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INTRODUCCIÓN
Encienda un mechero de alcohol o de gas y flamee la boca del tubo que contiene el
agar contaje, levante la tapa de la placa de petri lo suficiente que permita la introducción
de la pipeta o del medio de cultivo que se va a verter. Se deben mezclar inóculo más
medio, distribuyéndolos de modo uniforme mediante movimientos circulares o en forma
de 8 hasta su homogenización. Dejar solidificar por 10 minutos e inmediatamente
colocar las placas invertidas en una incubadora apropiada a 35° C durante 24 horas. El
tiempo transcurrido entre la siembra de la placa y el vertido del medio, no debe ser
mayor de 20 minutos, para evitar evaporación del inóculo.
Las cajas de Petri se deben disponer en la incubadora manteniendo una distancia
entre una y otra de 2,5 cm.
originan al contar dos veces la misma colonia. El número de colonias se multiplica por
la dilución respectiva que debe estar anotada en la tapa de la placa.
Cuando son muchas las colonias que aparecen en la placa, especialmente aquellas con
característica puntiforme difíciles de observar a simple vista, se emplea el método de
conteo indirecto para lo cual se utiliza el contador de colonias Quebec: este posee un
vidrio dividido en cuadrícula de 1 cm, siendo su superficie total de 60 cm Se puede
contar una cuadrícula cualquiera y el número de colonias encerrada en ella se multiplica
por el factor 60 y por la dilución respectiva.
Cada cuadricula de 1 cm está subdividida en 9 cuadriculas pequeñas: cuando se
utiliza este tipo de cuadricula (colonias numerosas puntiformes y muy cercanas entre sí,
es necesario multiplicar el número de colonias que hay en una de estas cuadriculas
pequeñas por 9, para referirlo a 1 cm Se procede entonces en forma similar al caso
anterior.
Recomendamos usar placas de petri de diámetro standard y en caso contrario verificar
el diámetro de la placa ya que una variación en este diámetro influye en el área total de
la placa.
Se tendrá menos causas de error mientras mayor sea el número de cuadriculas que se
cuentan y se promedien los valores de todas ellas: Este promedio será más
representativo de la población de la placa. El tamaño normal de la placa es 100 x 15
mm.
Contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de
mohos y levaduras), incluyendo las colonias puntiformes. Hacer uso del microscopio
para resolver los casos en los que no se pueden distinguir las colonias de las pequeñas
partículas de alimento.
Contar cualquiera de los tipos establecidos como provenientes de una sola fuente. En el
caso de las colonias descritas en a), si la caja contiene una sola cadena, contar como
una sola colonia. En cambio, si la caja contiene varias cadenas que parecen originarse
de fuentes separadas, contar cada cadena como colonia individual. Las colonias
establecidas en a) y b) generalmente se observan como crecimiento diferenciable de
otras colonias y se cuentan como tales.
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Expresión de resultados
Cálculos.
Ejemplo 1 Cuando sólo una dilución está en el intervalo apropiado, calcular la cuenta
promedio por gramo o mililitro de dicha dilución y reportar.
Ejemplo 3 Cuando las placas corridas para la menor dilución muestran menos de 25
UFC, contar el número de colonias presentes en dicha dilución, promediar el número de
colonias y multiplicar por el factor de dilución para obtener el valor estimado de cuenta
en placa. Aclarar en el informe esta situación agregando la leyenda "valor estimado".
Ejemplo 4 Cuando el número de colonias por placa exceda de 250 UFC para todas las
diluciones, contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas
de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 o 2 respectivamente. Si solamente
pueden contarse algunos cuadros, considerar el diámetro de la caja de Petri, y calcular el
número de cuadros por área. Aclarar en el informe esta situación agregando la leyenda
"valor estimado".
Ejemplo 5 En caso de que una dilución se encuentre dentro del intervalo y otra dilución
presente colonias de crecimiento extendido, reportar la dilución en la que se pueden
contar las colonias.
Ejemplo 6 Cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias, reportar la
cuenta en placa como menor que una vez el valor de la dilución más baja usada.
Ejemplo 7 Cuando una placa tiene entre 25 y 250 colonias y su duplicado más de 250
colonias, contar ambas placas incluyendo la que está fuera del intervalo para determinar
la cuenta en placa.
(NMP en 100 ml de muestras). En realidad, este término es una estimación que se basa
en ciertas fórmulas de probabilidad
Prueba presuntiva
1. Aguas de calidad potable
Procedimiento
Después de agitar 25 veces el frasco con muestra ; se inoculan una serie de 3 ó 5
tubos de fermentación que contienen 10 ml de caldo lactosado (doble concentración)
estéril, con l0 ml de la muestra, series de tubos con 10 ml de caldo lauryl sulfato
concentración simple, con 1 ml de muestra y series de tubos con 10 ml de caldo lauryl
sulfato concentración simple con 0,1 ml de muestra.
Se incuban durante 24 horas a la temperatura de 35 ± 0.5° C: cada tubo se examina al
cabo de este tiempo y si no se ha producido gas, se examinan nuevamente al cabo de 48
horas. En cada examen se registra la presencia o la ausencia de gas sin tomar en cuenta
su cantidad.
La formación de cualquier cantidad de gas en cualquier tubo de fermentación de la
serie dentro de las 48 horas, constituye una prueba presuntiva positiva. Si el gas
formado es producto de la fermentación de la lactosa y no una burbuja de aire, se
enturbia el caldo, lo cual indica crecimiento y fermentación del medio.
La ausencia de gas en los tubos al cabo de 48 horas de incubación, constituye una
prueba presuntiva negativa.
Es de interés recalcar que en ningún caso debe omitirse la lectura de 24 horas en esta
prueba ya que los miembros del grupo coliforme presentan su máximo crecimiento entre
6 y 24 horas.
En el análisis rutinario de los abastecimientos de agua potable en que se aplica
desinfección (cloración), el objeto del análisis es detectar la presencia o ausencia de
organismos coliformes para determinar la eficiencia de la desinfección o contaminación
bacterial presente.
2. Aguas ligeramente contaminadas
Provienen de los sistemas de red de distribución con desinfección irregular de
procedimiento desconocido.
Procedimiento
Después de agitar 25 veces el frasco con la muestra, se inocula una serie de 3 ó 5
tubos de fermentación que contienen 10 ml de caldo lactosado concentración simple
estéril, con 1 ml de la muestra. Series de tubos de fermentación (16 x 150 mm) que
contiene 10 ml de caldo lactosado concentración simple con 0,1 ml de la muestra y
tubos similar con 1 ml de una dilución 10-2 (1:100). Se incuban durante 24 horas 35±
0,5° C y se examinan los tubos al cabo de este tiempo y si no se ha producido gas se
examina nuevamente al cabo de 48 horas. Aplíquese la misma interpretación de los
resultados que en el caso precedente.
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Procedimiento
Se procede a realizar diluciones seriadas de la muestra y se siembra 1 ml de cada
dilución requerida en 10 ml de tubos con caldo lauryl triptosa concentración simple,
usando varias series, de tres o cinco tubos cada una. El número de series y los
volúmenes de inóculos deben estimarse de acuerdo al grado de contaminación o al
origen de la muestra.
El objeto de estos exámenes es evaluar cuantitativamente la calidad del agua por la
densidad de la contaminación bacterial.
Prueba confirmativa.
1. Coliformes Totales
Para esta prueba se emplean tubos de fermentación con caldo bilis y verde brillante,
este medio es selectivo para los miembros del grupo coliforme e inhibidor para la flora
restante.
Procedimiento
1. Tome los tubos que resultaron positivos a la prueba presuntiva (mantenga el orden).
2. Mezcle el tubo de fermentación positivo con un movimiento rotatorio.
3. Encienda un mechero de gas para mantener una atmósfera estéril
5. Tome los dos tubos por su base, tanto el de fermentación positiva como el de bilis
verde brillante que va a ser inoculado, y sostenga con la mano izquierda, destape de a
par los tubos con la mano derecha.
6. Esterilice el asa de platino o alambre cromado hasta el rojo y deje enfriar.
7. Flamee la boca de los tubos y rápidamente introduzca el asa en el tubo de
fermentación positivo. Sáquela e introdúzcala en el tubo de la prueba confirmativa.
Efectúe esta operación dos veces.
7. Flamee de nuevo la boca de los tubos y esterilice el asa.
El asa puede ser de platino o de alambre cromado y su diámetro no debe ser menor de
5 mm.
Incube los tubos inoculados de caldo lactosado con bilis verde brillante a 35° C ± 0.5
por 48 horas.
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2. Coliformes fecales
Para esta prueba se emplean tubos de fermentación con caldo EC, este medio es
selectivo para los miembros del grupo coliforme de origen fecal (termófilos) inhibidor
para la flora restante.
Se realiza el repique de las muestras en los dos medios (BVB y EC) a la vez.
Este método consiste en transferir diluciones decimales de una muestra a una serie de
tubos, (3 ó 5). El método del número más probable es un índice del contaje estadístico
calculado del número de tubos donde hay crecimiento por 100 ml de muestra. Los
resultados se leen en una tabla especial (estadística).
Por lo general en agua potable se siembra 10 ml, 1 ml y 0,1 ml. Cuando se trata de
aguas servidas o contaminadas se realizan diluciones más altas.
Preparación de medios de cultivo:
1. Caldo lauryl sulfato doble concentración: 71,2 g/l agua destilada, pH 6,8
2. Caldo laurel sulfato simple: 35,6 g/l agua destilada, pH 6,8
3. Caldo Bilis Verde Brillante : 40 g/l agua destilada, pH 7,2
4. Caldo Eschericia coli : 37 g/l agua destilada, pH 6,9
PRUEBA PRESUNTIVA
10 ml 1 ml 0,1 ml
3 1 0
PRUEBA CONFIRMATIVA
Repicar 3-1-0 en
RESULTADOS
1 0 1 0
Ir a la tabla para NMP para expresar los resultados de NMP de coliformes totales y
coliformes fecales.
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REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA:
ANOTACIÓN DE RESULTADOS
A.-
1. Los casos donde no se observa crecimiento en ninguna de las diluciones de la serie
de tubos de tres, se anota como: <3 NMP/ml
2. Los casos donde no se observa crecimiento en ninguna de las diluciones de la serie
de cinco tubos, se anota: <2 NMP/ml
B.- Cuando se utilizan porciones de muestras diferentes a lO ml, 1 ml, 0.1 ml se procede
de la siguiente manera:
1. Cuando se utiliza porciones de 100 ml, 10 ml, 1 ml; registre los resultados dados en
las tablas “A” y “B” multiplicado por 0.1
2. Cuando se utiliza porciones de 1 ml, 0.1 ml, 0.01 ml; registre los resultados dados en
las tablas “A” y “B”, multiplique por 10
3. Cuando se utiliza diluciones seriadas de 0.1 , 0.01, 0.00 1 ; registre los resultados
dados en las tablas “A” y “B”, multiplique por 100
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C.- De utilizarse más de tres diluciones, se anota los resultados de solo tres de los tubos.
En éste caso, se selecciona los tubos positivos de la más alta dilución, tomando en
cuenta lo siguientes:
1. En aquel caso donde se repite los resultados en dos diluciones, solo se toma uno en
cuenta, la dilución más alta. Ej. Caso (a).
2. Cuando en las cuatro diluciones hay un tubo negativo, ese tubo queda excluido,
tomando en cuenta solo los tres tubos donde hubo crecimiento Ej. Caso (b)
3. Cuando el tubo positivo queda en el medio de dos negativos, se toman en cuenta sus
dos extremos Ej. Caso ( c)
4. Cuando los cuatro tubos den positivos, se suma el resultado de la última dilución a la
antepenúltima Ej. Siguiente:
Diluciones Combinación de
tubos positivos
1 ml 0,1 ml 0,01 ml 0,001 ml
5/5 3/5 1/5 1/5 5-3-2
1/5+1/5=2/5