Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. Antibiograma.

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Laboratorio de Diagnóstico Clínico. 2º curso U.T. 17 - 1 Bloque temático III

Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana

¿Qué es un antibiograma?
El antibiograma es el estudio "in vitro" de la sensibilidad de las bacterias a los agentes
antimicrobianos, para su posterior utilización clínica.

¿Cuando debe realizarse un antibiograma?:

Cuando de una muestra biológica relacionada con un proceso infeccioso se aísle perfectamente un
microorganismo considerado responsable de dicho proceso.
No obstante existen microorganismos que muestran un patrón de susceptibilidad muy constante, por
lo que en ellos no sería necesario el ensayo de un amplio grupo de antimicrobianos.

¿Qué es necesario conocer antes de realizar el antibiograma?:

1. Identificación correcta de la bacteria o, al menos, sus características morfológicas y tintoriales con la
tinción de Gram.
2. Procedencia de la muestra.
3. Edad y sexo del paciente.

¿En qué se basa la realización del antibiograma?:

En la disminución o inhibición del crecimiento de un microorganismo en un medio de cultivo en
presencia de cantidades conocidas de antimicrobianos.
Se efectúa enfrentando una suspensión bacteriana estandarizada con diferentes concentraciones del
antibiótico, comprobando donde tiene lugar la inhibición del crecimiento bacteriano.

Métodos empleados:
1.Técnica de dilución en caldo
Es el procedimiento más exacto. Permite determinar C.M.I. y C.M.B.
Es muy engorroso para hacer rutinariamente
2.Técnica de dilución en placa
Es más cómodo que el anterior si el nº de muestras es > 30 / día
No permite detectar la C.M.B.
3.Técnica de difusión disco placa (Técnica de Kirby & Bauer )
Es el procedimiento más sencillo y generalizado. Es cómodo, barato, rápido y reproductible.
Proporciona indirectamente las C.M.I. a través de una correlación con los halos de inhibición
producidos. Es el método recomendado por el N.C.C.L.S. (National Commitee for Clinical
Laboratory Standarisation)

Farmacocinética de los antimicrobianos:

- Concentración mínima activa (C.M.A.).- Es la mínima concentración que se puede obtener en el suero de
un individuo con un tratamiento en dosis habituales.
- Concentración máxima tolerable (C.M.T.).- Es la mayor concentración que es posible alcanzar en el
suero de un individuo tratado sin que aparezcan efectos indeseables o tóxicos.
- Concentración eficaz (C.E.).- Es la concentración media de antibiótico obtenida en el suero en el curso
de un tratamiento mediante las dosis habituales. Está comprendida entre la C.M.A. y la C.M.T.
- Concentración mínima inhibitoria (C.M.I.).- Es la menor concentración de antibiótico capaz de inhibir in
vitro el crecimiento visible de un microorganismo.
- Concentración mínima bactericida (C.M.B.).- Es la menor concentración de antibiótico capaz de lisar el
99,9% de un inóculo bacteriano.
Para que un antimicrobiano sea eficaz frente a un microorganismo, su C.M.I. debe ser entre 2 y 4
veces menor que la C.M.A.

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Interpretación de resultados:
* Microorganismo sensible:
Es inhibido por una concentración de antibiótico menor o igual que la C.M.A.
* Microorganismo resistente:
Es capaz de crecer a concentraciones superiores a la C.M.T.
* Microorganismo moderadamente sensible o de sensibilidad intermedia:
No es inhibido por la C.M.A. pero sí por la C.M.T.

Metodología de la técnica de Kirby & Bauer:

* Medio de cultivo estandarizado.- Mueller Hinton

Niveles adecuados de calcio y magnesio. Bajos niveles de timina y timidina
Streptococcus.- Mueller Hinton + 5% Sangre de Carnero
Haemophilus.- Mueller Hinton + 1% de hemoglobina + Factores X y V
Neisseria.- Mueller Hinton chocolate enriquecido
Espesor del agar: 4 mm
pH del medio: 7,2 - 7,4

* Discos de antimicrobianos.-
Protegidos de luz calor y humedad
Tener una hora a temperatura ambiente antes de su utilización.
Los beta lactámicos deben congelarse hasta su utilización

* Inóculo.-
Debe realizarse en caldo Mueller Hinton a partir de colonias bien aisladas obteniendo una opacidad
visible después de 2 a 5 horas de incubación.
Debe ajustarse a 1,5·108 UFC/ml , equivalente al standard 0,5 de turbidez de la escala de
MacFarland.
La estandarización del inóculo es necesaria para asegurar un crecimiento denso pero no totalmente
confluente.

* Colocación de los discos.-

Llevar la placa a temperatura de incubación antes de sembrar el inóculo.
Una vez sembrado, dejar secar la placa antes de colocar los discos.
Colocar los discos de manera que los halos de inhibición no se superpongan.
Después de colocar los discos dejar 15' a temperatura ambiente antes de incubar.

* Técnica de siembra.-
Por inoculación con torunda en tres direcciones

* Incubación.-
Las placas se incuban en posición invertida
18 horas a 35ºC en atmósfera aerobia
¡No incubar en atmósfera de CO2!

* Inclusión de control de calidad.-

Deben emplearse las siguientes cepas test:
S. aureus (ATCC 25923)
E. coli (ATCC 25922)
P. aeruginosa (ATCC 25853)
E. faecalis (ATCC 33186)
H. influenzae (ATCC 10211) para Muller Hinton chocolate
S. pneumoniae (ATCC 06305) para Muller Hinton con 5% Sangre de Carnero

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Tabla general de utilización de antimicrobianos en pruebas de susceptibilidad.

Antibióticos comunes Gram positivos Gram negativos

Ampicilina Clindamicina Cefotaxima
Cefazolina Eritromicina Ceftazidima
Fosfomicina Oxacilina Ciprofloxacino
Gentamicina Penicilina G
TMT/SMX Rifampicina
Vancomicina
Antisépticos urinarios No fermentadores
Nitrofurantoína Aztreonam
Acido pipemídico Imipenem
Norfloxacina Tobramicina
Trimetoprim Amikacina
Piperacilina
Ticarcilina
Si ß lactamasa es (+) ensayar Amoxicilina + Ac. clavulánico

Casos especiales:

Algunos Gram positivos, habitualmente sensibles a penicilina, solo se enfrentarán a los siguientes
antimicrobianos:

Streptococcus pneumoniae: Penicilina

Eritromicina
Cefotaxima
Streptococcus viridans: Penicilina
Eritromicina
Gentamicina
Sreptococcus grupos A y B: Penicilina
Eritromicina

En Salmonellas se ensayará también: Cloranfenicol

En el caso de Neisserias:

Neisseria meningítidis: Penicilina

Cefotaxima
Rifampicina

Neisseria gonorrhoeae: Indicar solo ß lactamasa

Para las especies de Haemophilus: Ampicilina

Amoxi/clavulánico
Cefotaxima (si Ampi R)
Rifampicina
TMT/SMX

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Tratamiento de elección de los microorganismos gram positivos más frecuentemente aislados:

Microorganismo 1ª elección (si es sensible) Alternativa Resistenciaabitual

Vancomicina (si Meti-R)
Cotrimoxazol (si Meti-R)
Cefa 1ªy 2ª (no, si meti-R) ß-lactámicos si
Penicilina G
Staphylococcus aureus Cloxacilina
Amoxi-clavulánico produce ß
Clindamicina lactamasas
Ciprofloxacino
Aminoglucósido (no único)
Cefa 1ª y 2ª ( si Meti-R)
Amoxi-clavulánico
Staphylococcus Imipenem
Vancomicina
Clindamicina
coagulasa negativos Cloxacilina (si Meti-S)
Ciprofloxacino
Aminoglucósido (no único)
Rifampicina (no único)
Cefalosporina de 1ª gen
Staphylococcus Amoxicilina
Cotrimoxazol
saprophyticus Ciprofloxacino (IU solo)
Aminoglucósido
Macrólido
Streptococcus Cefa 1ª o 2ª
Penicilina G
pyogenes Clindamicina
Vancomicina

Streptococcus Vancomicina
Penicilina G
Cefalosporina de 1ª o 2ª gen
agalactiae Ampicilina
Macrólido
Streptococcus viridans Macrólido
Cefalosporina 1ª o 2ª gen.
y Penicilina G
Clindamicina
Streptococcus spp Vancomicina
Vancomicina
Streptococcus Imipenem
Penicilina G
Macrólido
pneumoniae Cefa 3ª (si meningitis)
Clindamicina
Rifampicina (no único)
Imipenem Resistencia a
Enterococcus faecalis Vancomicina Cefalosporinas
Amoxicilina
Amoxicilina-clavulánico Tolerante a
Penicilinas
Lactobacillus sp. Penicilina G Tetraciclina
Corynebacterium D2 Vancomicina Doxiciclina
Eritromicina
Bacillus anthracis Penicilina G Doxiciclina
Cloranfenicol
Imipenem
Ciprofloxacino
Vancomicina con o sin
Bacillus spp Aminoglucósido
Tetraciclina
Clindamicina
Macrólido

Ningún antibiótico es bactericida frente a Enterococcus faecalis

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Tratamiento de elección de los microorganismos gram negativos más frecuentemente aislados:

Microorganismo 1ª elección (si es sensible) Alternativa Resistencia

Citrobacter spp.
Enterobacter spp. Producen ß
Cefa 3ª
Imipenem lactamasas
Morganella morganii Aztreonam
cromosómicas
Ciprofloxacino Aminoglucósido
Providencia spp. inducibles
Serratia spp.
Cefa 2ª - 3ª
Aztreonam
Amoxi-clavul. Producen ß
Proteus spp. Aminoglucósido
lactamasas
Quinolona 2ª Imipenem
Cotrimoxazol
Quinolona 2ª Amoxi-clavulánico
Producen ß
Escherichia coli Cefa 2ª o 3ª Cotrimoxazol
lactamasas
Aztreonam Aminoglucósido
Ciprofloxacino
Producen ß
Klebsiella spp. Cefa 3ª Imipenem
lactamasas
Aztre onam Amoxi-clavulánico
plasmídicas
Aminoglucósido
Amoxicilina / clavulánico
Ampicilina /sulbactam
Quinolona 2ª
Salmonella spp Aztreonam
Cefa 3ª Cotrimoxazol
Cloranfenicol
Quinolona 2ª
Aminoglucósido
Campylobacter spp. Macrólido Imipenem
Amoxi-clavulánico
Ampicilina
Gardnerella vaginalis Metronidazol Vancomicina
Clindamicina
Cotrimoxazol
Haemophilus Amoxi- Clavul Quinolona 2ª
influenzae Cefa 2ª 3ª Aztreonam
Imipenem
Haemophilus spp. Ampicilina Cefa 3ª
Ceftazidima Penicilinas
Pseudomonas Imipenem Rifampicina + penicilina Cefalosporinas 1ª
Aztreonam antipseudomónica +
aeruginosa Ticarcilina aminoglucósido (Tobra)
Ciprofloxacino
Aminoglucósido Aztreonam
Piperacilina
Pseudomonas spp. Ceftazidima Ciprofloxacino
Cotrimoxazol
Imipenem
Espectinomicina
Neisseria gonorrhoeae Ceftriaxona Ciprofloxacino
Cefa 3ª
Neisseria meningitidis Penicilina G Cloranfenicol

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Antibióticos utilizados según N.C.C.L.S. y M.E.N.S.U.R.A. 2000

Pseudomonas y
Staphylococcus Enterococcus Enterobacterias
BGNNF
Eritromicina Ampicilina Ampicilina
Gentamicina Ampicilina Amoxi-clavulánico Ceftazidima
Oxacilina Gentamicina Cefazolina Ciprofloxacino
Estudio rutinario Penicilina Teicoplanina Cefotaxima Imipenem
SXT Vancomicina Ceftazidima SXT
Vancomicina Ciprofloxacino Ticarcilina
Fosfomicina
Estudio rutinario Norfloxacino Nitrofurantoina
SXT
en orinas Nitrofurantoina Ticarcilina
Nitrofurantoina
Cefepima
Amoxi-clavulánico
Cefoxitina
Cefazolina
Informe selectivo si Ciprofloxacino Cefuroxima Amoxi-clavulánico
Amoxi-clavulánico
Fosfomicina Cefepima
los rutinarios son Clindamicina Imipenem
Imipenem Colistina
resistentes Fosfomicina Levofloxacino
Ac. Nalidíxico Fosfomicina
Rifampicina
SXT
Teicoplanina
Ticarcilina

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