitro fue evaluada utilizando dos formu-
laciones salinas en el medio de cultivo (N30K
y MS) y diferentes concentraciones de Figura 3. La previa inoculación con un patógeno
cinetina (0,25, 0,5 y 0,75 mg/L). La mejor tasa avirulento desencadena una respuesta defensiva
de multiplicación se obtuvo en el medio N30K de protección cruzada contra el patógeno virulento
suplementado con 0,25 mg/L de cinetina, sin (izda.). Planta control infectada con un patógeno
que se detectara variación somaclonal des- virulento (dcha.).
pués de tres ciclos sucesivos multiplicación.
Este resultado nos permitió proponer por 2) Se caracterizaron los hongos
primera vez el uso de un procedimiento para patógenos del género Colletotrichum rela-
el saneamiento y la micropropagación comer-
cionados con la enfermedad de la
cial de la variedad Camarosa.
antracnosis. Esto permitió detectar una res-
puesta sistémica de protección cruzada des-
3 Interacción planta-patógeno
encadenada por un patógeno avirulento,
que además puede ser inducida por el mi-
A diferencia de otros productos agroa-
croorganismo (patógeno) inactivado y/o por
limentarios, las hortalizas se consumen
extractos del mismo, lo que puede tener tan-
mayoritariamente en fresco, lo que implica
to implicancias conceptuales como biotecno-
que no pueden llevar residuos de pesticidas.
lógicas (Fig. 3). Los estudios histopatológicos
Por otro lado, la práctica agronómica deberá
evolucionar, indefectiblemente, hacia nuevos Tabla1:
sistemas productivos que minimicen la utili-
zación de agroquímicos sintéticos. El proble- ESPECIE EC50 (uM)
ma principal del cultivo de la frutilla son
las enfermedades fúngicas. El manejo de Bacterias
estas enfermedades, donde una de las más Gram positivas
importantes es la antracnosis Clavibacter michiganensis 0.07
Staphylus aureus 0.14
(Colletotrichum sp.), involucra el uso masivo
Enterococcum faescium CRL 35 0.20
de pesticidas contaminantes como el Bacillus subtilis 0.25
bromuro de metilo, que además de ser tóxi- Listeria monocytogenes 0.28
co destruye la capa de ozono, y cuya elimina- Gram negativas
ción ya fue pautada desde Naciones Unidas. Xanthomonas fragariae 0.06
En este contexto el Pro\Frutilla está lle- Xanthomonas axonopodis pv citri 0.07
vando a cabo una investigación básica que Pseudomona auruginosa 0.12
permita desarrollar estrategias de biocontrol. Pseudomona siringae pv. gladiolii 0.27
Para ello: Erwinia carotovora 0.95
Salmonella newport 3.25
1) En primer lugar, se aislaron los agentes E.coli D21 4.00
etiológicos locales de las enfermedades más Hongos
importantes (especies pertenecientes a los Colletotrichum fragariae 8.92
géneros: Colletotrichum, Botrytis, Colletotricum acutatum 7.91
Colletotrichum gloeosporioides 9.37
Micophaerella, Xanthomonas, etc.) y se
optimizaron metodologías de infección con- EC50 = concentración efectiva para el 50 % de inhibición

trolada que posibilitaron la evaluación


en plantas que manifiestan la respuesta de
fenotípica certera de la resistencia/ suscepti-
defensa revelaron la presencia de cristales no
bilidad de los materiales fitotécnicos del Ban-
característicos de la especie F. x ananassa, un
co de Germoplasma del Pro\Frutilla.
incremento en la síntesis de almidón (activi-

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 369


dad metabólica), un mayor número de disponibles para la identificación inequívoca
cloroplastos y un engrosamiento de las pa- de las 8 principales variedades de frutilla cul-
redes celulares, lo que contribuye a aumen- tivadas en la Argentina. Utilizando esta
tar el espesor de la semilámina. aproximación pudieron diferenciarse tres ac-
Por otra parte, se purificaron y caracteri- cesiones distintas del cultivar Pájaro, que ha-
zaron compuestos antimicrobianos prefor- bían sido multiplicadas en forma indepen-
mados (fitoanticipinas, para diferenciarlos diente, confirmando la importancia del aná-
de las fitoalexinas, cuya formación en la lisis del ADN para evitar errores en la identifi-
planta es inducida por un microorganismo) cación de cultivares (Fig. 4a).
que fueron llamados Fragarinas. Uno de és- Sobre la base de la información obtenida
tos, llamado Fragarina 1, cuando es aplicado en los experimentos donde se evaluó la re-
en forma exógena, desencadena además sistencia/ susceptibilidad de los genotipos del
una respuesta defensiva en la planta. Esto Banco de Germoplasma frente a diversos
implicaría que más allá de su efecto como an- patógenos fúngicos, se diseñaron cruzamien-
tibiótico (Tabla 1), que permeabiliza la mem- tos para obtener poblaciones segregantes
brana plasmática, estaría de alguna manera que posibilitaran investigar el control genético
participando en la señalización de la respues- de la resistencia. Así, para la principal enfer-
ta de defensa. Actualmente, se analiza la po- medad del cultivo, la antracnosis, se propu-
tencialidad de extractos o compuestos de so un modelo basado en una interacción gen
este tipo como principios activos en la for- a gen en un fondo genético octoploide, que
mulación de agroquímicos naturales de bajo asume que la resistencia está determinada
impacto ambiental. por diferentes variantes alélicas de un gen R,
donde la susceptibilidad es parcialmente do-
4 Marcadores moleculares minante sobre la resistencia y la respuesta
defensiva sería modulada por la dosis alélica
Aprovechando la versatilidad de la técni- y por otros genes que interactuarían
ca de RAPD lo primero que se planteó fue epistáticamente con el gen R. Mediante BSA
investigar la similitud genética entre las es- (del inglés Bulked Segregant Analysis) se de-
pecies silvestres relacionadas con la frutilla tectaron marcadores AFLP (del inglés
cultivada y se desarrollaron los primeros mar- Amplification Fragment Length Polymor-
cadores moleculares específicos de especie, phisms) ligados a la resistencia que pueden
que permitieran la detección de híbridos contribuir a hacer más eficiente la selección
interespecíficos putativos. Del mismo modo, en el Pro\Frutilla (Fig. 4b).
pero usando electroforesis en geles de
poliacrilamida de alta resolución, se genera- 5 Transgénesis
ron 37 marcadores genotípicos actualmente
En virtud de las ventajas
que ofrece la transformación
genética mediada por
Agrobacterium tumefaciens,
preliminarmente se desarrolló
un protocolo de regeneración
de brotes a partir de discos de
hojas, con el que se conseguía
que el 70% de los explantos
cultivados regeneraran plantas
de frutilla. Este sistema de re-
generación fue utilizado para
Figura 4. Marcadores moleculares. A. Perfiles diferenciales de RAPD
optimizar una metodología de
indican diversidad genética entre distintas accesiones de un mismo transformación con la cepa de
cultivar de frutilla. B. Marcador AFLP asociado a la resistencia a C. Agrobac-terium tumefaciens
acutatum, presente en Progenitor (PR) e híbridos resistentes (HR) y LBA 4404, portadora del
ausente en progenitor (PS) e híbridos susceptibles (HS). plásmido binario pBI121,

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Figura 5. Transgénesis: A, Construcciones génicas portadoras de genes que
codifican proteínas antifúngicas (quitinasa, glucanasa y Ap24). B, Hojas
desprendidas de frutilla no transgénica (izda.) y transgénica resistente a Botrytis
(dcha.).

lográndose una eficiencia del 6,6 plantas guiendo al menos dos aproximaciones distin-
transgénicas por cada 100 discos de hojas tas:
infectados con la bacteria. i) Mediante la técnica de visualización de
Basados en este procedimiento, se obtu- la expresión diferencial de ARNms y la cons-
vieron 16 líneas transgénicas de frutilla cv trucción (y posterior análisis) de genotecas
Pájaro, que expresaban uno o una combina- de ADNc por hibridación sustractiva.
ción de dos de los siguientes genes ii) El clonado y caracterización de análo-
heterólogos (Fig. 5a) que codifican proteínas gos de genes de resistencia (RGA).
antifúngicas del grupo de las PR (proteínas En el primer caso (i), se clonaron numero-
relacionadas con la patogénesis vegetal): sos fragmentos de ADNc que codifican pro-
ch5B (codifica para una quitinasa de teínas relacionadas con la defensa vegetal
Phaseolus vulgaris), gln2 (codifica para una como quitinasas de tipo III o PR 8, proteínas
glucanasa de Nicotiana tabacum) y ap24 (co- quinasas con un dominio de unión a calcio,
difica para una proteína del tipo de las reguladores transcripcionales con dominios
taumatinas de Nicotiana tabacum). Sola- homeóticos, miembros de la familia de las
mente dos de estas líneas transgénicas, am- enoil-CoA-hidratasa /isomerasa, etc. De es-
bas portadoras de una copia simple del gen tos genes que están siendo analizados al
ch5B, mostraron resistencia incrementada a momento de escribir este capítulo, se desta-
la enfermedad del moho gris (causada por ca uno que presenta una alta homología con
Botrytis cinerea, de gran incidencia en una glutation S tranferasa (GST) de zapallo
agrosistemas subtropicales), aunque ningu- (Cucurbita maxima). Esta familia génica que
na de las 16 evidenció cambios en su com- actúa en la detoxificación de compuestos al-
portamiento frente a Colletotrichum tamente oxidantes (especies reactivas de oxí-
acutatum, una de las especies más agresivas geno) generados durante estrés tanto biótico
causante de la antracnosis. como abiótico, en Arabidopsis presenta
miembros que sólo se expresan en interac-
De este modo, queda demostrada la uti-
ciones planta /patógeno de tipo incompati-
lidad del gen ch5B para introducir resistencia
bles (cuando no se produce enfermedad).
a Botrytis en frutilla (Fig. 5b), un patógeno
Respecto de la segunda aproximación (ii),
para el cual todavía no se han encontrado
se utilizaron oligonucleótidos cebadores de-
fuentes de resistencia genética en la especie generados diseñados a partir de secuencias
F. x ananassa. conservadas de la región NBS (del inglés
«Nucleotide Binding Site») de genes de resis-
6 Caracterización molecular de genes de tencia (R) clonados de otras plantas, para
interés amplificar por PCR, análogos de genes de re-
sistencia en genotipos silvestres y cultivados
Actualmente se está aprovechando el de frutilla. Se identificaron al menos siete fa-
conocimiento que se tiene, tanto de los ma- milias distintas de RGAs, de las cuales la ma-
teriales fitotécnicos como de los sistemas de yoría pertenecía a genes R de tipo TIR (del
compatibilidad, incompatibilidad y de protec- inglés «Toll Interleukin Receptor»), similares
ción cruzada caracterizados, para aislar genes a los ya caracterizados en Arabidopsis, taba-
implicados en los mecanismos defensivos, si- co y lino.

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 371


7 Conclusiones LIANG P and PARDEE AB. (1992). Differential display of
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