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ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS E
BACTERIOLÓGICAS DA ÁGUA
SÃO LUÍS - MA
2005
PROGRAMA DE CONTROLE DE QUALIDADE DE ALIMENTOS E ÁGUA
PAVILHÃO TECNOLÓGICO - UFMA
LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
Profa. Dra. Adenilde Ribeiro Nascimento
adenild@bol.com.br
LABORATÓRIO DE BROMATOLOGIA
Prof. Dr. Victor Elias Mouchrek Filho
victo@ufma.br
PARTE A: ................................................................................................................................................4
ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DA ÁGUA ................................................................................................5
1 GENERALIDADES ..................................................................................................................................5
2 IMPORTÂNCIA DA ANÁLISE DE ÁGUA ................................................................................................10
3 PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS ....................................................................................................11
3.1 TEMPERATURA ................................................................................................................................11
3.2 COR ..................................................................................................................................................11
3.3 ODOR E SABOR.................................................................................................................................12
3.4 TURBIDEZ ........................................................................................................................................13
3.5 CONDUTIVIDADE ELÉTRICA ...........................................................................................................14
3.6 DUREZA............................................................................................................................................15
3.7 ALCALINIDADE ................................................................................................................................16
3.8 PH.....................................................................................................................................................16
3.9 CLORO RESIDUAL LIVRE.................................................................................................................17
3.10 CLORETO .......................................................................................................................................17
4 AMOSTRAGEM ....................................................................................................................................18
4.1 QUANTIDADE DE AMOSTRA ............................................................................................................18
4.2 TOMADA DA AMOSTRA....................................................................................................................18
5 LEGISLAÇÃO .......................................................................................................................................19
6 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS ..............................................................................................................19
6.1 DETERMINAÇÃO DA ALCALINIDADE – T.A., T.A.T.......................................................................19
6.2 DETERMINAÇÃO DE CA2+ ................................................................................................................22
6.3 DETERMINAÇÃO DE MG2+ ...............................................................................................................23
6.4 DUREZA TOTAL ...............................................................................................................................23
6.5 DETERMINAÇÃO DE CLORETOS......................................................................................................24
6.6 DETERMINAÇÃO DE PH...................................................................................................................25
6.7 DETERMINAÇÃO DA CONDUTIVIDADE ELÉTRICA .........................................................................25
6.8 DETERMINAÇÃO DA COR ................................................................................................................26
6.9 DETERMINAÇÃO DA TURBIDEZ ......................................................................................................26
6.10 DETERMINAÇÃO DE CLORO RESIDUAL ........................................................................................26
PARTE B ................................................................................................................................................27
ANÁLISE BACTERIOLÓGICA DE ÁGUAS...............................................................................................28
1. CONSIDERAÇÕES INICIAIS ................................................................................................................28
2 ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS ...........................................................................................................30
2.1 COLIMETRIA (POTABILIDADE).......................................................................................................30
2.1.1 BACTÉRIAS DO GRUPO COLIFORME ...............................................................................................30
2.1.2 COLETAS DE AMOSTRAS PARA ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS DA ÁGUA .......................................30
2.1.3 PROCEDIMENTO DE COLETA ..........................................................................................................31
2.1.4 TÉCNICAS DE COLETA DE AMOSTRA ..............................................................................................32
2.1.5 TÉCNICA DOS TUBOS MÚLTIPLOS (NMP/100ML).........................................................................35
2.1.5.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS ...........................................................................................................35
2.1.5.2 MATERIAL ..................................................................................................................................35
2.1.5.3 METODOLOGIA ...........................................................................................................................37
2.1.6 MÉTODO PARA DETECÇÃO DE COLIFORMES TOTAIS E ESCHERICHIA COLI USANDO MEIOS COM
ONPG E MUG............................................................................................................................................41
1 GENERALIDADES
Todos sabem que o Planeta Terra é formado por muita água, mas...
Geleiras - 1,979%
Oceanos - 97,50%
A água é um poderoso solvente, sendo assim ela dissolve algumas porções de quase
tudo com o que entra em contato.
A água subterrânea também é contaminada por todos estes poluentes que se infiltram
no solo, atingindo os mananciais que abastecem os poços de água de diversos tipos.
A água da chuva é contaminada pela poluição que se encontra no ar, podendo estar
contaminada com partículas de arsênio, chumbo, outros poluentes e inclusive ser uma chuva
ácida.
Produtos derivados de petróleo que vazam e são arrastados pela água da chuva.
Chuva ácida.
A água para ser consumida pelo homem não pode conter substâncias dissolvidas em
níveis tóxicos e nem transportar em suspensão microrganismos patogênicos que provocam
doenças.
3 PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS
3.1 TEMPERATURA
3.2 COR
A medida da cor de uma água é feita pela comparação com soluções conhecidas de
platina-cobalto ou com discos de vidro corados calibrados com a solução de platina-cobalto.
Uma unidade de cor corresponde àquela produzida por 1mg/L de platina, na forma
de íon cloroplatinado – Unidade Hanzen (mg Pt Co/L).
Especial cuidado deve ser tomado na anotação do pH em que foi realizada a medida,
pois sua intensidade aumenta com o pH.
Para águas relativamente límpidas a determinação pode ser feita sem a preocupação
com a turbidez. Neste caso a cor obtida é referida como sendo aparente.
Para ser potável uma água não deve apresentar nenhuma cor de considerável
intensidade. Segundo a Portaria 518, de 25 de março de 2004 – ANVISA – MS o índice
máximo permitido deve ser 15 mg Pt Co/L ou 15 UH.
Odor e sabor são duas sensações que se manifestam conjuntamente, o que torna
difícil sua separação.
Como o paladar humano tem sensibilidade distinta para os diversos sais, poucos
miligramas por litro de alguns sais, como ferro e cobre são detectávis, enquanto que, várias
centenas de miligramas de cloreto de sódio não são percebidas.
Algumas fontes termais podem exalar cheiro de ovo podre devido ao seu conteúdo de
H2S (gás sulfídrico).
3.4 TURBIDEZ
Em alguns casos, águas ricas em íons Fe, podem apresentar uma elevação de sua
turbidez quando entram em contato com o oxigênio do ar.
3.6 DUREZA
É devida aos íons de cálcio e de magnésio que sob aquecimento se combinam com
íons bicarbonato e carbonatos, podendo ser eliminada por fervura.
Em caldeiras e tubulações por onde passa água quente (chuveiro elétrico por
exemplo) os sais formados devido à dureza temporária se precipitam formando crostas e
criando uma série de problemas, como o entupimento.
Dureza permanente
É devida aos íons de cálcio e magnésio que se combinam com sulfato, cloretos,
nitratos e outros, dando origem a compostos solúveis que não podem ser retirados pelo
aquecimento.
Dureza total
3.7 ALCALINIDADE
Numa água com certa alcalinidade a adição de uma pequena quantidade de ácido
fraco não provocará a elevação de seu pH, porque os íons presentes irão neutralizar o ácido.
Alcalinidade total é a soma da alcalinidade produzida por todos estes íons presentes
numa água. Águas que percolam rochas calcárias (calcita = CaCO3) geralmente possuem
alcalinidade elevada.
3.8 PH
O balanço dos íons hidrogênio e hidróxido (OH-) determinam quão ácida ou básica
ela é.
Na água quimicamente pura os íons H+ estão em equilíbrio com os íons OH- e seu
pH é neutro, ou seja, igual a 7.
Conhecer o teor de cloro ativo que permanece após a desinfecção (cloração) da água,
permite garantir a qualidade microbiológica da água, ou seja, se ela está em condições de uso.
3.10 CLORETO
O cloreto é o ânion Cl- que se apresenta nas águas subterrâneas através de solos e
rochas.
Nas regiões costeiras, através da chamada intrusão da língua salina, são encontradas
águas com níveis altos de cloreto. Nas águas tratadas, a adição de cloro puro ou em solução
leva a uma elevação do nível de cloreto, resultante das reações de dissociação do cloro na
água.
4 AMOSTRAGEM
Lava-se o recipiente três vezes com a água do local que se deseja analisar, e na
quarta vez enche-se, identifica-se com dados sobre o interessado, a procedência, local da
coleta, data da coleta e envia-se o mais rápido possível ao laboratório.
Caso não seja possível enviar no mesmo dia, colocar sob refrigeração até o momento
do envio.Cuidar para no momento da coleta não deixar as mãos entrar em contato com a água.
É importante também observar alguns procedimentos que dependem do local da coleta:
Para encher os vidros com água de rio ou lagoa tem que se procurar a amostra a 2 cm
da margem e obtê-la de 20 a 30 cm abaixo do nível da água, a fim de não ficar contaminada, e
que seja representativa. A boca do vidro deve estar na mesma direção da corrente, para que
não entre água superficial.
Para análise bacteriológica, abrir a torneira e deixar sair a água por 3 a 4 minutos;
fechar a torneira e flambá-la com um swab embebido em álcool (esterilização direta); em
seguida, deixar correr água por 2 a 3 minutos, encher o vidro e fechar rapidamente.
Geralmente a água ingressa pela parte superior e sai pela parte inferior. Devemos
tomar duas amostras: quando a água ingressa e quando a água egressa. O objetivo é
determinar se a fonte de contaminação está depositada no tanque reservatório. Nas piscinas ou
em tanques de água similares, devemos tomar uma amostra da zona em que supõe que o fluxo
de água é menor onde a água é mais parada.
5 LEGISLAÇÃO
6 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS
Processo analítico:
3. Titular com solução de H2SO4 0,04 até descoramento, anotando o gasto como F
mL, onde F é o volume gasto de ácido usando fenolftaleína.
5. Titular com o H2SO4 até coloração rosa (salmão), anotando o gato como M mL
(M = gasto de ácido usando metil orange; T = volume total do ácido gasto com os
dois indicadores).
► 1º Caso: T = F
CO32– = zero
HCO3– = zero
OH– = 2 x F x 3,398 mg L-1 em CaCO3.
► 2º Caso: F > ½ T
HCO3– = zero
OH– = 2 (2 x F – T) x 3,398 mg L-1 em CaCO3.
CO32– = 4 (T – F) x 5,995 mg L-1 em CaCO3.
► 3º Caso: F = ½ T
OH– = zero
HCO3– = zero
CO32– = 2 x T x 5,995 mg L-1 em CaCO3.
► 4º Caso: F < ½ T
OH– = zero
CO32– = 4 x F x 5,995 mg L-1 em CO3Ca
HCO3– = 2 (T – 2 x F) x 12,2 mg L-1 em CO3Ca.
► 5º Caso: F = 0
OH– = zero
CO32– = zero
HCO3– = 2 x T x 12,2 mg L-1 em CaCO3.
Preparo:
Indicador líquido Æ Prepara-se como indicador uma solução aquosa saturada, que
se prepara no momento, dissolvendo aproximadamente 0,17g do murexida em 100mL de água
destilada.
Preparo:
• Solução tampão pH = 10
Preparo:
Bx400xf
Ca 2 + = ppm Ca 2 +
mL da amostra
Bx1000
Ca 2+ = ppm CaCO 3
mL da amostra
(A - B)x243xf
Mg 2 + = ppm Mg 2+
mL da amostra
(A - B)x1000
Mg 2+ = ppm CaCO 3
mL da amostra
Ax1000xf
DT = ppm
mL da amostra
Preparo:
Preparo:
Reação:
Processo analítico:
1. Pipetar 50 mL da amostra de água para uma cápsula de cor branca. Se a água for
muito colorida, juntar um pouco de Al(OH)3, filtrar e lavar com água destilada.
(A - 0,2)x0,5x1000xf
= mgL-1Cl −
mL da amostra
6.6 DETERMINAÇÃO DE PH
Fórmulas:
1.000 .000
X=
V (lido)
0,935
Y=
X
Titula-se com solução de Na2S2O3 0,001 N, até que a cor azul desapareça.
1. CONSIDERAÇÕES INICIAIS
As espécies bacterianas existentes nas águas naturais são principalmente espécies dos
gêneros Pseudomonas, Chromobacterium, Proteus, Micrococcus, Bacillus, Enterococcus,
Enterobacter e Escherichia coli. É provável que as três últimas bactérias sejam
contaminantes.
Mas existem ainda outros tipos de contaminação relacionada com a água é a presença
de protozoários causadores de infecções parasitárias no homem como a amebíase (Entamoeba
hystolitica), giardíase (Giardia lamblia) e a balantidíase (Balantidium coli).
Organismos Doenças
Salmonella Typhi Febre Tifóide
Salmonella sp. Salmonelose
Shigella sp. Shigelose (desinteria bacilar)
BACTÉRIAS Escherichia coli patogênica Gastrenterites
Vibrio cholerae Cólera
Lagionella pneumophila Doença dos legionários
Leptpspira Leptospirose (contato)
Enterovirus Poliomelite, gatroenterites
Rotavírus Gastroenterites
VÍRUS Vírus da hepatite A Hepatite A
Doenças respiratórias,
Adenovírus
conjuntivites.
Entamoeba histolytica Amebíase
PROTOZOÁRIOS Giárdia Lamblia Giardíse
Cryptosporidium Criptpsporidiose
Ascaris lumbricóides Verminoses
Enterobius vermicularis
HELMINTOS Strongyloides stercolaris
Trichuris trichiura
Schistosoma mansoni Esquistossomose
2 ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS
a) Amostragem:
b) Identificação:
Para amostras de água tratada (piscina, etc.), deve-se adicionar ao frasco de coleta,
antes de sua esterilização 0,1mL de uma solução a 1,8% de Tiossulfato de sódio para cada
100mL da amostra, para neutralizar a ação do cloro residual.
Antes das coletas das amostras, verifique se o ponto de coleta recebe água
diretamente do sistema de distribuição e não de caixas, reservatórios, cisternas, etc. A torneira
não deve conter filtros.
Abre-se a torneira a meia secção para que o fluxo seja pequeno e não haja respingos.
Remove-se a tampa do frasco com todos os cuidados e assepsia, tomando precauções para
evitar a contaminação da amostra pelos dedos, luvas ou outros materiais.
a) Água de torneira
b) Água de poço
Quando não houver, amarrar um barbante no frasco de coleta, tendo sempre todos os
cuidados de assepsia, ou flambar um balde interno e externamente antes de coletar a água.
c) Mananciais superficiais
2.1.5.2 MATERIAL
a) Meios de Cultura
• Caldo Lactosado.
• Caldo E.C.
b) Equipamentos e vidrarias
• Bico de Bunsen;
• Tubos de ensaio;
• Tubos de Durham;
2.1.5.3 METODOLOGIA
a) Teste Presuntivo
b) Teste Confirmativo
De cada placa, correspondente a cada tubo, repicar de duas a três colônias para tubos
contendo o Agar Tripticase Soja (Agar TSA) inclinado. Incubar por 24 horas a 35 ºC.
Considerar positivo o tubo de caldo E.C. para E. coli, quando pelo menos uma
cultura dele proveniente for positiva no teste de IMVIC (Apêndice C). A Tabela 2B mostra a
diferenciação dos coliformes em água.
+ + - - Escherichia coli
-/+ + - + Citrobacter
- - + + Enterobacter aerogenes
Por fim, verificar na tabela o NMP (Tabela de Hoskin), correspondente aos tubos de
caldo E.C. positivos para a presença de coliformes fecais e expressar o resultado em
NMP/100 mL.
Material:
Princípio do método:
A 19a edição do Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater
(APHA/AWWA/WEF, 1995) traz descrição de um método rápido para determinação de
coliformes totais e E. coli usando substratos definidos.
A bactéria E. coli é aquela que dá uma resposta positiva igual para os coliformes
totais e ainda possui a enzima β-glucoronidase, a qual cliva um substrato fluorogênico MUG
Estes testes podem ser usados nas provas de tubos múltiplos ou Presença/Ausência
P/A (amostra única de 100mL).
Procedimento:
A) Tubos múltiplos
B) Presença/ausência (P/A)
Interpretação:
As amostras são negativas para coliformes totais se a coloração amarela não for
observada.
b) Escherichia coli
calcular o valor do NMP para coliformes totais e E. coli a partir dos tubos positivos, como
feito pelo método tradicional. No caso do procedimento P/A, relatar os resultados como
presente ou ausente em 100mL da amostra.
Resultados:
A verificação da fluorescência deve ser procedida em área com pouca luz, pois o
excesso de iluminação mascara a presença de fluorescência. Lâmpadas ultravioletas
germicidas, por serem de pequenos comprimentos de onda, não são adequadamente para este
propósito.
Tipos de
Técnica Microrganismos pesquisados
água
Coliformes Totais e Termotolerantes
(NMP/100mL); Pseudomonas aeruginosa.
Poço Tubos Múltiplos
(NMP/100mL) e Contagem Padrão em Placas
(Agar PCA) (UFC/mL)
Torneira,
Coliformes Totais e Termotolerantes
cisternas e
Tubos Múltiplos (NMP/100mL) e Contagem Padrão em Placas
caixas
(Agar PCA) (UFC/mL).
d’água
Tubos Múltiplos
Coliformes Totais e Termotolerantes
OBS: Adicionar 0,1mL de (NMP/100mL), Contagem Padrão em Placas
Piscina solução 1,8% de (Agar PCA) (UFC/mL), Contagem de
Tiossulfato de Sódio Staphylococcus aureus (UFC/mL),
(Na2S2O3) aos frascos de Pseudomonas aeruginosa.(NMP/100mL)
coleta antes de autoclavar.
Usar uma série de 10 tubos Coliformes Totais e Termotolerantes
de Lactosado Duplo, (NMP/100mL); Pseudomonas aeruginosa.
Mineral inoculando 10mL da (NMP/100mL), Contagem Padrão em Placas
amostra em cada tubo. (Agar PCA) (UFC/mL), Enterococcus sp.
(UFC/mL) e Clostridium sp. (UFC/mL)
Diluir as amostras em água
Coliformes Termotolerantes (NMP/100mL),
Água de marinha sintética e usar
Contagem e identificação de Escherichia coli;
praia Técnica de Tubos
Enterococcus sp. (NMP/100mL)
Múltiplos.
Enterococcus sp.◄
Material:
Meios de Cultura: Caldo azida dextrose para o cultivo e o Agar m-Enterococcus para
o plaqueamento seletivo. O restante do material, equipamentos e vidrarias são idênticos ao
usado para a determinação de coliformes totais.
Métodos:
Prova Presuntiva:
• Inocular volumes de 10mL em uma série de três tubos contando o caldo azida em
concentração dupla; em seguida inocular volumes de 1mL e 0,1mL em duas
séries de três tubos contando o caldo azida em concentração simples
respectivamente (Técnica dos tubos múltiplos).
Prova Confirmativa:
• Estriar com auxílio de uma alça de platina uma porção do crescimento de cada
tubo positivo sobre uma placa de Petri contendo o meio seletivo Agar m-
Enterococcus.
Após o período de incubação, a partir dos tubos positivos (turvos), serão feitas estrias
com auxílio de uma alça de platina (técnica de esgotamento) em placas contendo Agar m-
Enterococcus (teste confirmativo). Colônias pequenas de cor marrom são típicas de
Enterococcus sp.
Pseudomonas sp.◄
A espécie Pseudomonas aeruginosa tem sido a responsável pela maioria dos casos
de doença infecciosa no homem. Trata-se de um microrganismo oportunista, isto é, causa
doença somente em condições especiais, quando o organismo humano está debilitado por
algum motivo, como, por exemplo, processos cirúrgicos e queimaduras. Nesses casos, esse
microrganismo pode causar bacteremias bem severas, infecções urinárias e respiratórias,
pneumonias, meningites, endocardites, e diversos outros tipos de infecção. Além disso,
Pseudomonas aeruginosa, bem como outras espécies de Pseudomonas, apresentam grande
importância para a indústria de alimentos, pois são microrganismos causadores de
deterioração (produção do muco superficial característico de carnes e produtos cárneos
deteriorados).
Material:
Procedimento:
Teste Presuntivo:
• Inocular 3 tubos com 10mL, 3 com 1mL e 3 com 0,1mL da amostra, em caldo
asparagina em concentração dupla para 10mL da amostra e concentração simples
para volumes de 1mL ou menos.Incubar os tubos a 35°C por 48 horas.
• Após o período de incubação, examine os tubos num quarto escuro sob luz
ultravioleta de comprimento de onda longo (não germicida). A presença de
pigmento fluorescente esverdeado constitui um teste presuntivo positivo para
Pseudomonas.
Toda semana deve ser fornecido o Boletim de Balneabilidade das Praias, com dados
de colimetria. Os dados obtidos durante certo período de tempo, servem para avaliar a
evolução temporal da qualidade das águas das praias.
As águas serão consideradas impróprias quando for verificada uma das seguintes
ocorrências:
f) Floração de algas ou outros organismos até que se comprove que não oferecem
riscos à saúde humana.
APÊNDICES
51
ESTUFA
35ºC/24-48h
2 alçadas 2 alçadas
BANHO-MARIA ESTUFA
45ºC/24h 35ºC/24-48h
TESTE BIOQUÍMICO
Teste API-20E
52
Apêndice B. Tabela do Número Mais Provável (NMP), para séries de três tubos.
Número de tubos positivas nas diluições Número de tubos positivos nas diluições
0 0 0 3 2 0 0 9.1
0 1 0 3 2 0 1 14
0 0 2 6 2 0 2 20
0 0 3 9 2 0 3 26
0 1 0 3 2 1 0 15
0 1 1 6.1 2 1 1 20
0 1 2 9.2 2 1 2 27
0 1 3 12 2 1 3 34
0 2 0 6.2 2 2 0 21
0 2 1 9.3 2 2 1 28
0 2 2 12 2 2 2 35
0 2 3 16 2 2 3 42
0 3 0 9.4 2 3 0 29
0 3 1 13 2 3 1 36
0 3 2 16 2 3 2 44
0 3 3 19 2 3 3 53
1 0 0 3.6 3 0 0 23
1 0 1 7.2 3 0 1 39
1 0 2 11 3 0 2 64
1 0 3 15 3 0 3 95
1 1 0 7.3 3 1 0 43
1 1 1 11 3 1 1 75
1 1 2 15 3 1 2 120
1 1 3 19 3 1 3 160
1 2 0 11 3 2 0 93
1 2 1 15 3 2 1 150
1 2 2 20 3 2 2 210
1 2 3 24 3 2 3 290
1 3 0 16 3 3 0 240
1 3 1 20 3 3 1 460
1 3 2 24 3 3 2 1100
1 3 3 29 3 3 3 2400
Fonte: American Public Health Association (APHA, 1992).
53
Série Bioquímica
INDOL
E. coli (+)
54
AM O STR A
(Água)
1m l 1m l
IN C U B A Ç ÃO
37ºC /48H
55
TESTE PRESUNTIVO
Amostra de água
TESTE CONFIRMATIVO
Tubos (+)
(Turvos)
Amostra de água
Teste presuntivo
Caldo Asparagina
Teste confirmativo
Caldo Acetamida
ESTUFA
37ºC/48 horas
AMOSTRA
10 mL
ESTUFA a 35ºC
24/48 horas
2 alçadas
Caldo
E.C. Coliformes a 45ºC
Banho-Maria
45ºC/24 horas
REFERÊNCIAS
SOARES, J.B.; MAIA, A.C.F. Água: microbiologia e tratamento. Fortaleza: EUFC, 1999.