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Palmas-TO
Julho de 2010
SHEYLLA SILVEIRA ARRUDA
Palmas-TO
Julho de 2010
Ao meu Deus, pela vida, pela saúde, pela sabedoria, pela
inteligência e pela força.
Aos meus pais Jéferson e Vanilda, que me ensinaram a andar
pelos caminhos corretos trilhados com muita humildade, competência
e honestidade, agradeço pelo apoio incondicional, pela confiança
depositada, pelo colo e incentivo nos momentos de tristeza, desânimo
e fadiga e, principalmente, pelo amor e carinho irrestritos de sempre.
À minha filha Shayenne, por seu mais puro amor e também por
saber pacientemente aguardar por uma atenção que nunca vinha.
Ao meu marido Fabrício, por compreender minha presença
sempre ausente, pelo carinho e apoio nos momentos difíceis e,
sobretudo, pelo enorme amor.
AGRADECIMENTOS
Apontada como a maior revolução científica na área forense desde a descoberta das
impressões digitais, a identificação humana por meio da análise do DNA tornou-se uma
poderosa ferramenta investigativa, auxiliando na elucidação de casos cíveis e criminais, sendo
embasada cientificamente na existência de polimorfismos genéticos ao longo do genoma em
indivíduos diferentes, que faz com que cada pessoa, à exceção dos gêmeos monozigóticos,
possua uma impressão genética única. Com a introdução da PCR nas investigações forenses,
tornou-se possível a análise de regiões polimórficas tanto no genoma nuclear quanto no
mitocondrial, a partir de quantidades ínfimas de DNA obtidas de amostras biológicas
altamente deterioradas. A união entre bioinformática e genética forense propiciou a criação de
softwares específicos, a exemplo do Banco de Dados Genético americano, o CODIS, que
recentemente também foi lançado no Brasil, os quais permitem um rápido confronto genético
entre os perfis de DNA da amostra questionada e da de referência. A automação das
metodologias também contribuiu para agilizar as análises genéticas e para a liberação de
laudos periciais mais fidedignos. A utilização de rígidos controles de qualidade, desde a coleta
da evidência até a entrega do laudo pericial, corretos cálculos estatísticos com o emprego das
frequências populacionais correspondentes à população estudada, interpretação minuciosa dos
dados obtidos na análise dos perfis genéticos, além da cadeia de custódia dentre outras várias,
são recomendações que, se devidamente seguidas, não impõem dúvidas a surpreendente
capacidade da perícia em DNA de apontar valores cujo percentual de acerto chega próximo
do absoluto.
Listed as the largest scientific revolution in the forensic field since the discovery of
fingerprints, the human identification through DNA analysis has become a powerful
investigative tool, assisting in the elucidation of civil and criminal cases, being scientifically
based on the existence of genetic polymorphism throughout the genome in different
individuals, that makes each person, with the exception of monozygotic twins, has a unique
genetic fingerprint. With the introduction of PCR in forensic investigations, became possible
to analyze of polymorphic regions of both the nuclear and the mitochondrial genome, from
tiny amounts of DNA obtained from highly degraded biological samples. The marriage
between bioinformatics and forensic genetics led to the creation of specific software, such as
the American Genetic Database, the CODIS, which was recently launched in Brazil, which
allow a quick comparison between the DNA profiles of the sample questioned and reference.
The automation of the methodology also helped to streamline genetic testing and the release
of expert reports more reliable. The use of strict quality controls, from the collection of
evidence to the delivery of expert report, correct statistical calculations with the use of
frequencies corresponding to the population studied population, detailed interpretation of the
data obtained in the analysis of genetic profiles, beyond the chain of custody among other
various, are recommendations that, if properly followed, impose no doubt the amazing
capacity of expertise in DNA point values whose percentage of success comes close to
absolute.
Keywords: human identification, DNA analysis, Test DNA, genetic polymorphisms, Genetic
Database, chain of custody, PCR, Forensic Genetics.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
1 INTRODUÇÃO 12
2 OBJETIVOS 17
2.1 OBJETIVO GERAL 17
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 17
3 JUSTIFICATIVA 18
4 MATERIAIS E MÉTODOS 18
5 REFERENCIAL TEÓRICO 19
5.1 O DNA como última alternativa na Identificação Humana 19
5.1.1 Métodos de Identificação Humana 19
5.2 Contexto histórico da utilização do Exame de DNA na elucidação de casos 20
judiciais
5.3 Inovações na área de Biologia Molecular aplicadas à Genética Forense 22
5.3.1 Marcadores Moleculares utilizados para determinar a Individualidade 22
Genética
5.3.2 Marcadores Moleculares de Linhagem 25
5.3.3 Determinação do sexo genético (Amelogenina) 28
5.3.4 Reação em Cadeia pela Taq DNA Polimerase (PCR) 29
5.3.5 Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT-PCR) 30
5.3.6 Eletroforese Capilar (EC) 31
5.4 Precauções na cena de um crime: Coleta e Extração de DNA em amostras 32
biológicas para Identificação Humana
5.5 Detecção do DNA – Obtenção do perfil genético 33
5.6 Interferentes na Análise de DNA 35
5.6.1 Quimerismo Genético 36
5.6.2 Gêmeos Monozigóticos 36
5.7 Aplicabilidade do Teste em DNA 37
5.7.1 A decisiva contribuição da genotipagem para a identificação de vítimas de 37
desastres em massa
5.7.2 Análise de mtDNA na Identificação Humana 40
5.7.3 Testes em DNA em Crimes de Estupro 42
5.7.4 Investigação de Paternidade ou Maternidade na esfera cível 42
5.8 Bancos de Dados Genéticos 44
5.8.1 CODIS – Exemplo a ser seguido 45
5.8.2 – Banco de Dados Genéticos no Brasil 46
5.9 O DNA no Banco dos Réus 48
5.9.1 Tipificação Criminal e o Teste em DNA como a chave-mestra para 48
Condenar ou inocentar
5.9.2 Cadeia de Custódia – Credibilidade ao Exame de DNA 50
5.10 Garantia de Qualidade em Genética Forense 51
5.11 Reflexões Jurídicas concernentes ao uso do DNA como prova criminal 53
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS 56
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 59
ANEXOS 65
12
1 INTRODUÇÃO
repetem umas seguidas das outras durante toda a região VNTR que possui um total de 500 a
1000 pb. Cada locus VNTR possui grande número de alelos diferentes (NUSSBAUM et al.,
2002).
As VNTR são estudadas com Sondas Multilocais (MLP) capazes de identificar
polimorfismos de múltiplos locus simultaneamente. O DNA é tratado com Enzimas de
Restrição (ER) e as bandas visualizadas em gel de eletroforese. Cada indivíduo possui um
padrão de bandas específico com tamanhos determinados pela (1) presença ou ausência do
sítio de restrição da ER utilizada ou (2) pelo número de repetições em tandem, o que torna a
região VNTR mais curta ou mais longa. Para que estes fragmentos possam ser notados,
devem ser hibridizados com suas sequências complementares (Southern Blotting),
evidenciando as bandas após autorradiografia. No entanto, por serem regiões mais longas,
ocorrem em menos locais dentro do genoma, sendo necessárias grandes quantidades de DNA
para permitir a aplicabilidade desta técnica.
Esta metodologia foi pela primeira vez empregada na tentativa de resolução de um
caso de imigração na Inglaterra. Logo em seguida, utilizada no Tribunal Britânico para
comprovar a participação de um suspeito em casos de crimes sexuais cometidos entre os anos
de 1983 e 1986. No entanto, o caso de maior repercussão internacional e constrangimento
norte-americano foi, indubitavelmente, a aplicação do método na acusação do ex-presidente
dos EUA de ter realmente mantido relações sexuais com a estagiária da Casa Branca, Mônica
Lewinsky. Uma mancha de sêmen encontrada no vestido de Mônica foi o material biológico
do qual se extraiu o perfil genético que foi vinculado ao de Clinton (GÓES, 2002). O estudo
das VNTR com MLP marcou a primeira fase da evolução das metodologias empregadas na
análise de DNA.
Em 1985, Kary Mullis descreveu a Reação em Cadeia pela enzima Taq DNA
Polimerase – PCR – que, anos depois, em 1993, lhe renderia o Prêmio Nobel em Química. O
advento da PCR na área forense tomou inestimável valor, visto que tal técnica, altamente
sensível e de alta especificidade, permite a amplificação de quantidades ínfimas de DNA, o
que faz parte do cenário com o qual se depara, na grande maioria das vezes, a perícia
genética, ou seja, presença de pouquíssimo material biológico questionado na cena do crime.
O advento da PCR permitiu implementações tecnológicas nas ciências forenses com a
implantação da técnica de Short Tandem Repeat (STR) como padrão-ouro nas perícias em
genética forense.
As STR, também conhecidos como Microssatélites, são sequências de nucleotídeos
com 2 a 7 pb que se repetem em tandem ao longo da região STR que tem, no máximo, 400 pb
15
de comprimento. Por serem menores, estes loci são mais abundantes ao longo do genoma e
são de enorme utilidade à genética forense, uma vez que regiões inteiras podem ser analisadas
a partir da amplificação por PCR em amostras escassas ou degradadas (KOCH E ANDRADE,
2008).
Preconizou-se pelo FBI (Federal Bureau of Investigation – Agência do Departamento
de Justiça dos EUA), a análise padrão de pelo menos 13 regiões STR, objetivando a formação
de um padrão de bandas para demonstração de vínculo genético. Depois, uma série de
cálculos estatísticos é utilizada para estimar o número de vezes em que este perfil genético
ocorre na população, para somente, então, haver a emissão do laudo pericial. A possibilidade
que duas pessoas venham a apresentar o mesmo padrão genético é de aproximadamente 1:6
bilhões (DOLINSKY E PEREIRA, 2007).
O aperfeiçoamento dos sequenciadores automáticos, devido a um interesse primordial
no Projeto Genoma Humano e ao desenvolvimento dos Sistemas Múltiplos para PCR (PCR
Multiplex) utilizando vários primers (iniciadores) em uma única reação, permitindo desta
maneira a amplificação de vários microssatélites simultaneamente, alavancaram o uso das
STR com PCR na segunda fase da evolução das metodologias em Genética Forense (PENA,
2006).
A análise de VNTR e STR em DNA nuclear somente é possível a partir de amostras
biológicas que contenham células nucleadas. Quando o material biológico não possui DNA
nuclear ou este está altamente deteriorado, antigo ou degradado, emerge a possibilidade da
análise das Regiões Hipervariáveis HVI e HVII presentes na Região Controle do DNA
mitocondrial (mtDNA). Esta análise permite traçar a linhagem matrilínea de um indivíduo e é
utilizada em casos onde não há material genético adequado ou suficiente para obter perfil
STR no DNA genômico nuclear ou quando o material apresenta alto grau de degradação,
como em ossos antigos, ou até mesmo fios de cabelo sem bulbo encontrados na cena do
crime. Identificação de corpos das vítimas de grandes catástrofes, de maternidade sem a
presença do pai e estudos históricos e evolutivos são alguns exemplos da utilização do estudo
do mtDNA . Este permanece imutável em uma linhagem matrilínea, visto que não há presença
de cromossomo homólogo para a realização de crossing-over.
As STR também podem ser analisadas dentro do Cromossomo Y (Y-DNA) a fim de
traçar uma linhagem patrilínea, somente em indivíduos do sexo masculino. Esta metodologia
pode ser aplicada na identificação de paternidade na ausência da mãe para filhos e elucidação
de estupro, onde há mistura de material genético, ou seja, DNA do agressor e da vítima.
16
A terceira fase na evolução dos métodos empregados em análises de DNA forense foi
marcada por uma intensa sofisticação nas metodologias até então utilizadas. Houve
modernização nos métodos de extração do DNA, sendo possível a evidenciação do material
genético mesmo em amostras cujo grau de deterioração era bastante elevado. Criou-se um
consenso internacional acerca das análises estatísticas dos resultados encontrados e
padronização das rotinas de coleta das evidências biológicas em cenas de crimes e,
principalmente, foi lançado o primeiro Banco de Dados (BD) de perfis genéticos do mundo,
elaborado pelo Reino Unido. Porém, segundo PENA (2006), o CODIS – Combined DNA
Index System – criado pelo FBI (EUA) é o mais importante e conhecido BD que serviu e serve
de modelo para muitos outros países, visto o número de ocorrências solucionadas,
ultrapassando as 112.000, provando sua enorme utilidade à esfera criminal.
O Brasil entra no cenário dos BD, a partir do presente ano, com a oficialização da
Rede Integrada de Bancos de Perfis Genéticos (RIBPG), poderosa ferramenta de segurança
pública que, com a concessão do CODIS, passa a armazenar perfis genéticos obtidos de
vestígios coletados em locais de crime (FIGUEIREDO, 2010).
Como técnicas mais recentes destacam-se os estudos de Marcadores Bialélicos SNP
(Polimorfismos de Nucleotídeo Único) e InDels (Inserção ou Deleção de Nucleotídeos) em
produtos de amplificação extremamente curtos (cerca de 50 pb ou até menores) oriundos de
DNA altamente degradado, como encontrado nos cadáveres em estado avançado de
decomposição ou carbonizados (KOCH E ANDRADE, 2008).
Diante das explanações concernentes à utilização do DNA como ferramenta
investigativa, convém destacar que as análises genéticas estão sendo cada vez mais aplicadas
para fins judiciais no Brasil e no mundo, possibilitando o rápido estabelecimento de vínculo
genético, acarretando desta forma uma economia de tempo e recursos bastante significativa ao
Poder Judiciário.
Em nosso país, vários laboratórios migraram rumo a este lucrativo campo laboratorial
da genética forense, área extremamente dependente de técnicas complexas, as quais exigem
dos especialistas constantes aperfeiçoamentos e treinamentos e, principalmente, uma
cautelosa postura frente à importância que estes exames em DNA possuem (FRANÇA, 2008).
Segundo FIGUEIREDO E PARADELA (2008), a não utilização dos controles de
qualidade de maneira efetiva pode levar à interpretação equivocada dos resultados obtidos,
impondo dúvidas à surpreendente capacidade da perícia em DNA de apontar valores cujo
percentual de acerto chega próximo ao absoluto, quando perfeitamente analisados e
interpretados.
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2 OBJETIVOS
3 JUSTIFICATIVA
4 MATERIAIS E MÉTODOS
5. REFERENCIAL TEÓRICO
O Exame de DNA tem sido utilizado com grande utilidade em casos de identificação
humana em que outras técnicas mostraram-se ineficazes, como nas grandes mutilações ou nos
carbonizados parcial ou quase totalmente ou ainda em exumações, adotando o uso de
microssatélites pela técnica de PCR, permitindo o estudo do DNA a partir de quantidades
ínfimas ou extremamente deterioradas de material obtido de ossos, dentes, bulbo capilar ou
outros tecidos remanescentes. Nos casos de criminalística, o Teste Genético veio contribuir
sobremaneira para a exclusão de suspeitos, rejeitando falsas imputações (FRANÇA, 2008).
Portanto, quando a identificação humana é impossível por meio do emprego de todas
as diversas técnicas existentes, recorre-se ao auxílio da análise do DNA como instrumento de
elevada sensibilidade e confiabilidade no desvendamento de casos cíveis e criminais, sendo
firmada como a mais importante ferramenta de investigação desenvolvida no século 20.
genético do primeiro agressor, constatando que ambos os perfis pertenciam à mesma pessoa
(ao mesmo agressor). As autoridades locais forjaram uma campanha de doação de sangue cuja
real finalidade era identificar o criminoso. Todos os habitantes foram doar sangue, mas
nenhum possuía DNA igual ao do estuprador. A polícia local deu prosseguimento às
investigações e descobriu que havia um viajante no condado que foi imediatamente
convocado a doar sangue também. Feito o Exame Genético com a adoção da metodologia do
estudo das VNTR com Sondas Multilocais (MLP), Jeffreys concluiu que o perfil genético do
viajante era o mesmo do estuprador (DOLINSKY E PEREIRA, 2007).
Na Flórida, também no ano de 1986, houve a prisão do até então suspeito de invadir
vinte residências e na sequência, cometer estupro de suas vítimas, possibilitada através da
técnica de identificação humana pela análise do perfil genético (BONACCORSO, 2004).
No caso Estado de Kansas x Mosley (1989) houve também a realização do Exame de
DNA embasado no material biológico coletado das vítimas de dois crimes de estupro,
propiciando a liberdade do indivíduo, mesmo após ter sido reconhecido pelas ofendidas
(ALVES, 2009).
Em O Estado de Maryland x Bloodsworth (1993), a análise do perfil genético excluiu
a acusação do estupro de uma menina de nove anos de idade, liberando o acusado que se
encontrava preso desde 1984 (BONACCORSO, 2004).
Noutro caso, Estado do Texas x Trimboli (1989), o acusado de triplo homicídio teve a
autoria confirmada após identificação genética (ALVES, 2009).
Em nosso país, desde o ano de 1992, a Polícia Civil do Distrito Federal (PCDF) já
tentava implementar o seu próprio Laboratório de análises de material genético como subsídio
à perícia criminal. Como ainda não havia sido implantado o laboratório específico, o caso
pioneiro da utilização do Exame de DNA na área processual penal, chegou aos nossos
tribunais em 1994, quando dois peritos criminais da PCDF foram enviados aos EUA a fim de
realizar o que seria a nossa primeira identificação humana embasada na análise de perfis
genéticos. O material biológico foi coletado em Brasília e referenciava-se a dois crimes
perpetrados na própria capital federal (ALVES, 2009).
No dia 8 de dezembro de 1994, a Câmara Legislativa do Distrito Federal aprovou a
Lei nº 803, criando a Divisão de Pesquisas de DNA Forense – DPDNA – órgão subordinado
ao Departamento de Polícia Técnica da PCDF, atribuindo a este órgão o encargo de realizar
Exames de DNA Forense (BARROS E PISCINO, 2007).
22
• Microssatélites (STR)
● Mini-microssatélite (mini-STR)
loci SNPs devem ser analisados para obter-se equivalência ao estudo de 15 loci de
microssatélites (LIMA, 2006).
Já foram identificados e mapeados mais de 10 milhões de SNPs no genoma humano e
várias publicações tem sugerido a substituição dos STRs por estes marcadores no BD de
perfis genéticos de criminosos (KOCH E ANDRADE, 2008).
que ocorra uma mutação. O mecanismo pelo qual a mitocôndria paterna é excluída do
embrião logo após a fertilização ainda não está bem esclarecido (DE ROBERTIS & DE
ROBERTIS, 2003).
O genoma mitocondrial é composto por 37 genes e já foi completamente sequenciado
por Anderson et al.(1981) que correspondeu a todos os genes mitocondriais suas respectivas
funções e produtos gênicos, incluindo 13 proteínas, 2 RNAr (RNA ribossômico) e 22 genes
RNAt (RNA transportador). Possui tamanho de 16.569 pb e constitui cerca de 1 a 2% do
DNA celular total, codificando aproximadamente 10% das proteínas constituintes da
mitocôndria e, por isso, para um bom funcionamento desta organela, faz-se necessária a boa
cooperação entre DNA nuclear e mtDNA (SANTOS, 2005).
Assim como o DNA nuclear, o mtDNA também contém regiões polimórficas que
permitem a individualização, estando localizadas dentro da Região Controladora do mtDNA
ou D-Loop, que mede 1100 pb e se subdivide em duas regiões maiores, chamadas de Região
Hipervariável I (HVI) e Hipervariável II (HVII) e uma região menor, denominada de Região
Hipervariável III (HVIII). Segundo SANTOS (2005), a hipervariabilidade do genoma
mitocondrial é devida a vários fatores:
- o mtDNA é muito sensível à ação dos radicais livres;
- ausência de histonas que exercem função protetora;
- a DNA polimerase mitocondrial possui atividade reparadora pobre quando comparada à
DNA polimerase nuclear; e
- a reparação do DNA, que dependente da excisão de nucleotídeos, não está presente nas
mitocôndrias.
Todos estes fatores fazem com que o mtDNA tenha uma taxa de evolução de 5 a 10
vezes maior que a do DNA nuclear. A alta taxa de substituição de bases possibilita que seja
observada uma ou mais diferenças na sequência nucleotídica das regiões hipervariáveis do
mtDNA quando indivíduos da linhagem matrilínea de uma mesma família são comparados,
ou seja, uma diferença de sequência não significa necessariamente que os indivíduos que
estão sendo comparados não estejam relacionados (KOCH E ANDRADE, 2008).
Outro fator que deve ser atentamente considerado quando da análise do mtDNA é a
ocorrência de heteroplasmia, ou seja, a presença em um mesmo indivíduo de mais de um
haplótipo de mtDNA. Tal fenômeno pode decorrer da mutação do genoma de uma ou mais
mitocôndrias gerando um mosaico (mutantes e normais). Esse processo pode ocorrer tanto em
célula somática quanto em células germinativas femininas e é mais frequente em indivíduos
com idade mais avançada. Quando a mesma heteroplasmia é encontrada na amostra
27
do gameta paterno apenas para a prole masculina, sendo que as características genéticas ali
contidas são passadas em bloco (haplótipos) para as gerações futuras, estabelecendo linhagens
patrilíneas que permanecem inalteradas até que aconteça uma mutação genética, um evento
muito raro (JOBIM et al., 2008).
Como o cromossomo Y possui regiões polimórficas que permitem a individualização,
a análise de STR através da PCR tem sido uma excelente técnica usada em identificação
humana para solucionar disputas de paternidade de filhos do sexo masculino, elucidação de
casos de estupro, onde há mistura de material biológico da vítima e do agressor e em estudos
históricos e evolutivos, por meio do traçado da linhagem patrilínea (KOCH E ANDRADE,
2008).
O Instituto Nacional de Padronização e Tecnologia (NIST – USA) desenvolveu um
Sistema Multiplex de Microssatélites (STR-Y) para genotipagem do Y-DNA que permite a
amplificação simultânea de 20 STR em uma única reação de PCR (KOCH E ANDRADE,
2008).
No final dos anos 80, Kary Mullis descreveu o processo de PCR e, por tal trabalho,
recebeu o Nobel de Química em 1993. Em 1989, a Koffman La Roche & Perkin-Elmer
Corporation patenteou este processo que revolucionou a Genética Molecular, permitindo a
amplificação de quantidades irrisórias de DNA, sendo atualmente uma das técnicas mais
comuns utilizadas em laboratórios de pesquisas biológicas para o sequenciamento de genes e
diagnóstico de doenças hereditárias, detecção de doenças infecciosas e criação de organismos
transgênicos e, em Genética Forense, para a identificação de perfis genéticos (MELGAÇO et
al., 2007).
Trata-se de uma técnica de elevadas sensibilidade e especificidade, exigindo a
conhecimento prévio acerca da sequência a ser amplificada, para que seja possível a
confecção do par de “primers” ou iniciadores que delimitarão a região-alvo de DNA,
permitindo a replicação de somente esta sequência. Os quatro desoxirribonucleosídeos
trifosfatados (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) são acrescidos à reação e acrescentados na nova
fita de DNA a partir dos primers por complementaridade de bases à fita molde (DNA-alvo)
pela ação da enzima Taq DNA Polimerase. Esta enzima termoestável é extraída da bactéria
extremófila Thermus aquaticus encontrada em fontes hidrotermais e suporta elevadas
temperaturas, possuindo uma semi-vida enzimática de 40 minutos a 94oC.
A PCR é processada em ciclos de desnaturação da dupla fita de DNA-molde
(sequência-alvo), anelamento dos primers e extensão da cadeia. Estes ciclos possuem duração
e temperatura previamente reguladas no equipamento na qual a PCR é realizada – o
Termociclador.
Após a amplificação exponencial do fragmento inicial, a técnica procede com a
visualização deste após eletroforese. Os sequenciadores automáticos de DNA analisam os
fragmentos de DNA previamente amplificados, cujos dNTPs incorporados durante a PCR
foram marcados individualmente com compostos fluorescentes de diferentes cores antes do
início da reação. O produto da PCR é submetido à eletroforese capilar (KOCH E ANDRADE,
2008).
30
- Nested PCR: utilizada para aumentar a quantidade de produto amplificado final ou para
aumentar a sensibilidade da técnica, pois utiliza dois pares de primers (um par externo para a
primeira reação e outro par para o produto desta primeira reação).
- Hot Start: a reação de PCR é ativada somente quando a temperatura atinge 94ºC. Este
procedimento eleva a especificidade da PCR, pois a DNA Polimerase contém um anticorpo
que se desnatura e ativa a enzima ao atingir a temperatura de 94ºC.
Outro detalhe que pode acarretar questionamentos nos resultados de uma análise
forense de DNA é a possibilidade de ocorrer degradação do material genético dentro do
laboratório ou na própria cena do crime. O material biológico recuperado pode sofrer
alterações biológicas por ação enzimática bacteriana ou fúngica, ambiental em decorrência de
temperaturas que excedam 100ºC e presença de reativos químicos que podem ocasionar
quebras ou alterações na cadeia nucleotídica, impossibilitando a análise (KOCH E
ANDRADE, 2008).
A aplicação da metodologia de coleta é específica para cada tipo de material biológico
e dependerá do estado e condição da amostra questionada, existindo padrões pré-estabelecidos
pelas práticas forenses.
Atualmente existem à disposição no mercado, tubos coletores para sangue e cartões
específicos para coleta e armazenamento de amostras biológicas à temperatura ambiente,
propiciando alta qualidade para extração de DNA aliada à facilidade no momento da coleta e
para transporte e armazenamento das evidências (CHEMELLO, 2007).
No laboratório forense, a evidência biológica deve ser criteriosa e minuciosamente
inspecionada para que se possa estabelecer a metodologia mais apropriada para se realizar a
extração e amplificação do material genético, objetivando a manutenção da integridade,
quantidade e qualidade do mesmo, sendo que os métodos mais utilizados na rotina
laboratorial forense atualmente são o Chelex e as Colunas de sílica (DANTAS, 2010).
Um caso muito especial e delicado é concernente às amostras de sêmen e secreção
vaginal encontrados em crimes sexuais. Como há mistura de material genético de dois ou
mais indivíduos do mesmo sexo ou não, procede-se geralmente com a Extração Diferencial de
DNA masculino e feminino. Para identificação do sexo genético do indivíduo que deixou o
vestígio biológico na cena do crime, faz-se a análise do locus da Amelogenina (PENA, 2006).
(1) os alelos da criança com um dos alelos presentes na mãe (alelo materno obrigatório)
(2) os alelos da criança com um dos alelos presentes no suposto pai (alelo paterno
obrigatório), para se constatar a paternidade (Anexo B).
A ciência já diagnosticou alguns casos raros em que uma única pessoa nasce com dois
perfis genéticos diferentes. Esse fenômeno é denominado Quimerismo Genético e ocorre
quando gêmeos dizigóticos se fundem no útero e formam um único embrião a partir da fusão
de dois óvulos e dois espermatozóides, originando um indivíduo com dois tipos de conjunto
de células diferentes. O quimerismo causa dificuldades na solução de crimes e testes de
paternidade, já que o sangue do suspeito pode apresentar DNA diferente da amostra de
referência ou questionada (DOLINSKY E PEREIRA, 2007).
Quando gêmeos univitelinos são suspeitos de um crime que deixou vestígios, o Teste
em DNA não auxilia na elucidação do delito, uma vez que não se consegue distingui-los, pois
são geneticamente idênticos. Neste caso, a datiloscopia forense seria imensamente útil, se na
cena do crime houvesse impressões digitais desse suspeito (KOCH E ANDRADE, 2008).
No entanto, Carl Bruder (2008) renomeado pesquisador da Universidade do Alabama
(Birminghan), desenvolveu uma pesquisa com dezenove gêmeos monozigóticos, constatando
que em alguns casos, o DNA de um gêmeo era diferente do de seu irmão em vários pontos ao
longo do genoma. Nesses locais de divergência genética havia um número diferente de cópias
do mesmo gene entre os gêmeos, originando um estado genético denominado de Variantes do
37
Número de Cópias – CNV. Normalmente há duas cópias de cada gene, uma proveniente do
pai e a outra, da mãe. Mas há algumas regiões genômicas que fogem a esta regra, culminando
no aparecimento das CNV. Tais regiões podem carregar de 0-14 cópias de um mesmo gene.
Há vários outros trabalhos publicados acerca destas possíveis diferenças genéticas
entre gêmeos monozigóticos. Porém, não há ainda nada evidenciado em genética forense,
visto que as metodologias usualmente utilizadas e validadas não conseguem ainda estabelecer
essas mínimas diferenças.
biológicos da vítima que tenham os mesmos pais, podem ser coletadas. Para sequenciamento
do mtDNA, utiliza-se material biológico de membros da família materna como referência e,
para marcadores do cromossomo Y, amostras dos familiares paternos (DANTAS, 2010)
No intuito de agilizar o processo de identificação humana, (1) o acesso às amostras
diretas da vítima, ou seja, itens de uso pessoal, como: escovas de dentes e de cabelo,
barbeadores, roupas íntimas não lavadas ou qualquer outro objeto pessoal usado pela vítima;
assume grande importância, principalmente na ausência ou demora na localização de parentes
consanguíneos. Sangue doado, amostras teciduais ou esfregaços para exames patológicos
realizados ainda em vida pelo indivíduo vitimado também contribuem bastante (BENFICA E
VAZ, 2005).
Deve-se criar e manter a cadeia de custódia de todo o processo desde a fase inicial,
com registro e fotografias dos corpos ou fragmentos corpóreos, coleta das amostras biológicas
da vítima e as de referência, até as fases subsequentes de transporte, armazenamento e análise
do DNA, objetivando a documentação comprovada de todo este processo, garantindo a
rastreabilidade deste e a confiabilidade nos resultados obtidos (ALONSO et al.,2005)
Em 11 de setembro de 2001, o mundo parou frente a uma das maiores atrocidades
presenciadas nos últimos tempos: o atentado terrorista ao World Trade Center, símbolo
internacional do poderio econômico norte-americano. Devido a enorme força de queda das
Torres Gêmeas, somada aos incêndios de longa duração e a consequente exposição à água que
durou semanas depois; evidenciou a necessidade de serem melhorados os procedimentos de
extração de DNA nos materiais biológicos lá encontrados. Novos conjuntos STR Multiplex,
com melhor desempenho, foram desenvolvidos visando à identificação precisa de milhares de
vítimas (BILLE et al, 2004).
Em agosto de 2004 ocorreu um incêndio no Supermercado Ycuá Bolanos em
Assunção, no Paraguai. No momento da tragédia, dentre funcionários e clientes, estavam
presentes cerca de mil pessoas, das quais mais de quatrocentas vieram a óbito. Muitos destes
corpos foram identificados por meio de métodos antropométricos, odontologia e radiologia
forenses e datiloscopia. No entanto, vários cadáveres apresentavam um grau de carbonização
tão elevado que somente foi possível identificá-los por meio da análise associada de conjuntos
de STRs e SNPs (MATTE et al., 2005).
A catástrofe do Tsunami na Ásia do Sul atingiu doze países diferentes e vitimou cerca
de 200.000 pessoas, sendo uma das maiores tragédias presenciadas pelo mundo
contemporâneo, havendo também a necessidade da união entre diversos laboratórios
especializados no intento da identificação humana deste assombroso número de vítimas. Os
40
esforços maciços necessários para identificar os corpos se tornaram o mais intenso processo
de investigação forense da história. Muitos países ofereceram, além de recursos financeiros,
recursos técnicos para genotipar o DNA das vítimas. No entanto, esse objetivo acabou se
tornando inatingível e não há dados fidedignos acerca dos milhares de corpos que
permaneceram sem identificação (ALONSO et al., 2005).
Em se tratando de desastres em massa, o número de amostras biológicas a serem
coletadas e analisadas é muito grande, fazendo-se necessária a integração entre vários
laboratórios forenses para que estes trabalhem em equipe usando técnicas padronizadas, kits
validados, um número suficiente de marcadores genéticos, que possibilitem uma comparação
satisfatória entre os perfis gerados e, principalmente, um poderoso software que permita a
troca segura e rápida de informações entre estes laboratórios, possibilitando um confronto
genético adequado e a opção de utilizar diferentes frequências alélicas conforme a população
em estudo, agilizando a liberação dos corpos envolvidos (MATTE et al, 2005).
“O exame genético pelo DNA tornou obsoleto todos os demais sistemas existentes.
É o auxílio científico para a solução de um dos mais graves e subjetivos dramas do
judiciário, a investigação de paternidade. Antes eram a apreciação subjetiva da prova
testemunhal, os arcaicos exames de sangue; hoje, a certeza objetiva, científica”.
TJ/SP, Ac. Unân. 7.ª Câm. Cív., no.º 206.305-1/8, rel. Des. GODOFREDO
MAURO, j. 18.05.94, in repertório IOB 3/9852.
43
Para atender esta finalidade, o exame genético pode ser realizado por duos ou trios. O
duo é o exame feito com somente com duas amostras: a do suposto pai e a do filho ou filha,
ou a da suposta mãe e a do filho ou filha; já o trio é o exame realizado com três amostras: a da
mãe, a do filho ou filha e a do suposto pai. Convém destacar que nos casos em que qualquer
um dos envolvidos for submetido à transfusão de sangue recente, o ideal é aguardar no
mínimo seis meses para realizar o teste e, nos casos de transplante de medula óssea, o material
biológico mais adequado a ser coletado é a mucosa oral (Laboratório Hermes Pardini, 2010).
Casos envolvendo trocas de bebês resolvem-se fácil e rapidamente por meio da correta
identificação da paternidade e maternidade biológica das crianças e, assim, põe um ponto final
no sofrimento de famílias que se encontram neste dilema.
Nos Estados Unidos são registrados, em média, 300.000 crimes sexuais por ano.
Aproximadamente 234.000 criminosos condenados por tais crimes estão sob o controle de
agências correcionais e destes, 60 % estão soltos sob regime de supervisão condicional. Além
disto, indivíduos presos por este tipo de violação da lei retornam ao convívio da sociedade em
cerca de cinco anos. Desta maneira, os Estados Unidos convivem há muito tempo com um
crescente número de crimes violentos (LOFTUS, 1999).
Frente a esta situação e após reconhecer e demonstrar que a genotipagem poderia
apoiar a identificação humana no cenário forense, o FBI desenvolveu um programa global de
DNA, objetivando principalmente facilitar a investigação de crimes violentos (LOFTUS,
1999).
Utilizando tecnologia de última geração, o FBI criou e opera o BD nacional americano
de perfis genéticos – CODIS (Combined DNA Index System – Sistema de Combinação e
Indexação de DNA) – que une informática avançada à ciência forense, facilitando
sobremaneira a comparação de perfis de DNA. Trata-se de uma rede totalmente interligada
entre as polícias a nível local, estadual e federal (sendo que cada nível possui seu BD próprio)
e os laboratórios forenses, permitindo a troca e a comparação de perfis genéticos via
46
evidências, sobre a necessidade de se guardar sempre uma quantia da amostra para segunda
prova, incluindo a preocupação com o controle efetivo dos procedimentos analíticos, a
calibração de equipamentos e instrumentos, a inserção de ações corretivas, a obrigatoriedade
de auditorias anuais e do programa de saúde ambiental e segurança no trabalho (ALVES,
2009).
A Sociedade Latino-Americana de Genética Forense (SLAGF) possui também um
excelente programa para colaborar com a melhora da qualidade dos resultados obtidos pelos
laboratórios a ele cadastrados. O conceito básico do programa é a distribuição anual e gratuita
a todos os laboratórios conveniados de um caso fictício de paternidade e outro criminal e um
caso teórico para o cálculo do índice correspondente. Cada laboratório participante se cadastra
com um número, mantendo o anonimato, e recebe três amostras de sangue, cada qual
contendo 100µl em um cartão de papel filtro, numeradas de um a três. Cabe ao laboratório a
escolha de pelo menos uma das três opções oferecidas: 1)somente tipificar as amostras;
2)tipificar e determinar se entre as amostras existe alguma relação de parentesco; ou 3)as
opções 1 e 2 acrescidas da realização de uma série de cálculos estatísticos. Os resultados são
avaliados por todos os laboratórios e serve de base para discussões que visam à melhora da
qualidade das análises de DNA. Além deste controle de qualidade, o SLAGF ainda capacita
os participantes por meio de cursos e jornadas com palestras dadas por cientistas forenses
renomeados internacionalmente (PENACINO et al, 2006).
Para garantir a qualidade dos resultados dos exames de DNA em território nacional, o
Ministério da Justiça já investiu inicialmente cerca de 2 milhões de reais para compra de
equipamentos e treinamentos, numa parceria com o Instituto Nacional de Metrologia,
Normalização e Qualidade Industrial, o INMETRO, para a criação de um selo de qualidade
para os laboratórios da perícia criminal. O INMETRO avaliará a coleta das amostras e os
reagentes e equipamentos utilizados na rotina laboratorial, sendo este selo de suma
importância para que as conclusões da perícia brasileira sejam reconhecidas em outros países.
Este programa de metrologia forense é inédito no Brasil e já é tendência no exterior. Todos os
laboratórios certificados pela American Society of Crime Laboratory Accreditation Board, o
mais importante órgão de acreditação de laboratórios forenses, devem ter o ISO 17025 que
agora chegará ao nosso país. A participação será voluntária, por adesão (PNUD, 2009).
É necessário destacar aqui a importância dos laboratórios que prestam serviços à área
da perícia forense em se submeterem a avaliações constantes para assegurar que estejam
trabalhando com um controle de qualidade aceitável, uma vez que está em jogo a liberdade de
um inocente e a condenação sentencial do autor do crime (DOLYNSKY E PEREIRA, 2007).
53
responsáveis por sua custódia de estupro carcerário e gravidez não consentida. No entanto, a
reclamante havia determinado manifestação expressa contrária à coleta de qualquer material a
ser recolhido no momento de seu parto, que aconteceu em hospital público, sob a autorização
do Supremo Tribunal de Justiça. Foi quando o STF, em uma decisão única, expediu
autorização para a coleta da placenta da cantora a fim de realizar o exame de DNA.
Analisando os valores constitucionais neste caso, destaca-se de um lado, o direito à intimidade
e à vida privada da cantora mexicana, e de outro, o direito à honra e à imagem dos servidores
da PF como instituição pública e respeitada, atingidos pela situação constrangedora divulgada
com veemência pela mídia, o STF concluiu por afirmar a prevalência do esclarecimento da
verdade, levando em conta que o exame de DNA aconteceria sem invasão da integridade
física da requerente ou de seu filho. No final, após esta inédita decisão em nosso país, o
exame de DNA foi realizado, comprovando a inocência dos policiais federais
(MALAGHUINI, 2006).
No caso da investigação de maternidade de Roberta Jamily Martins Borges,
reconhecida como filha por Vilma Martins Costa, acusada de ter sequestrado o menino
Pedrinho em um hospital da capital goiana, também houve o auxílio da tipagem genética.
Após mais de dez anos da notificação do desaparecimento do bebê, a polícia comprovou ser
Vilma a sequestradora do garoto. Após ter sido desvendado este crime, a polícia voltou sua
atenção para a jovem Roberta, que também se encontrava registrada como sendo filha da
sequestradora, sendo que esta havia feito operação de esterilização antes do nascimento de
Roberta. Foi pedido então o exame de DNA para investigação de maternidade. No entanto, a
jovem, diferente do que ocorreu com Pedrinho, negou-se a fornecer material para a realização
do exame de DNA. Todos os envolvidos foram convocados a depor e, sendo Roberta fumante,
deixou o toco do seu cigarro no cinzeiro do Distrito Policial durante sua espera para depor.
Diante disso, o delegado recolheu o resto do cigarro de Roberta, o qual continha sua saliva, e
o encaminhou à perícia para fazer o exame de DNA. O resultado do exame confirmou que
Roberta não era filha de Vilma, a mulher que a criou, mas, sim, de Francisca. Solucionou-se a
questão sobre a verdadeira maternidade, mas o exame de DNA, obtido sem o consentimento
de Roberta, tornou-se polêmico. Alguns especialistas defenderam que houve violação do
direito à intimidade de Roberta e que a prova não poderia ser aceita no processo. Outros
argumentaram que o resto de cigarro fumado por Roberta, uma vez descartado, transformou-
se em lixo, não fazendo mais parte do seu corpo. No desfecho deste caso, o exame de DNA
foi considerado prova nos autos e Vilma foi condenada pelos sequestros de Pedrinho e de
Roberta (PARADELA E FIGUEIREDO, 2008).
55
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Desde o primeiro caso criminal elucidado com o auxílio do Exame de DNA, em 1986,
conhecido pelas cortes internacionais como Caso Leicester, onde o geneticista Alec Jeffreys
utilizou a análise de VNTR com sondas multilocais (MLP) por Southern Blotting para provar
a autoria de dois crimes sexuais, a Genética Forense evoluiu sobremaneira acompanhando os
avanços da ciência contemporânea.
A análise do DNA, indubitavelmente constitui meio de prova eficaz para o
descobrimento da verdade nas investigações forenses, quer seja para auxiliar na elucidação de
casos cíveis, com ênfase à investigação de paternidade e maternidade, ou para a produção de
provas em processos penais, sendo um dos meios mais seguros para desvendar crimes que
aparentemente não deixam vestígios, estando desta maneira, apta a confirmar ou excluir a
autoria de crimes diversos, rejeitando falsas imputações. O Teste em DNA ainda propicia o
estabelecimento de vínculo genético aplicado à identificação humana de vítimas de acidentes
em massa com incomparável grau de confiabilidade. Assim, o Exame Genético desponta
como a mais importante ferramenta investigativa desenvolvida no século XX.
Toda atividade humana está propensa a falhas. No decorrer de todo o processo de
Identificação Humana há potenciais fontes de erro, desde a coleta da evidência, passando pelo
transporte, armazenamento, análise, interpretação dos dados obtidos com o cálculo correto das
frequências populacionais dos marcadores genéticos envolvidos e até mesmo alguma falha
concernente a uma má elaborada Cadeia de Custódia. Qualquer contaminação exógena, quer
seja na cena do crime ou no manuseio das amostras biológicas dentro do laboratório, pode
originar profundas alterações no DNA estudado. Por isso é necessário que o laboratório
especializado siga as recomendações da SENASP/MJ e também se cadastre em um programa
de controle de qualidade, bem como busque a Acreditação. Existem entidades acreditadoras
nacionais (INMETRO, PNCQ, ONA) e também internacionais (CAP – College of American
Pathologists, AABB – American Association of Blood Banks e ASCLAD – American Society
of Crime Lab Directors), sendo que ambas para emitirem o Selo de Acreditação fazem
vistorias regulares ao laboratório, exigindo que este siga fielmente as recomendações
constantes na Norma ABNT NBR ISO/IEC 17025:2005. É importante que o laboratório
direcionado para a genética forense passe por inspeções frequentes para garantir a qualidade
dos serviços prestados. Aqui é conveniente destacar que um dos objetivos da análise pericial
57
como uma forma de resposta à inquietude da comunidade perante a um sistema legal tão
arcaico e, na grande maioria das vezes, injusto.
59
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ANEXOS
ANEXO A. Tabela com alguns dos Microssatélites mais utilizados atualmente na tipagem do
DNA
D16S539 CODIS
TPOX CODIS
Vwa CODIS
D18S51 CODIS
D19S433 NÃO-CODIS
FGA CODIS
D5S818 CODIS
PENTA D NÃO-CODIS
PENTA E NÃO-CODIS
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AMOSTRA
Criança Suposto Pai
MARCADOR Mãe
D8S1179 13 16 11 13 11 14
D21S11 28 29 29 29 29 30
D7S820 11 11 10 11 8 10
CSF1PO 10 14 7 10 7 9
D3S1358 14 18 14 16 16 17
TH01 8 9 7 8 7 7
D13S317 9 11 10 11 10 12
D16S539 11 11 10 11 10 13
D2S1338 19 23 16 23 16 25
D19S433 14 14 11 14 11 13
vWA 16 16 16 17 17 18
TPOX 9 11 6 9 6 12
D18S51 14 21 14 16 16 19
D5S818 12 12 12 13 11 13
FGA 21 24 21 24 23 24
Amelogenina X X X X X Y
1) Objetivos
a) Assegurar a qualidade, integridade e segurança em exames periciais envolvendo a
utilização de DNA;
b) Estabelecer os procedimentos para condução da perícia criminal, análise e
apresentação de resultados para a investigação criminal;
c) Estabelecer os requisitos para os laboratórios de genética forense, bem como a
qualificação dos peritos que neles realizarão as perícias baseadas em DNA.
2) Coleta e Custódia de Amostras e Instalações Ambientais
a) Coleta
i) Os procedimentos de coleta e as análises iniciais deverão ser padronizados, através
de manuais de coleta;
ii) Em casos de crimes sexuais, deve-se coletar pelo menos dois suabes de algodão
(haste plástica) de cada cavidade (vaginal, anal e /ou bucal). É aconselhável que
cada Estado formalize, em dispositivo legal, os aspectos técnicos relacionados à
coleta, preservação e custódia de amostras para exames de DNA.
iii) Todos os laboratórios devem ter um termo de consentimento informado,
dispondo sobre os objetivos da coleta de material biológico de pessoas vivas, de
acordo com modelo a ser definido posteriormente;
iv) Os manuais de coleta devem conter especificações sobre a embalagem, o
transporte e armazenamento de amostras biológicas;
v) Todas as pessoas que participarem da custódia de amostras para exames de DNA,
desde a coleta até a realização do exame, devem ser preparadas tecnicamente em
procedimentos de coleta, acondicionamento, transporte e conservação de amostras
biológicas. A preparação ou treinamento específico deverá estar inserido dentro dos
cursos de formação a serem ministrados pelos laboratórios que integram a Rede
Nacional de Genética Forense (ver item 6).
b) Custódia
i) Os materiais e resultados obtidos a partir de amostras de evidências criminais
devem ser organizados e armazenados adequadamente, pelo menos, até o fim do
processo (julgamento);
ii) A amostra bruta ou fração útil da mesma, e/ou DNA extraído, devem ser
preservados para contraprova. As amostras devem ser armazenadas adequadamente
com o objetivo de evitar a degradação;
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iii) A armazenagem das amostras deve ser definida com a ajuda da SENASP, através
de consulta ao poder judiciário, tendo em vista a falta de normas, tanto em nível
federal quanto estadual, sobre o prazo mínimo de armazenagem;
iv) A cadeia de custódia deve ser o mais curta possível, a fim de evitar a
possibilidade de troca de amostras ou de degradação do material;
v) Preferencialmente, o perito que coleta as amostras não deve ser o mesmo que
realiza os exames de DNA;
vi) Os laboratórios devem manter um sistema documentado de controle de vestígios,
evidências e/ou amostras, que assegure sua integridade;
vii) Recomenda-se que os técnicos e/ou peritos que trabalhem em exames de DNA
forense disponibilizem uma alíquota do seu próprio material genético para
genotipagem e sequencimento de DNA mitocondrial, quando este for de uso no
âmbito do laboratório.
c) Instalações Ambientais
i) O desenho e instalações dos laboratórios devem respeitar as normas de segurança
e minimizar os riscos de contaminação;
ii) O acesso e uso das áreas de análises devem ser controlados de modo apropriado
aos fins a que estão destinados;
iii) Recomenda-se que os laboratórios disponham de áreas de trabalho separadas,
com área para manejo de evidências e armazenamento de materiais, área de
extração, área para PCR, área de extração de amostras mínimas e área para Pós-
PCR. Como área mínima, os laboratórios devem conter: área de extração de DNA,
área de “pré-PCR” e área de “pós-PCR” (BONACCORSO, 2004)