INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

Proceso por el cual se restringe el movimiento de los enzimas, dando

lugar a una forma de los mismos insoluble en agua.
Dichos enzimas deben mantener su actividad catalítica.

En estos sistemas, los mecanismos difusionales cobran gran importancia

(transporte de reactivo-substrato y productos).

Ventajas Inconvenientes

Permite uso en continuo del enzima. El proceso de inmovilización puede afectar a

la actividad del enzima.

Simplifica las etapas de purificación del

producto.

Permite reutilización del enzima en reactores Procesos limitados por factores difusionales.
discontinuos.

Mayor concentración del enzima. Aumento de la complejidad del sistema.

Mayor rendimiento.

Mayores caudales de entrada/salida para el

mismo tamaño de reactor.

Mayor estabilidad del enzima.

Resistencia a la desnaturalización.

Reduce el riesgo de contaminaciones

accidentales del proceso.

Adecuado para conversiones sencillas, una Conversiones de varias etapas: preferible el

sola etapa. uso de células enteras.

Menores costes de operación.

Mayor control sobre la reacción. Permite

mayor automatización del proceso.
 The
AGENTE
ENZIMAS PORTADOR

properties of immobilized
enzymes
Propiedades Característica
bioquímicas s químicas

Cinética y Propiedades
mecanismo mecánicas

Método de Transferencia Estabilidad

inmovilización de materia

“Performance”
 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

• ADSORCIÓN

• ENLACE COVALENTE

• ENLACES CRUZADOS

• ATRAPAMIENTO

• MEMBRANAS
 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

ADSORCIÓN

• Para enzimas y células enteras.

• El más antiguo y sencillo (adsorción de β-D-fructofuranosidasa en Al(OH)3, Nelson

y Griffin, 1916)

• Etapas:

o Contacto: solución acuosa de enzimas-adsorbente

o tads
o lavado

• Interacciones:

o Tipo iónico
o Puentes hidrógeno
o Van der Waals

• Proceso muy suave:

o La actividad del enzima se conserva
o Proceso reversible en función de las condiciones (Tª, pH…)
o Estricto control de las condiciones de adsorción.

• Técnicas de inmovilización por adsorción:

o Adsorción estática
o Electrodeposición
o Proceso en reactor
o Baño con agitación

• Gran variedad de soportes para la adsorción (orgánicos/inorgánicos).

 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

ENLACE COVALENTE

• Adecuado para enzimas.

• Formación de enlaces covalentes entre enzima y soporte. Mucho más

fuertes que el caso anterior.

• Variedad de soportes:
o Naturales: celulosa, dextrano…
o Sintéticos: polímeros (poliacrilamida, poliestireno…)
o Vidrio, materiales cerámicos

• La unión covalente debe afectar a grupos funcionales del enzima que no

intervengan en el proceso catalítico.

• Etapas previas:
o Activación del soporte (creación de grupos funcionales adecuados
para su unión con los del enzima): activación por bromuro de
cianógeno, carbodiimida, complejos de diazonio…
o Vidrio y cerámica (inorgánicos): recubrimiento superficial con
grupos funcionales orgánicos adecuados.

• Puede haber pérdida de actividad debida a:

o Participación del centro activo del enzima en el enlace covalente
o Impedimentos estéricos
 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

ENLACES CRUZADOS

• Formación de agregados tridimensionales entrecruzados, insolubles en

disolución acuosa. Se prescinde del soporte.

• Enlace (bi-multi)covalente entre enzimas y reactivos bi-multifuncionales

(comerciales y baratos).

• Fácil preparación

• Alta especificidad (condiciones óptimas varían según cada caso),

ensayos prueba-error en laboratorio.

INCLUSIÓN O ATRAPAMIENTO

• Mayoritariamente para células. Poco usado para enzimas (baja

retención).
• Inclusión del enzima en una matriz tridimensional, quedando atrapado.
• La matriz se forma en presencia del enzima.
• Se debe permitir la difusión de substrato/productos.
• Uso de polímeros sintéticos o geles de origen natural.
 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

MEMBRANAS

• Retención del encima en un espacio limitado por una membrana

semipermeable.

o Microencapsulación
o Membranas preformadas

a) Microencapsulación

• Partículas esféricas de pequeño tamaño.

• El enzima queda incluido en suspensión dentro de las esferas.

• Ventaja: se consigue una suspensión en medio líquido (buena difusión)

• Procedimiento:
o Formación de emulsión en disolución acuosa (líquido
orgánico[monómero] + enzima)
o Polimerización de la emulsión

• Puede hacerse también para fibras poliméricas.

b) Membranas preformadas

• Membrana impermeable a las enzimas y permeable a

substrato/producto.
• Fibras huecas: Reactor cilíndrico con enzimas retenidos en membranas.
 VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS MÉTODOS DE
INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS
MÉTODO VENTAJAS
Los centros activos permanecen
inalterados.
ADSORCIÓN
No se requieren reactivos y las
etapas de activación son
sencillas
Método sencillo y económico.
Estabilidad del enzima. No se
desliga.
Método muy flexible, según se
ENLACE COVALENTE elija el agente portador y método
de enlace.
Enzima muy estable,
fuertemente enlazado.
Puede usarse en combinación
ENTRECRUZAMIENTO con la adsorción para prevenir
pérdida de catalizador.
Simplicidad.
Posibilidad de uso simultáneo de
varios enzimas.
Uso de membranas selectivas:
control de sustratos/productos
MEMBRANAS en mezclas.
Protección del enzima ante
inhibición, envenenamiento…
No hay pérdidas.
Adecuado para sustratos de alto
peso molecular, buen contacto
enzima-sustrato: altas
conversiones.
INCONVENIENTES
Posible desorción de enzimas
por cambios en pH,
temperatura…
Métodos no específicos para
cada reacción/enzima
Método caro y complicado.
La actividad puede reducirse si
los reactivos usados son tóxicos
para el enzima.
Los centros activos pueden
modificarse/dañarse durante el
proceso.
Puede dañar los centros activos.
Puede haber problemas
difusionales que limiten el
rendimiento.
Pérdida de enzima durante
preparación.
Problemas difusionales debidos a
la membrana.
Posible inactivación de enzimas,
sometidos a fuerzas de cizalla
elevadas.
Mal funcionamiento a bajas
concentraciones de sustrato
(adsorción de éste en la
membrana)
Estricto control del tiempo de
residencia para sustratos de bajo
peso molecular.
 ELECCIÓN DEL MÉTODO DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS
CARACTERÍSTICAS ADSORCIÓN ENL. ENTRECRUZA- MEMBRANAS
COVALENTE MIENTO
PREPARACIÓN Simple Difícil Intermedia Difícil

FUERZA DE UNIÓN Débil Fuerte Fuerte Intermedia

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Intermedia Alta Baja Baja

REGENERACIÓN DEL Posible Rara Imposible Imposible

SOPORTE
COSTE Baja Alta Intermedia Intermedia

ESTABILIDAD Baja Alta Alta Alta

APLICABILIDAD Si No No Si

PROTECCIÓN FRENTE A No No Posible Si

ATAQUE MICROBIANO