AGRADECIMIENTOS

En primer lugar quiero dar las gracias al Dr. Ramón Oliver y Dr. Santiago
Hernández por darme la oportunidad de participar en este proyecto realizado en
el Departamento de Quimiometría de la Universidad de Barcelona.

En segundo lugar, dar las gracias a la dirección de la parte experimental de este

proyecto, al Dr. Xavier Saurina, sus consejos han hecho posible el desarrollo de
este.

También agradecer a los compañeros del laboratorio de quimiometría, en

especial a Anna y Toni, que me han ayudado a resolver los problemas y dudas
que han ido surgiendo durante estos 4 meses.

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 CAPÍTULO 1:
INTRODUCCIÓN

1.1. El vino y sus propiedades

El vino es una bebida alcohólica que se obtiene a partir de la fermentación
alcohólica del zumo de uvas y por extensión la obtenida a partir de otros frutos o
materiales vegetales. Su elaboración consta de 3 fases principales: obtención del
mosto, su fermentación y por último su conservación y envejecimiento.
El vino forma parte de nuestra cultura des de hace aproximadamente 6.000
años. A lo largo de estos años la consideración social del vino ha ido cambiando.
Hace poco tiempo que el estudio del vino estaba enfocado en los efectos
adversos que producen sus componentes, ya que contiene especies químicas
causantes de las alteraciones relacionadas con la seguridad alimentaria. En
cambio, desde hace una década, el interés científico se ha centrado en los
efectos beneficiosos que comporta el consumo moderado del vino para la salud.
Los polifenoles no tienen una función conocida en la nutrición (o sea no son
nutrientes) y en los estudios se ha demostrado las propiedades biológicas como
antioxidantes, antisépticos, antimutagénicas, anticarcinogénicas y
antinflamatorias entre otros, que son beneficiosas en la prevención de
enfermedades y en la protección del genoma, particularmente para las células
epiteliales intestinales, unos de los tejidos más proliferativos del cuerpo humano.
Los componentes más importantes del vino son el agua (componente
mayoritario), el alcohol etílico (entre 7 y 17 grados alcohólicos), pequeñas
cantidades de otros alcoholes, ácido málico, tartárico, cítrico, acético y carbónico,
polifenoles (tañimos, antocianos), sustancias nitrogenadas (aminoácidos,
aminas), hidratos de carbono, especies inorgánicas (potasio y fosfatos) y
sustancias volátiles (aldehídos, cetonas, ésteres). La composición cualitativa y la
cuantitativa depende de la clase del vino.
La calidad de los vinos se encuentra condicionada por la materia prima, los
microorganismos que intervienen en la vinificación y por las condiciones
tecnológicas de la elaboración.

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Arantza León Sanz

Una Denominación de Origen es una indicación geográfica que garantiza el

origen y la calidad de un vino. Indica que el vino se ha obtenido en zonas
delimitadas y que ha estado elaborado según el reglamento preciso (variedades
de cepas, rendimiento límite por hectárea, grado alcohólico, prácticas vinícolas y
envejecimiento, calidades organolépticas, etc.)

1.1.1. Vinificación
Las diversas etapas del proceso de elaboración del vino nombrado vinificación
son las siguientes:

• Vendimia: es la cosecha de la uva cuando ha alcanzado el grado de

maduración deseado, la composición de la cual depende de la variedad,
el clima, el suelo y del agua.

• La mezcla de variedades de uva: se determina por el vino que se quiere

obtener.

• La separación de la rapa: se ha de separa la parte leñosa del racimo de

la uva mediante una máquina llamada despalilladora.

• Obtención del mosto: puede ser por dilaceración (rotura de los granos
del racimo mediante rodillos o cilindros), por centrifugación (separando
las partes sólidas del líquido) o por prensado (directamente o mediante
separación previa de la rapa). En otros tiempos se conseguía pisando la
uva con los pies.

• Correcciones y manipulaciones del mosto: es la enyesada (con sulfato

de calcio), la sulfatación (con dióxido de azufre o derivados) y la
fosfatación (con fosfatos) para obtener vino de características correctas
y constantes.

• Fermentación alcohólica: se vuelcan en grandes depósitos de madera o

acero inoxidable donde el mosto va fermentando debido a las
levaduras, transformando los azúcares en alcohol etílico y CO2.
Actualmente se acostumbra a inactivar la levadura del mosto por
sulfatación y se añade la levadura seleccionada. Durante el proceso, en
el cual se ha de controlar la temperatura y el aire, los restos de sólidos
suben a la superficie impidiendo la correcta ventilación. La
fermentación que primeramente es lenta, después es tumultuosa y
finalmente vuelve a ser lenta, tiene una durada que oscila entre unos
cuantos días y algunas semanas. Es importante controlar el pH de este
proceso ya que de él depende su rendimiento. Si se trata de un vino
negro o rosado hace falta que la piel esté en contacto con el mosto
fermentado ya que los antocianos (donadores del color) sólo se
disuelven bien en alcohol. En este caso, se lleva a cabo la maceración
carbónica, proceso en el cual el racimo se fermenta sin romper la uva.
El método convencional de fermentación alcohólica comporta la rotura
o aplastamiento de los granos de uva para liberar el zumo y la pulpa de
la piel. En la maceración carbónica el zumo fermenta mientras se
encuentra aun dentro de la piel del grano.

• Fermentación málico láctica: es debido a bacterias que producen la

descarboxilación del ácido málico dando lugar al ácido láctico, alcoholes

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 Determinación de Polifenoles en el Vino

y CO2. Puede dar lugar espontáneamente después de la fermentación

alcohólica o se puede inducir. Esta fermentación aporta una
disminución del pH a la vez que aumenta el contenido en polifenoles y
glicerol, la cual cosa da lugar a una perdida de acidez del vino y una
ganancia en suavidad y aroma, pero también puede conducir a su
deterioramiento debido a la formación de aminas biogénicas, perdida
de color y aumento del acidez volátil.

• Trasegar: facilita el aireo y la separación del poso.

• Prensa de la parte sólida: da un nuevo líquido, que se añade al

trasegado, o se obtiene un vino de menos calidad (vino prensado).

• Segunda fermentación lenta: reposo y enfriamiento del vino que facilita

su transparencia. Pasa en las bodegas y puede incluir una
fermentación málico láctica espontánea. Después, el vino se vuelve a
trasegar.

• Envejecimiento: químicamente, en esta etapa se producen un conjunto

de oxidaciones, reducciones y esterificaciones que completan la
maduración del vino, y tiene una duración que varía desde tres meses
hasta más de cinco años. Tiene lugar en botas de madera,
habitualmente roble, y el intercambio de aromas entre el vino y la
madera le confiere a estos unos rasgos más complejos. Estos vinos
serán los nombrados de Crianza, Reserva y Gran Reserva. La mayoría
de vinos de mediana y baja calidad son sometidos, pero, al
envejecimiento acelerado, que consiste en mantenerlos a una
temperatura próxima a la de su punto de congelación durante un
periodo de ocho días, después del cual el vino adquiere unas
características similares a las que se conseguirían haciéndolos
envejecer en la bodega durante tres meses.

• Embotellamiento: para obtener la calidad deseada, se puede someter el

vino a diversas correcciones: alcoholización o adobamiento, adición de
ácido tartárico o ácido cítrico, neutralización, corrección del color,
corrección de la cata del vino dulce con azúcar o con mosto (vino
vertido) y clarificación con gelatina, bentonita o enzimas.

1.2. Polifenoles en el vino

Los polifenoles son un grupo de sustancias químicas formadas por anillos
aromáticos y caracterizados por la presencia de al menos un grupo fenol en su
estructura. Son productos esenciales para la fisiología vegetal y en general, son
potentes antioxidantes.
Se estima que hay más de 8.000 polifenoles diferentes. Estructuralmente van
des de moléculas simples como los ácidos fenólicos a polímeros de alto peso
molecular como los taninos.

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Arantza León Sanz

Los polifenoles se subdividen de la siguiente manera:

Figura 1.Clasificación de los polifenoles.

La ingesta total de polifenoles en el ser humano es difícil de calcular, pero se

piensa que es muy alta, y puede superar el gramo por día en algunas
poblaciones. No obstante esto, hasta hace poco tiempo, el interés nutricional de
estos compuestos requiere en los efectos adversos que se producen. Estos
efectos son debidos al hecho que algunos polifenoles, como ahora los taninos,
precipiten proteínas presentes en los alimentos y también forman complejos
insolubles con algunos oligoelementos y por lo tanto disminuyen el valor
nutricional de los alimentos. Los compuestos polifenólicos de la uva se encuentra
en la piel, en semillas y en la pulpa, y después del proceso de vinificación los
encontraremos en el vino.

La siguiente tabla muestra el tipo de polifenol según el número de átomos de

carbono y ejemplos de esos polifenoles en el vino.

Tabla 1.1. Clasificación Polifenoles

Ejemplos presentes en
Átomos de Carbono Esqueleto Tipo
vino

6 C6 Fenoles Simples
Benzoquinonas
-------------------------- --------------- ------------------------- -------------------------------
7 C6 - C1 Ácidos Fenólicos Ácido Gálico
-------------------------- --------------- ------------------------- -------------------------------
8 C6 - C2 Derivados de Tirosina Tirosol
Ácidos Fenilacéticos

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 Determinación de Polifenoles en el Vino

-------------------------- --------------- ------------------------- -------------------------------

9 C6 - C3 Ácidos cinámicos Ácido Cafeico
Fenilpropenos
Cumarinas
-------------------------- --------------- ------------------------- -------------------------------
10 C6-C4 Naftoquinones
-------------------------- --------------- ------------------------- -------------------------------
13 C6 -C1-C6 Xantonas
-------------------------- --------------- ------------------------- -------------------------------
14 C6- C2-C6 Estilbenos Resveratrol
Antraquinones
-------------------------- --------------- ------------------------- -------------------------------
15 C6-C3-C6 Flavonoides Quercetina
Isoflavonoides Cianidina
Catequina
Miricetina
Malvidina
-------------------------- --------------- ------------------------- -------------------------------
18 (C6-C3)2 Lignanos
Neolignanos
-------------------------- --------------- ------------------------- -------------------------------
30 (C6-C3-C6)2 Bioflavonoides
-------------------------- --------------- ------------------------- -------------------------------
n9 (C6-C3)n Ligninas
-------------------------- --------------- ------------------------- -------------------------------
n6 (C6)n Melaninas Catecolicas
-------------------------- --------------- ------------------------- -------------------------------
n15 (C6-C3-C6)n Taninos Condensados Procianidina

1.2.1. Papel de los polifenoles en el vino

Los polifenoles se les atribuye diferentes efectos beneficiosos para la salud
humana, ya que la mayoría de estos compuestos actúan como antioxidantes y,
por lo tanto, podrían tener efectos beneficiosos sobre enfermedades en que la
oxidación representa un papel importante (enfermedades cardiovasculares,
neurodegenerativas como el Alzheimer o el Parkinson, el proceso de
envejecimiento o el cáncer). En la última década los compuestos polifenólicos
han despertado un gran interés en la comunidad científica. Muchos se investigan
con profundidad para determinar si resultan útiles como anticancerígenos y en el
tratamiento de otras enfermedades de gran trascendencia social.

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Arantza León Sanz

Los polifenoles se encuentran en todos los tipos de vinos, pero en cantidades

diferentes. F. Leighton y I. Urquiaga en su estudio [1] de polifenoles dan valores
equivalentes a los de la tabla 1.3 donde se comparan diversas bebidas [2]. El
vino tinto contiene muchos más polifenoles que el blanco, mientras que los vinos
rosados se encuentran en una posición intermedia. Además, se han realizado
diversos estudios que demuestran que el vino tinto presta mayor protección
cardiovascular a diferencia del vino blanco.

Tabla 1.2. Concentracion en mg/L de algunos constituyentes polifenolicos del

vino.
Polifenoles Vino tinto Vino blanco
Ácido gálico 95 7
Catequina 191 35
Epicatequina 82 21
Ácido cafeico 7,1 2,8
Cianidina 2,8 0,0
Malvidina 3-glucosa 23,5 1,0
Rutina 9,1 0,0
Miricetina 8,5 0,0
Quercitina 7,7 0,0
Resveratrol 1,5 0,03

Tabla 1.3. contenido total de polifenoles en diversas bebidas.

Contenido total de polifenoles (mg/L)
Vino tinto 1000-4000
Vino blanco 200-300
Cerveza 60-100
Te 750-1050

En un estudio de un vino tinto Cabernet Sauvignon se hizo un fraccionamiento y

análisis por cromatografía líquida de alta presión (HPLC) obteniéndose como
resultado tres fracciones:

• Polifenoles neutros

• Polifenoles ácidos

• En la fracción acuosa residual las antocianinas. [3]

La fracción de polifenoles hidrosolubles representa el 71% de sus componentes

fenólicos por lo tanto lo más importante en cuanto a capacidad antioxidante. A

- 12 -
 Determinación de Polifenoles en el Vino

pesar de estola fracción de polifenoles neutros es la que tuvo mayor actividad

antioxidante por unidad de concentración de polifenoles.[4]
Como ejemplo de los polifenoles, hablamos del resveratrol, que es un producto
natural que se encuentra principalmente en la piel y piñones de la uva, y se unen
a las lipoproteínas humanas de baja densidad (LDL) después de un consumo
moderado de vino. Es un potente antioxidante al que se le atribuyen diferentes
efectos beneficiosos como actividad antiinflamatoria y antitumoral, ayuda a
reducir el riesgo de enfermedades coronarias, y recientemente se asocia a la
protección de enfermedades neurodegenerativas. Su contenido en el vino
depende de la variedad de uva y de la tecnología aplicada en la producción
vinícola. [5-7]

1.2.2. Polifenoles Utilizados

A continuación se muestra una lista con la clasificación y la estructura de cada
uno de los polifenoles estudiados en este proyecto:

1. Ácidos Fenólicos

• Ácido Siríngico

• Ácido Gálico

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Arantza León Sanz

• Ácido Vanílico

• 3,4-dihidroxibenzoico

• 4-hidroxibenzoico

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 Determinación de Polifenoles en el Vino

2. - Ácidos Cinámicos

• Ácido Cafeico

• Ácido Cumárico

• Ácido Felúrico

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Arantza León Sanz

3. - Flavonoides

• Epicatequina

• Catequina

• Quercetina

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 1.3. Métodos analíticos para la determinación
y caracterización de los polifenoles en el vino
Los polifenoles son los compuestos más relacionados con las propiedades
organolépticas del vino. La caracterización de los vinos respecto a los polifenoles
esta enfocada más en este sentido que no con el proceso vinícola, a pesar de que
la composición de compuestos polifenólicos también se puede caracterizar los
vinos según la región, el tipo de uva, el envejecimiento, etc.
La determinación polifenoles se suele llevar a cabo mediante técnicas de
separación como HPLC [8,9] CE [10-12] o GC [13-15]. Estos métodos realizan la
detección mediante técnicas espectrofotométricas, fluorimétricas o acoplamiento
a MS. También se han descrito métodos inmunológicos y enzimáticos [16,17] de
gran interés debido a la rapidez del análisis.
El contenido de los polifenoles en los vinos mantiene una fuerte dependencia con
el clima, la agricultura y las prácticas vinícolas. Este perfil composicional puede
dar información relevante. La composición elemental e isotópica [18], el
contenido de polifenoles [19,20] y las imprentas digitales de compuestos
volátiles [21] han estado utilizadas en diversos estudios para clasificar y
correlacionar los vinos según la vinificación, los orígenes o otros factores.
El análisis por componentes principales (PCA) es el método quimiométrico más
utilizado para un estudio preliminar de las propiedades de los vinos a partir de
los datos de los perfiles composicionales anteriormente nombrados. Otros
métodos como el análisis de agrupaciones (CA), el análisis discriminante linear
(LDA), las redes neuronales artificiales (ANN) y la refresión por mínimos
cuadrados parciales (PLS) se utilizan para obtener clasificaciones mas
especificas. De todos ellos se da una descripción en [22].
La caracterización de los vinos según la familia de compuestos estudiada la
caracterización se enfoca en una dirección o en otra. Los estudios realizados con
polifenoles se decantan para caracterizar los vinos según sus propiedades
organolépticas. También hay estudios que tratan de extraer información de otras
propiedades.

1.4. Técnicas utilizadas

1.4.1. Cromatografía de líquidos (HPLC)
La cromatografía líquida de alta eficacia o High performance liquid
chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna.
El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla
basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias
analizadas y la columna cromatográfica.
En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través
de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas
redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el
bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna.

- 17 -
Arantza León Sanz

La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes

se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas
con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de
retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del
compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El
tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo
de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un
compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria.

1.4.2. Electroforesis Capilar (CE)

Se basa en una técnica de separación de analitos mediante la aplicación de un
campo eléctrico. El gran poder de separación, eleva eficacia y bajo consumo de
muestra, esta técnica resulta adecuada para separar muchos analitos en una
gran diversidad de áreas. Sus límites de detección están condicionados por el
pequeño volumen de muestra introducida en el capilar, generalmente del orden
de pocos nL. Para facilitar la detección se ha desarrollado diversas estrategias de
derivatización. [23]

1.4.3. Espectrofotometría
La espectrofotometría es un método de análisis óptico que permite comparar la
radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad
desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma
sustancia.
Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece
ser completamente transparente absorbe radiaciones de longitudes de onda que
no pertenecen al espectro visible; el agua fuertemente en la región del infrarrojo.
La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la
estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química.
Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la
energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida.
El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de
onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos
aquellas longitudes de onda no absorbidas.
La Ley de Beer declara que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende
de la concentración en la solución.

1.4.4. Fluorescencia
La fluorescencia es la propiedad de una sustancia para emitir luz cuando es
expuesta a radiaciones del tipo ultravioleta, rayos catódicos o rayos X. Las
radiaciones absorbidas (invisibles al ojo humano), son transformadas en luz
visible, o sea, de una longitud de onda mayor al incidente.
En el proceso, una molécula absorbe un fotón de alta energía, se excita y
después emite como un fotón de baja energía (mayor longitud de onda). La
diferencia de energía entre la absorción y la emisión, es disipada como calor
(vibraciones moleculares). En la fluorescencia todo el proceso es muy corto

- 18 -
 Determinación de Polifenoles en el Vino

(>10-5 s) y este intervalo de tiempo es la principal diferencia con otro conocido

fenómeno luminoso, la fosforescencia (<10-5 s).

1.5. Métodos quimiométricos para el

tratamiento de datos
El análisis por componentes principales (PCA) se basa en concentrar la
información de un sistema, que originalmente puede estar contenida en un gran
número de variables. Los componentes principales se obtienen por combinación
lineal de las variables originales a través de una serie de transformaciones, de
modo que el primer componente principal describe la máxima cantidad de
información posible referente al sistema. El segundo componente principal, por
su parte, es ortogonal o perpendicular al primero y describe la máxima cantidad
de la información residual. De esta forma se van calculando los componentes
principales superiores hasta que toda la información relevante del sistema queda
descrita. El análisis por componentes principales actúa a modo de filtro de datos,
eliminando la información repetitiva y las variaciones aleatorias asociadas al
proceso experimental. Puede utilizarse para una caracterización preliminar de los
datos y para establecer pautas y dosificaciones.
El PCA descompone la matriz de datos experimentales en sus componentes
principales de la siguiente forma:
R = TP T + E (1)
Siendo R la matriz experimental, T la matriz de coordenadas principales o scores
que contiene las coordenadas de cada muestra en el nuevo espacio de
componentes principales, P la matriz de vectores propios, autovectores o
loadings, todos ellos ortogonales entre sí, que representan la dirección de los
componentes principales en el espacio de las variables originales, y E la matriz
de error de la reproducción de los datos en sus componentes principales. El
superíndice T se utiliza para indicar la matriz transpuesta.
Normalmente, suelen representarse los scores del primer componente principal
con respecto a los scores del segundo. De esta forma, se consigue una
distribución bidimensional de los objetos en la que pueden apreciarse las
diferentes agrupaciones y los objetos que se separan de ellas. En ciertos casos
particulares son interesantes las representaciones de los componentes
principales superiores. También, las representaciones de los loadings
proporcionan un información muy útil acerca de la relevancia de las variables y
de sus posibles correlaciones.

- 19 -
 CAPÍTULO 2: PARTE
EXPERIMENTAL

2.1. Reactivos
Reactivos y disolventes:

• Tetraborato de sodio decahidratado (Merck, reactivo analítico)

• Hidróxido de sodio (Merck, reactivo analítico)

• Metanol (Merck, reactivo para HPLC)

• 2-Propanol (Merck, reactivo para HPLC)

• Agua Milli-Q (Millipore)

• Ácido Fosfórico (Merck, reactivo analítico)

Polifenoles:

• Ácido Gálico (Gal)

• 3,4-dihidroxibenzoico (3,4-h)

• Catequina (Cat)

• 4-hidroxibenzoico (4-h)

• Epicatequina (Epi)

• Ácido Siringico (Syr)

• Ácido Cafeico (Caf)

• Ácido Vanílico (Van)

• Ácido Cumárico (Cum)

• Ácido Felúrico (Fel)

- 20 -
 Determinación de Polifenoles en el Vino

• Resveratrol (Resv)

2.2. Soluciones
Las soluciones madre de cada uno de los polifenoles se han preparado en
concentraciones de 100 mM en metanol.
A partir de las soluciones madre se han preparado todas las soluciones de
trabajo utilizando agua Milli-Q como disolvente.
Todas las soluciones se mantienen en el frigorífico.

2.3. Muestras de vino

De cada vino se almacena en la nevera 30 mL en un recipiente de plástico, sin
filtrar y sin desgasificar.

• 5 viñas, d.o. Tierra de Extremadura, Tempranillo y Garnacha 2007,

Joven (M1)

• Castillo de Liria, d.o Liria, 2007, Joven (M2)

• Viña Fadrí, d.o. Catalunya, 2007, Joven (M3)

• Don Luciano, d.o. La Mancha, 2006, Crianza (M4)

• Finca Resalso, d.o. Ribera del Duero, Tinto Fino (100%) 2006, Crianza
(M5)

• Torres Coronas, d.o. Catalunya, Ull de llebre (100%) 2004, Crianza

(M6)

• Señorío de los Llanos, d.o. Valdepeñas, Tempranillo 2005, Crianza (M7)

• Josep Foraster, d.o. Conca de Barberà, Cabernet Sauvignon,

Tempranillo 2008, Joven (M8)

• Clos Gebrat, d.o. Priorat, 2007, Joven (M9)

• Abadia Raimat, d.o. Costers del Segre 2006, Crianza (M10)

• René Barbier, d.o. Penedès, Ull de llebre 70%, Cabernet Sauvignon

20% y Merlot 10% 2004, Reserva (M11)

• Raimat viña 32, d.o. Costers del Segre, Cabernet Sauvignon 2005,
Crianza (M12)

• Señorío de los Llanos, d.o. Valdepeñas, Tempranillo 2007, Joven (M13)

• Estola, d.o. La Mancha, Tempranillo 2006, Crianza (M14)

• Pata Negra, d.o. Valdepeñas, Tempranillo 2001, Gran Reseva (M15)

• Finca Vieja, d.o. La Mancha, tempranillo 1999, Gran Reserva (M16)

• Protos, d.o. Ribera del Duero, Tinta del País 2007, Joven (M17)

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Arantza León Sanz

• Tilenus, d.o. Bierzo, Mencía 2007, Joven (M18)

• Bajoz, d.o. Tinta de Toro, 2007, Joven (M19)

• Valpinicia, d.o. Ribera del Duero, 2006, Crianza (M20)

• Señorío de Arriezu, d.o. Rioja, 2008, Joven (M21)

• Tierras Reina, d.o. Rioja, 2007, Joven (M22)

• Viña Zaco, d.o. Rioja, Tempranillo 2006, Crianza (M23)

• Viña Vial, d.o. Rioja, Tempranillo, Garnacha Tinta y Mazuelo 2004,

Reserva (M24)

• Duque de Azara, d.o. Somontano, Sauvignon Tempranillo y Merlot

2007, Joven (M25)

• Duque de Azara, d.o. Somontano, Sauvignon Tempranillo y Merlot

2005, Crianza (M26)

• Señorío de Lazán, d.o. Somontano, Cabernet Sauvignon, Moristel y

Tempranillo 2004, Reserva (M27)

• Irache, d.o. Navarra, Tempranillo, Cabernet Sauvignon y Garnacha

2007, Joven (M28)

• Gran Feudo, d.o. Navarra, Tempranillo, Garnacha y Cabernet

Sauvignon 2004, Reserva. (M29)

2.4. Instrumentación y Aparatos

Los instrumentos y aparatos utilizados han sido los siguientes:

• Cromatógrafo de líquidos Agilent 1100 series equipado con bomba

cuaternaria G1311A, desgasificador de vacío G1379A, detector de
diodos en serie G1315B equipado con una celda de flujo de 13 µL y
detector de fluorescencia G1321A. la inyección de las muestras se lleva
a cabo mediante una válvula de inyección de seis puertos Rheodyne
7725(i) con un helicoide de 20 µL de volumen.

• Columna cromatográfica Synergi Hydro-RP C-18 (150 mm x 4,6 mm

d.i.) y 4 µm de diámetro de partícula de Phenomenex con una
precolumna C18 (4mm x 3mm d.i.) de la misma casa.

• Electroforesis Capilar (HP 3D CE, Agilent Technologies, Germany),

equipada con un detector en serie de diodos y refrigeración del capilar
por aire.

• Capilares de sílice fundida de 75 µm d.i. x 375 µm d.e., 670 mm de

longitud total y 587 mm de longitud efectiva. (CMS, Reino Unido)

• Espectrofotometro Perkin-Elmer λ-19, controlado por ordenador

• Espectrofluorímetro Aminco serie 2 modelo AB2.

- 22 -
 Determinación de Polifenoles en el Vino

• Micropipetas automáticas de 10, 100, 1000 y 5000 µL (Nichipet EX,

Nichiryo Co., Japan)

2.5. Procedimiento experimental

2.5.1. Cromatografía de líquidos (HPLC)
Para la separación de los polifenoles se ha utilizado una columna cromatográfica
Synergi Hydro-RP C-18 (150 mm x 4,6 mm d.i.) y 4 µm de diámetro de partícula
de Phenomenex con una precolumna C18 (4mm x 3mm d.i.) de la misma casa.
El eluyente A, solución acuosa, es ácido fosfórico a una concentración de 9 mM, y
el eluyente B, solución orgánica, es metanol 100%. El caudal es de 1 mL / min.

Tabla 2.1. Tabla del gradiente.

Tiempo (min) 0 20 22 27 28
% Eluyente B 5 60 95 95 5

Se inyecta un volumen de 20 µL de cada vino filtrado previamente con un filtro

de 45 µm con ayuda de una jeringa.
La detección se ha realizado a 280 nm, 320 nm, 360 nm y 520 nm con el
detector UV-Visible. En el detector de fluorescencia la detección esta
comprendido en un intervalo de 260 – 375 nm. Para la obtención de datos se ha
utilizado el software suministrado por el fabricante (HP ChemStation).

2.5.2. Electroforesis Capilar (CE)

Para la separación de los polifenoles se ha utilizado un capilar de sílice fundida de
75 µm d.i. x 375 µm d.e., 670 mm de longitud total y 587 mm de longitud
efectiva. El electrolito de separación es bórax 20 mM (pH acuoso 9,2) con un
20% de 2-isopropanol. El potencial de separación es + 25 KV y las intensidades
obtenidas del orden de 30 µA.
La temperatura de termostatización del capilar de 25ºC. La detección se ha
realizado a 230 nm con un detector en serie de diodos y para la obtención de
datos se ha utilizado el software suministrado por el fabricante (HP
ChemStation).

Acondicionamiento del capilar

Antes de la primera inyección del día, el capilar se ha de activar con NaOH 0,1 M
durante 20 min, 5 min de agua y 3 min de electrolito, todos ellos a una presión
de ~ 1 bar finalmente se ha de equilibrar el capilar con el electrolito de
separación aplicando el potencial de trabajo durante 30min. Antes de cada
inyección se proceden a un pre-condicionamiento de capilar con NaOH 0,1 M
durante 2 minutos seguido de 1 min de agua y 2 min de electrolito todos ellos a
una presión de ~ 1 bar.

- 23 -
Arantza León Sanz

2.5.3. Espectrofotometría
Se han registrado los espectros UV-Visible de cada muestra de vino en un
intervalo de longitud de onda comprendido entre 200 nm y 900 nm.
Las muestras de vino se diluyen en agua Milli-Q.
Se trabaja con 100 µL de vino que se lleva a un matraz de 10 mL y se enrasa
con agua Milli-Q.
Se utiliza como blanco el agua Milli-Q.

2.5.4. Fluorescencia
Se han registrado los espectros de excitación – emisión de 29 muestras de vino
en un intervalo de longitud de onda de excitación entre 250 nm y 275 nm y de
emisión entre 260 nm y 460 nm. El objetivo, es determinar el punto máximo de
excitación y el de emisión.
Las muestras de vino se diluyen en agua Milli-Q.
Se trabaja con una solución de 200 µL de vino en un matraz de 10 mL enrasado
con agua Milli-Q.

- 24 -
CAPÍTULO 3: RESULTADOS
Y DISCUSIÓN

3.1. Cromatografía de líquidos (HPLC)

En este apartado, se describirán todos los estudios realizados para separar el
mayor número de compuestos polifenólicos. Como criterio de optimización, las
condiciones experimentales de separación han de permitir separar el máximo
nombre de analitos en el menor tiempo de análisis.
Se han fijado algunas de las condiciones cromatográficas:

• Eluyente A: 9 mM H3PO4 (pH = 2,5)

• Eluyente B: Metanol 100 %

• Caudal de 1mL/min

• λ = 280, 320, 360, 520 nm

• Columna cromatográfica: Synergi Hydro-RP C-18 (150 mm x 4,6 mm

d.i.) y 4 µm de diámetro de partícula de Phenomenex

• Precolumna C18 (4mm x 3mm d.i.) de Phenomenex

3.1.1. Optimización del gradiente de elución

a) Estudio de muestras sintéticas de polifenoles
Se ha analizado el comportamiento cromatográfico de 11 polifenoles (ácido
gálico, 3,4-dihidroxibenzoico, 4-hidroxibenzoico, catequina, epicatequina, ácido
vanílico, ácido siríngico, ácido cafeico, ácido cumárico, ácido felúrico, resveratrol)
de los cuales se ha estudiado el tiempo de retención y los espectros de cada uno.
Se ha preparado una solución madre de polifenoles de 25 µL de cada polifenol en
2 mL de metanol, a partir de las soluciones madre 100 mM preparadas en
metanol. Y de la solución anterior se prepara otra de 200 µL en 1mL de agua
Milli-Q teniendo así una concentración de 0,0025 mM.

- 25 -
Arantza León Sanz

Con esta última solución, se estudia el comportamiento de los polifenoles en

función del porcentaje inicial del eluyente B (Metanol) de la pendiente del
gradiente de metanol generado. En la tabla 3.1 se muestra el diseño
experimental utilizado.
Para asegurar que entre cada análisis la columna esté estabilizada se añade un
periodo de 5 minutos más al final, llamado post-time.

Tabla 3.1. Optimización de la programación del gradiente de elusión para las

muestras sintéticas de polifenoles.

Método
Tiempo (min) 0 15 17 19 20
A)
% Eluyente B 0, 5, 10 60 95 95 0, 5, 10

Tiempo (min) 0 20 22 24 25
B)
% Eluyente B 0, 5, 10 60 95 95 0, 5, 10

Tiempo (min) 0 25 27 29 30
C)
% Eluyente B 0, 5, 10 60 95 95 0, 5, 10

Tiempo (min) 0 30 32 34 35
D)
% Eluyente B 0, 5, 10 60 95 95 0, 5, 10

Comprobamos que los picos salen bien definidos, es decir, sin cola y que se
pueden identificar todos ellos excepto 3 polifenoles que son difíciles de separar
adecuadamente.
Estos polifenoles son:

Tabla 3.2. Polifenoles

Peso
Polifenol Familia
molecular
Epicatequina 290.27 Flavoniode
Ácido vanílico 168.15 Ácido Fenólico
Ácido Cafeico 180.16 Ácido Cinámico

En la tabla 3.3 se refleja los tres polifenoles sintéticos que no se han podido
definir correctamente en función del porcentaje inicial de eluyente B frente al
tiempo que transcurre la pendiente del gradiente de metanol generado (60%).

- 26 -
 Determinación de Polifenoles en el Vino

Tabla 3.3. Optimización de la programación del gradiente de elución de

separación de polifenoles.
% Eluyente B
0 5 10
DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600,50 (ARANTZA\14ABR001. D) DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600, 50 (ARANTZA\14ABR006. D) DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600, 50 (ARANTZA\ 14ABR010.D)

11.784

10.978
12.468
mAU mAU mAU
100 100
90

11.282
12.718

12. 079
80

80 80
70

60
60
60

15 50

40
11.982

10.480
40

11. 318
40
11.665

10.065
30

10.900
20 20
20

10

0
0 0
11. 2 11.4 11.6 11.8 12 12.2 12.4 12.6 12.8 13 min
10.8 11 11. 2 11. 4 11.6 11.8 12 12.2 12.4 min 9.8 10 10.2 10.4 10.6 10.8 11 11. 2 11.4 11.6 min

DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600,50 (ARANTZA\14ABR003. D) DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600, 50 (ARANTZA\14ABR007. D) DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600,50 (ARANTZA\14ABR012.D)
14.928

13.851

12. 647
mAU mAU mAU
15. 295

14. 264

13. 084
80
80

70
70
70

60
60 60

50
50 50

20 40 40 40
14.744

13. 653
14.563

13.513

12. 446
12. 298
30 30 30
Tiempo (min)

13.594

12.449

11. 240
20 20
20

10
10
10

0
0
13.5 14 14.5 15 15.5 min 0
12 12.5 13 13. 5 14 14.5 min
11 11.5 12 12. 5 13 13. 5 min

DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600,50 (ARANTZA\14ABR004. D) DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600, 50 (ARANTZA\14ABR008. D) DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600,50 (ARANTZA\ 16ABR001. D)
16.922

15.606

14.167
mAU mAU m AU

16.096
17.457

14.728
70

60 60
60

50 50
50

25
40 40
40
15. 377
15. 271

14.003
16.592

13.846
30 30 30
13.741
14. 928

12.272
20 20 20

10 10 10

0
0 0
14.5 15 15.5 16 16.5 17 17.5 18 min
13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 min 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 min

DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600,50 (ARANTZA\14ABR005. D) DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600, 50 (ARANTZA\14ABR009. D) DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600,50 (ARANTZA\16ABR002.D)
18.953

17. 512

15. 402
mAU mAU mAU

80 70
70
18.164

16.113
70
60
19.603

60

60
50
50

50

30
40
40
40

30
17.022

30
18.521

30

14.954
15.020
16.531

20
13. 012

20 20

10
10
10

0 0

16.5 17 17.5 18 18. 5 19 19.5 20 min 15 15.5 16 16.5 17 17. 5 18 18.5 min 0

12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16. 5 min

b) Estudio con una muestra de vino

En este apartado, se estudia una muestra de vino filtrada previamente con un
filtro de 45 µm para asegurar que no entra ninguna partícula que pueda obstruir
la precolumna y la columna.
Se estudia el comportamiento de los polifenoles en función del porcentaje inicial
del eluyente B (Metanol) de la pendiente del gradiente de metanol generado. En
la tabla 3.4 se muestra el diseño experimental utilizado.
En este caso se amplia el tiempo de post-time a 10 minutos para asegurar que la
columna está estabilizada y preparada para el siguiente análisis.

- 27 -
 Arantza León Sanz

0
100
200
300
400
500
mAU

0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
mAU
0

0
1.426
1.543
1.819
2.2322.054
F)
E)

1.443

G)

H)
2.490
2.608 1.568
2.871 2.763 1.695
3.068 1.882
3.327
3.423 2.129
3.695
3.811 2.313
4.133

2.5
4.246 2.578
Método

4.441
4.604 2.732
2.940

5
3.008
5.312 3.324
5.686 3.420
5.883
6.077
6.377
6.688
6.968
7.378 4.354
7.637 4.662
7.953 4.915

5
8.599 5.126
8.824 5.286
9.285 5.570
9.465
9.842 5.869
5.965

10
6.189
10.506 6.336
10.909 6.479
6.696
6.905

DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600,50 (ARANTZA\16ABR006.D)

DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600,50 (ARANTZA\16ABR005.D)

11.562 7.032
7.159
12.060
12.405

7.5
12.733 7.576
7.823
13.201
13.451 8.199
14.198 8.443
14.473 8.732
14.708

15
15.181 9.062
Tiempo (min)
Tiempo (min)
Tiempo (min)
Tiempo (min)

15.764
15.939 9.514
9.689
16.513 9.966

10
17.038 10.263

- 28 -
17.316 10.409
10.548
17.992 10.837
18.415 11.092
18.765 11.420
19.266 11.586 11.713
19.490
0
0
0
0

19.856 12.017

20
20.674 12.362
12.530

12.5
21.092 12.667
21.498 12.871
13.141
21.993
22.198 13.319
22.464 13.492
13.808
23.130
23.322 14.042
23.583 14.256
23.947 14.439
24.330
24.531 14.813

15
24.960

25
15.323
25.840 15.523
15.748
26.488 16.059
27.245 16.583
16.829
17.160
17.361
muestras comerciales de vino.

28.944 17.456

17.5
29.335 17.702
17.876
17.960
18.095
30 32 37
25 27 32
20 22 27
15 17 22

30
30.620 18.372
18.468
18.685

32.937

20
33.439 20.244
38
33
28
23

20.810

35
35.233
35.818
% Eluyente B 0, 5, 10 60 95 95 0, 5, 10
% Eluyente B 0, 5, 10 60 95 95 0, 5, 10
% Eluyente B 0, 5, 10 60 95 95 0, 5, 10
% Eluyente B 0, 5, 10 60 95 95 0, 5, 10

min
min

Figura 3.1. Cromatograma de una mezcla de vino. 0% de eluyente B inicial a 15 min.

Figura 3.2. Cromatograma de una mezcla de vino. 10% de eluyente B inicial a 30 min.
Tabla 3.4. Optimización de la programación del gradiente de elusión aplicada en
 Determinación de Polifenoles en el Vino

En este caso, a diferencia del estudio de los polifenoles no se puede apreciar con
facilidad cuál de los estudios es el más adecuado como se puede ver en los
ejemplos de las representaciones cromatográficas, por lo tanto, se hace un
tratamiento de datos.
Este tratamiento consiste en:

1. Seleccionar todos los picos del cromatograma (n picos).

2. Eliminar todos los picos con una altura inferior a 3 mAU (n picos filtrados).

3. Escoger el último pico del cromatograma como referencia para establecer el

tiempo de análisis.

Tabla 3.5. Tratamiento de datos para optimizar el método.

Método Pico ref. n Picos
n Picos
% Eluyente B Tiempo (min)* (min) Filtrados
0 15 18.685 75 71
0 20 18.646 73 70
0 25 18.604 70 67
0 30 23.548 83 79
5 15 23.517 80 77
5 20 23.428 85 83
5 25 28.394 93 91
5 30 28.286 86 86
10 15 28.174 82 77
10 20 33.197 85 83
10 25 33.083 87 86
10 30 32.937 79 77

* Tiempo que dura el gradiente de elusión aplicado. Es decir, desde el %B inicial

hasta el 60% de B.

4. Seleccionamos dos criterios para tratar los datos obtenidos:

a) Factor de tiempo (dtiempo)

Se da el valor 1 cuando el tiempo es inferior a 15 min y se da el valor 0 al
tiempo que supere 30 min.
En este caso interesan los valores más próximos a 1 (óptimo) que los próximos a
0.
Estos límites se fijan por criterio propio.

Figura 3.3. Representación gráfica del criterio factor tiempo.

- 29 -
Arantza León Sanz

Se aplica la siguiente ecuación:

Límite Superior − Pico de Referencia
d = (2)
tiempo Límite Superior − Límite Inferior
Donde,
Límite Inferior = 15 min
Límite Superior = 30 min

b) Número de picos (dpicos)

Se da el valor 0 cuando el número de picos es inferior a 50 picos y se da el valor
1 al número de picos que supere 100 picos.
En este caso interesan los valores más próximos a 1 (óptimo) que los próximos a
0.
Estos límites se fijan por criterio propio.

Figura 3.4. Representación gráfica del criterio número de picos.

Se aplica la siguiente ecuación:

n Picos Filtrados − Límite Inferior

d picos = (3)
Límite Superior − Límite Inferior
Donde,
Límite Inferior = 50 picos
Límite Superior = 100 picos

Estos criterios se relacionan mediante la función conjunta:

1/2
Dconjunta =  d picos — dtiempo  (4)
 

- 30 -
 Determinación de Polifenoles en el Vino

Tabla 3.5. Relación de los criterios según la función conjunta.

Método
dtiempo dpicos Dconjunta
% Eluyente B Tiempo* (min)
0 15 0.82 0.42 0.52
0 20 0.82 0.40 0.50
0 25 0.82 0.34 0.44
0 30 0.57 0.58 0.60
5 15 0.57 0.54 0.56
5 20 0.58 0.66 0.65
5 25 0.33 0.82 0.66
5 30 0.34 0.72 0.59
10 15 0.34 0.54 0.50
10 20 0.09 0.66 0.41
10 25 0.10 0.72 0.44
10 30 0.10 0.54 0.36

* Tiempo que dura el gradiente de elusión aplicado. Es decir, desde el %B inicial

hasta el 60% de B.
Como se puede observar en la función (Dconjunta) hay dos posibles métodos que
podrían ser óptimos, 0.65 y 0.66.
Se elige el método con 5% eluyente de B inicial y duración de 20 minutos,
porque los valor de dtiempo y dpicos son, en comparación al otro método, más
iguales entre ellos.
De esta manera se ha optimizado el método que queda de la siguiente manera:

Tabla 3.6. Gradiente optimizado.

Tiempo (min) 0 20 22 27 28
% Eluyente B 5 60 95 95 5

100

80
% Eluyente B

60

40

20

0
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
t (m in)

Figura 3.5. Representación gráfica del gradiente optimizado.

- 31 -
Arantza León Sanz

6.288
mAU

500

400

300

10.550

14.233

16.743
15.125
11.068

12.577
200

12.994

13.834
13.926

16.231
13.628

16.434
14.656

18.937
15.789
15.595
11.846
11.661

12.807

17.216
13.278

17.680
9.278

18.285
18.366
9.516

10.783

18.540
10.042

19.359
10.210
3.178

100
2.9653.034

8.435

20.047
4.810 4.645

8.695
7.823
4.507

20.355
9.009

23.517
5.316

20.616
5.213

20.932

22.739
8.240
7.577
8.070
6.887

21.707
22.054
22.148
2.146

7.300
3.780

5.624

6.668
6.546
4.229

7.063
4.009

5.998
5.794

23.701
4.938

25.236
2.603

24.140

25.841
2.340
1.569
1.447

2.759
1.704
1.888

0 5 10 15 20 25 min

Figura 3.6. Cromatograma de una muestra de vino utilizando el gradiente optimizado.

3.1.2. Identificación de polifenoles en muestras vino

En este apartado se intenta identificar los polifenoles que anteriormente se han
estudiado en una muestra concreta de vino.
Con las condiciones mencionadas anteriormente y con el gradiente de elución
que se ha establecido en el apartado 3.1.1. se analiza:

1. Solución de polifenoles.

Se coge 200 µL de la solución madre de polifenoles y 800 µL de agua Milli-Q.

2. Muestra de vino diluida.

Se coge 200 µL de agua Milli-Q y 800 µL de vino.

3. Muestra adicionada.

Se coge 200 µL de la solución madre de polifenoles y 800 µL de vino.

Se ha obtenido los siguientes cromatogramas de los cuales se han podido

identificar los polifenoles indicados:

- 32 -
 0
50
100
150
200
250
300
350
400
mAU

0
100
200
300
400
mAU
0

0
1.448 1.452
1.534
1.560 1.703
1.709 1.980
1.974 2.188
2.201 2.288
2.328 2.446
2.491 2.650
2.693 2.804 2.908
2.8462.946

3.644
3.710
4.048
4.180 4.384
4.436
4.702

5
4.947

5
5.037
5.191 5.175
5.377
Ga

Ga
5.463
5.852
6.112
6.183
6.415 6.464
6.810 6.754
7.103 7.047
7.268
7.353
7.606
7.759
7.797
8.011
8.411 8.348
DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600,50 (ARANTZA\14MAY 004.D)

DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600,50 (ARANTZA\14MAY 002.D)

8.636 8.567
9.018 8.947
9.173
3,4-h

9.252

3,4-h
9.553 9.477

10

10
10.120 10.062
10.272 10.456
10.558 10.730
10.808
11.030
Cat

11.108 11.186

Cat
11.697 11.606
11.908 11.839

12.481
4-h

12.575

4-h

- 33 -
13.055 12.975

Van
Van

Caf
13.661 13.597
Caf

13.858 13.775
13.919

picos.
Syr
14.271 14.208
Syr

14.406
14.718 14.662

15
15

15.168 15.118
15.624 15.548
15.823 15.780
16.275 16.217
16.474 16.400
16.766 16.690

Cum
Cum

17.256 17.184
Fel

Fell
17.752 17.680
18.341
18.449 18.240
18.365
18.626 18.558
19.021 18.944
19.476 19.346

Resv

20
Resv

20

20.130 20.025
20.697 20.606
20.996 20.914
21.021
21.774 21.703
22.124 22.061
22.169
22.515 22.461
22.787 22.742

23.547 23.530
23.733
24.165 24.157
24.405 24.397
24.818

25
25.054
25

25.266 25.036
25.237

polifenol individualmente. (ver Tabla 3.10. Espectros de los polifenoles)

min
min

Figura 3.8. Cromatograma de la adición de polifenoles en el vino con identificación de

Determinación de Polifenoles en el Vino

Figura 3.7. Cromatograma de la solución de vino con identificación preeliminar de picos.

referencia el tiempo de retención y el espectro de cada solución sintética de

espectros de cada pico en la muestra de vino y en la adicionada, teniendo de
Para verificar los polifenoles identificados en los cromatogramas, se identifica los
 Arantza León Sanz

Tabla 3.7. Espectros de los polifenoles.

Tiempo Espectro
Polifenol Espectro polifenol Espectro vino
retención vino+adición

Gal 6.12

3,4-H 9.17

Cat 11.04

4-H 12.48

Epi 12.98

Van 13.59

- 34 -
 Determinación de Polifenoles en el Vino

Tiempo Espectro
Polifenol Espectro polifenol Espectro vino
retención vino+adición

Caff 13.76

Syr 13.91

Coum 16.68

Fell 17.19

Resv 19.35

Se puede ver que la mayoría se corresponden con el espectro del polifenol sólo.
En concreto, el 4-hidroxibenzoico su espectro en el vino sólo es muy similar en
cambio con la adición no se podría asegurar, así que es muy probable que ese
pico esté formado por varios componentes. En cambio, con el resveratrol pasa al
revés, se identifica mejor en la adición de polifenoles en el vino que en la
muestra de vino sola.

- 35 -
Arantza León Sanz

Otra observación es que en el vino sólo y en el vino con la adición de polifenoles

no se ha podido identificar el polifenol epicatequina. Es uno de los tres
componentes que en el estudio de polifenoles no se podía separar
adecuadamente, por lo tanto es posible que por el tiempo de retención y el
espectro que se obtiene al identificar el ácido vinílico, forme parte de éste.
En general, podemos decir que la identificación es correcta. Pero, la información
es insuficiente, se necesitaría hacer un estudio más amplio para verificar que la
adición de los polifenoles tiene un comportamiento proporcional.

3.1.3. Repetibilidad
En este apartado, la finalidad es obtener el mismo perfil cromatográfico respecto
al tiempo de retención y el área del pico de los analitos de una misma muestra
de vino analizada repetidamente con el mismo método para verificar que el
método seleccionado es válido.
Se ha decidido analizar la muestra seis veces a 280 nm y queda representado de
la siguiente manera:
DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600,50 (ARANTZA\12MAY 001.D)
DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600,50 (ARANTZA\12MAY 002.D)
DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600,50 (ARANTZA\12MAY 003.D)
DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600,50 (ARANTZA\12MAY 004.D)
DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600,50 (ARANTZA\12MAY 005.D)
DAD1 A, Sig=280,4 Ref =600,50 (ARANTZA\12MAY 006.D)
mAU

400

350

300

250

200

150

100

50

0 5 10 15 20 25 min

Figura 3.9. Cromatograma de repetibilidad a 280 nm.

Otra manera representativa queda reflejada en una tabla:

Tabla 3.9. Repetibilidad

Tr* RSD (%) Área RSD (%)

Polifenol
promedio (Tiempo) promedia (Area)

Ga 6.17 0.47 3106.15 0.55

3,4-H 9.27 0.42 178.35 0.96
Cat 9.56 0.24 148.38 0.87
4-H 10.10 0.32 89.36 1.55
Epi 10.55 0.25 1093.61 1.54
Van 11.10 0.30 1055.51 2.64
Caff 11.68 0.23 1191.37 4.17

- 36 -
 Determinación de Polifenoles en el Vino

Syr 11.90 0.22 1668.45 1.41

Coum 12.56 0.24 3422.67 2.48
Fell 13.04 0.22 3109.53 3.13
Resv 13.66 0.19 3214.05 2.66

* Promedio del tiempo de retención

En esta tabla se muestra el valor de RSD del área del pico y el tiempo de
retención de los polifenoles identificados en el vino. Se ha fijado como criterio
que el RSD no puede ser superior al 5%. Por lo tanto, se da válida la
repetibilidad, teniendo en cuenta que la muestra sólo se filtra.

3.1.4. Detector de Fluorescencia

En este apartado, se conecta el detector de fluorescencia simultáneamente al
detector de UV-Visible. Se ha utilizado el mismo método cromatográfico
optimizado para el detector de absorción molecular UV-Visible. La finalidad es ver
si algunos polifenoles pueden ser estudiados fluorimétricamente.
Como en el apartado 3.1.2., se ha identificado los polifenoles de la solución
madre que presentan mayor intensidad de fluorescencia y se han identificado en
una muestra de vino:
FLD1 A, Ex=260, Em=375 (ARANTZA\18MAY 001.D)
13.533

LU
Van

140

120

100

80

Syr
14.150

60

Cat
40
11.031

Resv
4-h
20 3,4-h
19.490
19.025
12.348

21.309
17.723
9.185

22.370

0 5 10 15 20 25 min

Figura 3.10. Cromatograma de los polifenoles estudiados en detector de fluorescencia con

λ excitación=260 , λemisión= 375 nm

- 37 -
Arantza León Sanz

FLD1 A, Ex=260, Em=375 (ARANTZA\24ABR006.D)

14.791

18.603
LU

12.425
160

140

13.369
120

15.288
100

80

13.194
Caf

9.957
60

13.841
14.408

17.537
17.099
40

15.996
Cat

14.580
Resv

14.174
11.839

13.658
11.107

16.585
15.621
12.814
12.055
Ga

16.308
8.575
6.782

19.039
11.591

22.274
11.370
20

17.909

19.370
10.603

22.014
8.378

20.564
20.015
8.987

21.139
6.218

9.396

20.989

21.715
19.714
9.165

23.660
23.414
9.691
8.148

23.237
3.192

22.862
7.732
5.613
3.317

5.783

7.185
6.437

7.385

0 5 10 15 20 25 min

Figura 3.11. Cromatograma de una muestra de vino en detector de fluorescencia con

λ excitación=260 , λemisión= 375 nm.

3.2. Electroforesis Capilar

En este apartado se estudiará el comportamiento electroforético de diversos
vinos utilizando unas condiciones experimentales optimizadas anteriormente. El
procedimiento experimental está explicado en el apartado 2.5.2. Electroforesis
Capilar.
El estudio realizado ha consistido en la comparación de los perfiles
electroforéticos de 6 vinos diferentes:

• 5 viñas, d.o. Tierra de Extremadura, Tempranillo y Garnacha 2007,

Joven (M1)

• Castillo de Liria, d.o Liria, 2007, Joven (M2)

• Viña Fadrí, d.o. Catalunya, 2007, Joven (M3)

• Don Luciano, d.o. La Mancha, 2006, Crianza (M4)

• Finca Resalso, d.o. Ribera del Duero, Tinto Fino (100%) 2006, Crianza
(M5)

• Torres Coronas, d.o. Catalunya, Ull de llebre (100%) 2004, Crianza

(M6)

Además, los seis vinos escogidos son de dos tipos diferentes: joven y crianza, se
diferencian en la denominación de origen, la añada y el tipo de uva.
En los perfiles electroforéticos aparecen diferencias y similitudes:

- 38 -
 Determinación de Polifenoles en el Vino

DAD1 A, Sig=230,30 Ref=off (C:\CHEM32\1\DATA\LIDIA\090309_CE 2009-03-09 11-54-30\019-0302.D)

mAU

5 10 15 20 25 30 35 40 45 min

Figura 3.12. Electroferograma de la M1 a 230 nm, electrolito de bórax 20 mM con un 20%

de 2-isopropanol a +25KV y 30µA.

DAD1 A, Sig=230,30 Ref=off (C:\CHEM32\1\DATA\LIDIA\120309_CE 2009-03-12 11-31-33\029-0302.D)

m AU

16

14

12

10

5 10 15 20 25 30 35 40 45 m in

Figura 3.13. Electroferograma de la M5 a 230 nm, electrolito de bórax 20 mM con un 20%

de 2-isopropanol a +25KV y 30µA.

3.3. Espectrofotometría
En este estudio se han registrado los espectros de 29 muestras de vino
previamente diluidos con agua (100 µL de vino en 10 mL de agua Milli-Q). La
finalidad es obtener los espectros de absorción molecular de cada vino para ver
si hay diferencias entre ellos. Se ha podido observar que todos los vinos
analizados presentan espectros bastante semejantes.
(Ver Anexo 1 Apartado 1.3 Espectrofotometría)

- 39 -
Arantza León Sanz

3.4. Fluorescencia
En este estudio se han registrado los espectros de 29 muestras de vino
previamente diluidos con agua (200 µL de vino en 10 mL de agua Milli-Q). La
finalidad es obtener los espectros fluorescentes o espectros de emisión molecular
de cada vino para ver si hay diferencias entre ellos. Se ha podido observar que
todos los vinos analizados presentan espectros bastante semejantes.

3.4.1. Espectros de emisión

Se ha registrado los espectros de emisión en un intervalo de 280 a 450 nm.
Observamos que la longitud de máxima emisión es 376 nm.

35

30

25

20

15

10

0
260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

Figura 3.14. Representación de los espectros de emisión de las muestras

de vino.

3.4.2. Excitación
Se ha registrado los espectros de emisión en un intervalo de 260 a 320 nm.
Observamos que la longitud de máxima emisión es 260 nm.

- 40 -
 Determinación de Polifenoles en el Vino

35

30

25

20

15

10

0
254 256 258 260 262 264 266 268 270 272 274

Figura 3.15. Representación de los espectros de excitación de las

muestras de vino.

3.5. Estudio de los perfiles composicionales de

vinos
En este apartado, se analiza los resultados de las 4 técnicas independientemente
mediante el análisis por componentes principales (PCA).
Se puede establecer relaciones y pautas según la denominación de origen, la
crianza, la añada y el tipo de uva.
La Figura 3.15, representación de scores de los datos obtenidos mediante la
cromatografía de líquidos con detección fluorescente. Según la denominación de
origen, se puede ver que las muestras de vinos están dispersas, teniendo en
cuenta que la muestra es muy variable, se puede ver que los vinos con
denominación de origen la Rioja (color lila) tienen un comportamiento similar, ya
que se encuentran relativamente cerca. También pasa con algunos vinos de
Cataluña, que según la zona también quedan próximos entre ellos.
En cambio en la 3.16, se representa el mismo score de cromatografía de líquidos
por el detector de fluorescencia pero en función el tipo de crianza, y no se
aprecia conjuntos definidos, sino dispersos.
El estudio también se ha realizado con el resto de técnicas. (Ver anexo 1
Apartado 1.4. Estudio PCA)

- 41 -
Arantza León Sanz

Figura 3.16. Representación Scores de HPLC con FLD en función la denominación de

origen.

Figura 3.17. Representación Loadings de HPLC con FLD en función el tipo de crianza.

- 42 -