In: Recent Advances in Small Animal Reproduction, P. W. Concannon, G. England and J. Verstegen (Eds.

)
Publisher: International Veterinary Information Service (www.ivis.org), Ithaca, New York, USA.
Uso de kits comerciales para ensayos de hormona luteinizante y de progesterona en
el manejo reproductivo canino ( 24-May-2001 )
M. V. Root Kustritz
Department of Small Animal Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, University of Minnesota, St. Paul, MN,
USA.

Traducido por: Y. Corrada y C. Gobello, Instituto de Teriogenologa, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad
Nacional de La Plata, La Plata, Argentina, (12-Feb-2002).

Resumen
La determinación precisa del momento de la ovulación permite el óptimo manejo reproductivo en las perras. La correlación
entre los cambios físicos y de comportamiento durante el estro y el tiempo de ovulación es pobre. La determinación de la
concentración de la progesterona sérica es la técnica preferida para evaluar el día de ovulación en las perras en estro; se
describe el uso de los ensayos cualitativos y comerciales.

Endocrinología de la ovulación en las perras

El ciclo estral de las perras consiste de cuatro etapas: proestro, estro o celo, diestro, y anestro. En proestro, la concentración
de los estrógenos séricos está elevada. Los estrógenos aumentados causan cambios físicos evidentes característicos de celo en
las perras, incluyendo edema vulvar y exudación de una descarga serosanguinolenta a través de la vagina, y aumentada
cornificación del epitelio vaginal. La concentración sérica de estrógenos cae abruptamente en el proestro tardío, estimulando
un pico en la concentración de hormona luteinizante (LH) sérica y la subsecuente ovulación [1]. La concentración del pico de
LH en suero, de 7 a 50 ng/ml, dura 24 a 40 horas antes de retornar a niveles basales [1-3]. La ovulación ocurre 2.0 +/- 0.1
días después del pico de LH [4,5].
La concentración sérica de progesterona comienza a aumentar desde niveles basales coincidiendo con el descenso de la
concentración de los estrógenos séricos y el pico de LH, debido a luteinización preovulatoria de las células foliculares [1,6].
La concentración sérica de progesterona en el día del pico de LH, aproximadamente 2 días antes de la ovulación, es de 2.0 a
2.9 ng/ml [2,3,7]. La concentración sérica de progesterona en el día de la ovulación es de 4 a 10 ng/ml [1,7].
El descenso de la concentración sérica de estrógenos y el aumento en la concentración sérica de progesterona marca el
comienzo del comportamiento de estro, del celo, en las perras [1,3]. En promedio una perra puede ovular en cualquier
momento desde 2 días antes hasta 6 días después del comienzo del comportamiento de estro [3,8]. El estro se caracteriza
citológicamente por una cornificación completa de las células epiteliales vaginales donde más del 50% de estas células
aparentemente son anucleadas.
Seis días después de la ovulación (8.0 +/- 0.3 días después del pico de LH), la perra entra en diestro citológico, caracterizado
por un comportamiento de cesación del celo y citológicamente por un retorno abrupto al epitelio no-cornificado [9].

Momento de ovulación en las perras

Los métodos para determinar el momento de ovulación en las perras incluye la evaluación del comportamiento o cambios
físicos en la perra, cambios en el fluido vaginal, la evaluación citológica o vaginoscópica de los cambios en el epitelio
vaginal, y ensayos hormonales.
Comportamiento o cambios físicos en las perras - las perras pueden ovular en cualquier momento desde 2 días antes hasta 6
días después del comienzo del celo [3,8]. Es posible que las perras dominantes nunca exhiban celo, y las perras sumisas
pueden permitir las montas por el macho incluso cuando no están en estro. Los cambios físicos descritos en las perras
incluyen una disminuida turgidez vulvar al comienzo del estro, disminuido del ancho vulvar en el momento del pico de LH, y
un cambio en el color de la descarga vaginal de serosanguinolenta a color pajizo al comienzo del celo [10,11]. El
comportamiento y los cambios físicos en las perras durante el estro son variables, y pobremente correlacionadas con la
ovulación.
Cambios en el fluido vaginal - Se intentado medir la concentración de progesterona en el fluido vaginal. Aunque la
concentración de progesterona si se eleva en el fluido vaginal, coincidiendo con la elevación de la concentración de
progesterona sérica, la correlación es pobre [12,13]. Se ha reportado que el pH del fluido vaginal se encuentra disminuido al
comienzo del estro, lo mismo pasa con la resistencia eléctrica de las secreciones vaginales, y la concentración de glucosa en
el fluido vaginal se ha reportado que se incrementa al momento del comienzo del estro, pero la utilidad clínica de estos
cambios es limitada [11,13]. La arborización (helecho) del fluido vaginal cuando se le permite secarse al aire sobre un porta
objeto es máxima 2.3 +/- 1.2 días después del pico de LH en los perros; en un estudio, con servicios a tiempo fijo (10 y 12
días después del comienzo del estro) produjo una tasa de gestación de solamente el 78%, mientras que el servicio en el
momento de la máxima arborización del fluido vaginal produjo una tasa de gestación del 92% [14].
Citología vaginal y vaginoscopía - La cornificación vaginal aumenta gradualmente en el proestro. La cornificación completa
generalmente ocurre antes del pico de LH [15]. El estro, o el celo, se define citológicamente como la cornificación completa
con más del 50% de las células anucleadas. Hay una pobre correlación entre el comienzo del estro citológico y la ovulación.
El comienzo del diestro citológico, caracterizado por un abrupto retorno a la completa no-cornificación, ocurre 6 días después
de la ovulación, permitiendo una evaluación retrospectiva del día de la ovulación [9]. La vaginoscopía se puede usar para
diferenciar la mucosa vaginal edematosa, acolchonada, rosada de proestro de la mucosa vaginal deshidratada de bordes
cortantes y pálida de estro [11]. Otra vez, la correlación entre el comienzo del estro y la ovulación es variable.
Ensayo hormonal - el ensayo hormonal es la medición más exacta del momento de ovulación en las perras. Las dos hormonas
analizadas comúnmente para manejo de servicio son la LH y la progesterona. La hormona luteinizante es una hormona
proteíca que se puede medir con un ensayo cualitativo comercial (Status-LH, Synbiotics, San Diego CA). El kit se guarda a
temperatura ambiente y tiene un duración relativamente corta. El kit puede no ser exacto si es utilizado más allá de la fecha
de vencimiento, o si el paquete metalizado que contiene el dispositivo del kit y la pipeta se abre mucho tiempo antes de que la
prueba sea realizada. La muestra preferida es suero. La muestra no debe ser lipémica ni hemolizada. La prueba se debe
ejecutar el mismo día en que se colecta el suero. Si eso no es posible, el suero debe ser refrigerado, no congelado, hasta que la
prueba pueda ser ejecutada. (Fig. 1, Fig. 2 y Fig. 3).

Figura 1. Kit Status-LH para la medición de hormona luteinizante en suero canino (Synbiotics, San
Diego CA). - Para ver esta imagen en su tamaño completo, diríjase al sitio www.ivis.org . -

Figura 2. Componentes del kit Status-LH para la medición de hormona luteinizante en suero canino
(Synbiotics, San Diego CA). El paquete metalizado que contiene el dispositivo del kit y la pipeta no debe
ser abierto sino hasta momentos antes de ejecutar la prueba. - Para ver esta imagen en su tamaño
completo, diríjase al sitio www.ivis.org . -

Figura 3. Resultado final de la prueba para hormona luteinizante usando el kit Status-LH (Synbiotics,
San Diego CA). La línea rosada es el control, indicando que el test está terminado y fue ejecutado
correctamente. La ausencia de una línea rosada similar debajo del marcador control, al lado de la letra T
en el dispositivo del kit, es indicativa de una concentración de LH en la muestra de menos de 1 ng/ml. -
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El ensayo semi-cuantitativo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para determinar el pico de LH da un resultado de
bajo (menos de 1 ng/ml) o alto (mayor a 1 ng/ml). La prueba de ELISA ha mostrado dar resultados consistentes con un
radioinmunoanálisis preciso (RIA) [16]. Debido a que la duración del pico de LH promedia aproximadamente en un día en
las perras, las muestras se deben tomar diariamente, aproximadamente a la misma hora. El fabricante recomienda que la
determinación del pico de LH con esta prueba sea verificada por la medición de progesterona sérica, descrita abajo. Debido a
la vida corta del kit, la necesidad de pruebas diarias, y el requisito de evaluar progesterona para verificar la exactitud, la
autora raramente utiliza este ensayo en la práctica.
La determinación de la progesterona por ensayos cuantitativos, tales como RIA o quimioluminiscencia, permite la predicción
de la ovulación usando el esquema siguiente (Tabla 1). El tiempo para obtener los resultados del ensayo puede ser tan corto
como 24 horas en algunos laboratorios de diagnóstico veterinario.
 Tabla 1. Correlación de la concentración de progesterona sérica suero con eventos reproductivos significativos en
la perra. El margen de error se estimó ser aproximadamente +/- 1 día.

Progesterona Sérica (ng/ml) Eventos

Menos de 1.0 Anestro o proestro

1.0 - 1.9 Ovulación menos de 3 días - se recomienda rechequeo

2.0 - 2.9 Ovulación menos 2 días

3.0 - 3.9 Ovulación menos 1 día

4.0 - 10.0 Día de Ovulación

- Ovulación más 2 días es el día óptimo para servicio

Mayor de 10.0 con epitelio vaginal cornificado Ovulación más 1 a 5 días

La medición de progesterona por ensayos semi-cuantitativos de ELISA, también se pueden utilizar para estimar el momento
de ovulación en la perra. La ventaja primaria de los ensayos semi-cuantitativos de progesterona es su tiempo corto de
análisis; los resultados pueden estar disponibles tan rápidamente como 20 minutos después de que se toma la muestra de
sangre. Las desventajas principales son el incremento del trabajo y disminuida exactitud [17]. Como planear el tiempo de
muestreo y los intervalos, varía basado en si las muestras tienen que ser enviadas a un laboratorio para RIA comercial o si
son ensayadas por ELISA semi-cuantitativo en el laboratorio (Tabla 2).

Tabla 2. Esquema clínico para la predicción de la ovulación en la perra con ensayo de concentración de progesterona sérica
usando métodos cuantitativos y semicuantitativos.

Tipo de ensayo de progesterona

Manejo clínico para momento de ovulación
usado

Ensayo comercial La sangre debe tomarse para medición de la concentración de progesterona sérica en
(radioinmunoensayo [RIA] o principio cuando la perra tiene cerca de 70% de las células epiteliales vaginales cornificadas.
quimioluminiscencia) - Resultado Las muestras se toman y re-evalúan cada 3 - 4 días hasta que se alcanza la concentración en
cuantitativo el rango predecible (2 - 10 ng/ml; ver Tabla 1).

La sangre debe tomarse para medir la concentración de progesterona sérica comenzando

Ensayo inmunoabsorbente ligado a alrededor del cuarto día del comienzo del proestro. Las muestras se toman y evalúan
enzimas [ELISA] - Resultado Semi- diariamente hasta que se alcanza una alta concentración (mayor de 4 a 10 ng/ml). El primer
cuantitativo día que el ensayo detecta valores en el rango alto se considera como el día de ovulación (ver
Tabla 1).

Varios ensayos semi-cualitativos para medir progesterona en suero canino están disponibles comercialmente. Se describen
tres ensayos disponibles comercialmente.
El kit K9 Proges-Check es un ELISA semi-cuantitativo (Endocrine Technologies, Inc., Newark CA). El kit se guarda a
temperatura de refrigerador, y se pone a temperatura ambiente antes de usar. Tanto suero como plasma heparinizado se puede
utilizar para analizar muestras, pero las muestras no deben estar hemolizadas, lipémicas, o ictéricas. El suero se puede
refrigerar o congelar, en caso de necesidad, antes de ejecutar la prueba pero la muestra debe estar a temperatura ambiente
cuando se realiza la prueba. Los tres controles dan colores de azul marino, indicativo de 0 ng/ml de progesterona; azul claro,
indicativo de 2 ng/ml de progesterona; y azul más claro, indicativo de más de 10 ng/ml de progesterona. El color de las
muestras probadas se compara con el del control y se lee como 2 ng/ml o menos de progesterona si la intensidad está cerca o
igual al color azul marino del control, entre 2 y 10 ng/ml de progesterona, la intensidad es menor o igual que el control azul
claro, y más de 10 ng/ml de progesterona, la intensidad de la muestra es más clara que el control azul más claro. El fabricante
no hace ninguna recomendación con respecto a la al momento de apareamiento basándose en estas concentraciones variadas
(Fig. 4, Fig. 5 y Fig. 6).
 Figura 4. Kit K9 Proges-Check para medición de progesterona en suero canino (Endocrine Technologies,
Inc., Newark CA). - Para ver esta imagen en su tamaño completo, diríjase al sitio www.ivis.org . -

Figura 5. Componentes del kit K9 Proges-Check para medición de progesterona en suero canino
(Endocrine Technologies, Inc., Newark CA). El kit se ejecuta en pocillos transparentes con tres
controles. - Para ver esta imagen en su tamaño completo, diríjase al sitio www.ivis.org . -

Figura 6. Resultado final del test para progesterona en suero canino usando el kit K9 Proges-Check para
medición de progesterona en suero canino (Endocrine Technologies, Inc., Newark CA). El pocillo a la
izquierda (el azul oscuro) es equivalente con 0 ng/ml de progesterona, el segundo pocillo (azul claro) con
2 ng/ml, y el tercer pocillo (el azul más claro) con 10 ng/ml. La muestra desconocida, a la derecha, no
contiene progesterona. - Para ver esta imagen en su tamaño completo, diríjase al sitio www.ivis.org . -

La prueba PreMate es un kit de ELISA semi-cuantitativo (Camelot Farms, College Station TX). El kit se guarda a
temperatura del refrigerador, y se lleva a temperatura ambiente antes del uso. Uno de los componentes de la prueba se debe
congelar si el kit va a ser mantenido por más de tres meses, y también debe estar a temperatura ambiente antes de ejecutar la
prueba. Se pueden utilizar tanto suero como plasma heparinizado para analizar las muestras. Los dos controles dan colores de
rosa oscuro, al parecer indicativo de menos de 4 ng/ml de la progesterona ("antes de la ovulación", según el fabricante), y de
rosa claro al parecer indicativo de más de 4 ng/ml de progesterona ("día de ovulación o más tarde", según el fabricante). El
color de la muestra a analizar se compara con el de los controles y se lee como "antes de la ovulación" si el color es más
oscuro que la muestra rosa claro, y de "día de ovulación o más tarde" si el color es igual a o más claro que el control rosa
claro. El fabricante recomienda que las perras con muestras indicativas de "antes de ovulación" sean revisadas otra vez en dos
días, y que las perras con muestras indicativas de "día de ovulación o más tarde" sean apareadas inmediatamente (Fig. 7, Fig.
8 y Fig. 9).

Figura 7. Kit PreMate para medición de progesterona en suero canino (Camelot Farms, College Station,
TX). - Para ver esta imagen en su tamaño completo, diríjase al sitio www.ivis.org . -

Figura 8. Componentes del kit PreMate para medición de progesterona en suero canino (Camelot Farms,
College Station, TX). La prueba se ejecuta en pocillos transparentes con dos controles. - Para ver esta
imagen en su tamaño completo, diríjase al sitio www.ivis.org . -

Figura 9. Resultado final del test para progesterona en suero canino usando el kit PreMate PreMate para
medición de progesterona en suero canino (Camelot Farms, College Station, TX). El pocillo de la
izquierda (color rosa oscuro) es equivalente a menos de 4 ng/ml de progesterona, y el pocillo del centro
(rosa claro) a más de 4 ng/ml de progesterona. La muestra desconocida, a la derecha, no contiene progesterona. - Para ver
esta imagen en su tamaño completo, diríjase al sitio www.ivis.org . -

Status-Pro es un kit de ELISA semi-cuantitativo (Synbiotics, San Diego CA). El kit se guarda a la temperatura del
refrigerador, y se lleva a temperatura ambiente antes del uso. El suero es la muestra preferida para usarse con el kit; las
muestras no deben estar hemolizadas o lipémicas. El suero se puede refrigerar o congelar, en caso de necesidad, antes de
ejecutar la prueba pero debe estar a temperatura ambiente cuando se realice la prueba. La prueba se realiza en una taza
conteniendo tres pocillos de papel que aparecen como puntos dentro de la taza. La presencia de los tres puntos es indicativa
de menos de 2 ng/ml de progesterona, la presencia de dos puntos indica 2 a 7 ng/ml, y la presencia de un punto indica más de
7 ng/ml. Siempre debe haber por lo menos un punto presente; éste es el punto control que se utiliza para confirmar el
funcionamiento apropiado del kit. El fabricante recomienda que los apareamientos se realicen varias veces, cada dos o tres
días, comenzando cuando la concentración de progesterona sérica alcanza la etapa de los "dos puntos" (2 a 7 ng/ml de
progesterona); si se utiliza semen enfriado o congelado, el fabricante recomienda enfáticamente las pruebas simultáneas con
los kits de Status-LH y Status-Pro. El kit de Status-Pro está bajo revisión en el momento de esta escritura.

Momento de servicio
Las hembras ovulan ovocitos inmaduros que requiere cerca de dos días para madurar antes de que puedan ser fertilizados. El
día óptimo de apareamiento con servicio natural, inseminación artificial (IA) con semen fresco, o IA con semen enfriado es
de dos días después de la ovulación. Para la inseminación con espermatozoides congelados/descongelados, quienes han
disminuido su viabilidad y longevidad, el día óptimo de servicio es 3 a 4 días después de la ovulación para un sólo servicio.
La tasa de gestación se incrementa en todas las técnicas si la hembra es servida más de una vez en el periodo fértil [18].

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