Curso de Análisis Instrumental

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA

Instituto de Ingeniería Química EFICACIA (HPLC)
Facultad de Ingeniería - 2007

Ampliamente utilizada

Gran sensibilidad

Determinaciones cuantitativas exactas

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
Determinación de compuestos no volátiles (alto Peso Molecular,

iones metálicos) o termolábiles.
DE ALTA EFICACIA (HPLC)

Aplicabilidad a sustancias de interés general (industria, salud,
medioambiente).

Aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos,

carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos,
esteroides, etc.

Juan Bussi

Solventes como Fase Móvil

Interacciones químicas entre la muestra, la fase móvil y el relleno
de la columna, determina el grado de migración y separación de
componentes contenidos en la muestra.

Compuestos con interacciones más fuertes con la fase móvil que

con la fase estacionaria eluirán más rápidamente de la columna
(tiempos de retención menores).

La fase móvil puede ser alterada en el transcurso del análisis para
manipular las interacciones de los componentes de la muestra con
la fase estacionaria.

•Elución Isocrática: composición constante de la fase móvil

•Elución por gradiente: los distintos analitos son eluídos

con incremento de la composición de la fase móvil en la fase
orgánica.
•Elución politíptica: se combinan varios tipos de técnicas.

1
 APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS Definiciones
Polaridad creciente
Insoluble en agua Soluble en agua Coeficiente de distribución K = cS/cM
No Polar Iónico
Tiempo de retención: tM
No Iónico Polar

102 Adsorción Reparto Intercambio

(Reparto (Reparto iónico
Velocidad lineal media v = u x ft
en fase en fase
Velocidad de migración u
PesoMolecular

inversa) normal)
3
10

1
104 v=ux
Exclusión por 1 + KVS/VM
tamaño
105
(Penetrabilidad (Filtración Factor de capacidad de una especie A:
sobre gel) sobre gel)
106 k’A = KA VS/VM
tR – tM
k’A =
Distintos métodos son complementarios. tM

Eficacia de columnas para HPLC

Factor de selectividad para dos especies A y B Conceptos de Altura de Plato Teórico y factores que lo afectan
(tR)B – tM como en otras cromatografias.
α = KB/KA = k’B/k’A = H = A + B/u + (CS + CM) u
(tR)A – tM (ecuación de Van Deemter)

Altura de plato teórico H = σ2/L
Velocidades lineales menores

que en CG
Nº de platos teóricos N = L/H

Altura de plato menor que en
GC (1 orden de magnitud).

Longitud de columnas menor

(25 a 50 cm).

2

Efecto del tamaño de partícula del relleno
CS y CM ∝ dP2
Aumento de eficiencia con disminución del tamaño de partícula
(tamaño usuales entre 2 y 10 µm

Ensanchamiento extracolumna
Debido a diferencias de velocidad entre distintas capas del
líquido que se desplaza en tubos de inyección, de conexión y
detectores.
Gradientes no se compensa por difusión.

π r 2u Reducción del diámetro de

Hex =
24DM tubos a menos de 2.5 mm.

Efecto del tamaño de muestra

Más notorio en Adsorción y Reparto

3
 Instrumentación

Elevadas presiones para alcanzar caudales necesarios.

Equipamiento sofisticado y caro.

Recipientes para una o más fases móviles Cámara de mezcla para disolventes
Ventajas de la elución con gradiente (relación variable de
De vidrio o acero de 0.2 a 1 L volúmenes de dos o más disolventes)

Sistemas de pretratamiento de fases móviles Mejora de resolución en tiempos de análisis más cortos.

Para eliminación de gases disueltos y sólidos en suspensión

desgasificación por vacío Sistemas de bombeo

calentamiento

Generación de presiones superiores a 6000 psi.

agitación

Caída de presión en una ηLu

inyección de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio). columna: ∆P =
θ dP2

Filtros para polvo y partículas sólidas en suspensión.
η: viscosidad
Método común: filtración a vacío a través de filtro millipore de
θ: parámetro adimensional (valor cercano a 500 para
tamaño de poro muy pequeño (eliminación de gases disueltos y
columnas bien empacadas)
sólidos en suspensión).
dP: diámetro de partícula del relleno

4

Flujo libre de pulsaciones (minimización de errores de medición) Coeficientes de compresibilidad isotermos de algunos solventes
Variaciones menores a 1% son normales usados en HPLC.

Intervalo de caudales entre 0,1 y 10 mL/min

Solvente κ (10-11Pa-1)

Control y reproducibilidad de caudal mejor al 0,5%.
Metanol 120

Cambio de volumen de líquidos y sellos al cambiar la Agua 45
contrapresión:
1 dV n-hexano 150
κ= n-octano 100
V dP T
Isopropanol 100

Caudal = Diámetro Pistón*desplazamiento - κ*∆P*V-∆P*compr.sellos y
cloroformo 105
burbujas.
Dietil éter 185

En sistemas de bombeo por jeringa (250 mL) la compresión del
solvente (a 400 atm) puede requerir varios mL de desplazamiento
del pistón. κ varía para mezclas de solventes en análisis con elución por
gradiente

Programación por microprocesadores que corrige desvíos

Bombas recíprocas

Componentes resistentes a corrosión (juntas de acero inox o
teflón).
Las más utilizadas

Movimiento cíclico de uno o

Altas presiones no suponen riesgo de explosión (sí riesgo de
más pistones con válvulas de
incendio).
entrada y salida.

Elementos compresibles en el
circuito atenúan variaciones.

2 Pistones es la opción más adecuada

Ventajas: pequeño volumen interno (35 a 400 µL), altas

presiones (>10000 psi), fácil adaptación a sistemas por gradiente
y caudales constantes e independientes de la contrpresión de la
columna y viscosidad del disolvente.

Desventajas: flujo con pulsaciones.

5
Pérdidas en válvulas
Bombas de desplazamiento
Funcionamiento normal:

Cámara con un émbolo impulsado por un motor

pérdidas pequeñas y constantes

Mayor incidencia a bajos caudales (µL/min).
Ventajas: flujo libre de pulsos, independiente de viscosidad y
contrapresión

Fabricantes suministran diagnósticos para
detección de pérdidas

Desventajas: capacidad de bombeo limitada (0.25 L), poco
práctica para reposición y cambio de disolvente.
Test para pérdidas

Reemplazo de columna por una vacía de
V=1.5 mL

Llenado con disolvente y tapado.

Prender la bomba hasta que la presión

alcanza 300 atm.

Apagar la bomba y registrar caída de

presión en función del tiempo (normal < 2
atm/min)

Bombas neumáticas
Sistema de inyección de muestra
Ventajas: baratas

Volúmenes pequeños para evitar ensanchamiento de picos

Exentas de impulsos (décimas de µL a 500 µL).
Desventajas: Inyección manual.

Capacidad limitada y de presión de salida.

Sencilla

Caudal dependiente de la viscosidad del disolvente y de la
contrapresión.
Evitar despresurización (microjeringas capaces de resistir 1500 psi).

No sirven para elución con gradiente.
Inyecciones a flujo detenido

Presiones menores a 2000 psi.
Reproducibilidad: dispersión 2%-3% o mayor

Control de caudal Inyección con bucles

Medición de caudal mediante caída de presión a través de un Ventajas
tubo en la salida de la bomba.

Inyección a presiones de hasta 7000psi

Programa de Ordenador

Precisión de décimas por ciento.

Volúmenes de bucles entre 0,5 y 500 µL.

6

Precolumnas

Eliminación de materia en suspensión y componentes que se
unen irreversiblemente al relleno.

Saturación del solvente con la fase estacionaria (minimiza
pérdidas de relleno.

Tamaño de partícula mayor al de la columna
Columna termostatizada

Entre temp. ambiente y 100º-150ºC.
Columnas

Tubos rectos de acero inoxidable

Tubos de vidrio hasta presiones de 600 psi

Longitud entre 10 y 30 cm

Acoplables

Diámetro interno entre 4 y 10 mm

Tamaños de partículas entre 5 y 10 µm

Columnas comunes: longitud 25 cm, diámetro interno 4.6 mm,
relleno de partículas de 5 µm: 40000 a 60000 platos/metro

Columnas de alta eficacia de menores dimensiones con hasta
100000 platos/metro.
Rellenos
Pelicular:

Bolas de vidrio o polímero, no porosas y esféricas con diámetros
entre 30 y 40 µm.

Recubrimiento con una capa delgada y porosa de distintos
compuestos y recubrimiento adicional de fase estacionaria líquida
y retenida por adsorción.

Tratamientos químicos para mejorar fijación.

Ampliamente utilizados en precolumnas
Partículas porosas.

Micropartículas porosas con diámetro entre 3 y 10 µm.

Preparadas por aglomeración a partir de partículas pequeñas.

Recubrimiento con películas orgánicas unidas químicamente o
físicamente.
7
Materiales más utilizados como soportes

sílice, alúmina, resinas de poliestireno. divinilbenceno o
carbohidratos.

Parámetros físicos: porosidad, tamaño de poro, tamaño y rigidez
de partícula, tamaño.

Parámetros químicos. Polaridad, acidez-basicidad, estabilidad
frente a solventes y pH, reactividad superficial.
Detectores

Propiedades de la fase móvil (Indice de Refracción, constante
dieléctrica, densidad)

Propiedades del soluto (absorbancia, fluorescencia, corriente límite).
Detectores de absorbancia (71%)

Volumen de 1 a 10 µL, longitud de 2 a 10 mm

Presiones < 600 psi (necesitan reductores de presión)

Dispositivos de doble haz (los más comunes)

Señal proporcional al Log I/Io

Filtros (longitudes de onda determinados)

Monocromadores (redes de difracción)(UV y Visible)

Cromatogramas a una λ fija o variable según el analito.

Barrido de λ para un analito con detención de flujo

Detectores de diodos permiten recoger el espectro completo
en 1 segundo (cromatografía tridimensional.
8
Detectores de absorbancia en el infrarrojo

Barrido de λ entre 2.5 y 15 µm

Cubetas con ventanas de NaCl o CaF2, long. 0,2 y 1,0 mm,
volumen 1,5 a 10 µL.

Limitación: baja transparencia de los disolventes (agua,

alcoholes)
Detectores de fluorescencia

Detector colocado perpendicularmente al haz de excitación

Fuente de excitacion
•de Hg y filtros
•Xenón y monocromador de red
•láser sintonizables en desarrollo

Tratamiento previo para dar derivados fluorescentes.

Alta sensibilidad (materiales de interés farmacéutico, clínico,

productos naturales y del petróleo).

9
 Detectores de índice de refracción

Detector universal

No dependen del caudal

Robustos

Sensible a cambios de temperatura

Menor sensibilidad que otros detectores.

Detectores electroquímicos

Elevada sensibilidad, sencillez, extensa aplicabilidad

Electrodo indicador de platino, oro, carbón vítreo o pasta de
carbono, electrodo de referencia y contraelectrodo se colocan más
adelante en el canal de flujo.

10
Detectores por espectrometría de masas

Sistemas para introducción de la fase móvil en cámara de vacío

Introducción directa de una pequeña cantidad de líquido

Vaporización previa de solvente y posterior desorción-ionización

de solutos.

Termovaporizador-ionizador

Aplicable a compuestos termoestables y no volátiles (péptidos,

nucleótidos.

Espectros de impacto electrónico

Cromatografía de Reparto

Rellenos tipo siloxano para fase inversa:

La más utilizada
Grupo R: C8 (n-octilo), C18 (n-octadecilo)

Para compuestos polares, no iónicos, de baja a moderada masa
Mecanismos de retención de solutos (por disolución, molecular (<3000)
equivalente a una fase líquida no polar, por adsorción física

Más recientemente para compuestos iónicos derivatizados
(formación de pares iónicos).
Líquido-líquido: fase estacionaria unida por adsorcion física
Efecto de la longitud de cadena en eficacia de columnas de
siloxano en fase inversa (Figura 28.15 Skoog).
Desventaja: pérdida de fase estacionaria por disolución en la fase
móvil
pH<7,5 para evitar hidrólisis del siloxano.
Fase unida químicamente: soporte más común es la sílice. diámetro
entre 3, 5 o 10 µm); porosidad (hasta 0.80)
Hi Hi Hi Hi

OH OH
OH OH

Ln km = ao,i - a1,i φ2 + (a2,i φ22)
Si Hi Hi
Si Si
φ2: fracción en volumen del componente orgánico OH OH
Agua unida a
grupos silanoles

Si Si
Grupo silanol Grupos silanoles
aislado vecinos

11
 Cromatografía de fase normal
Sílice hidrolizada con HCl 0.1 M en caliente durante uno o dos días
µmol/m2 de grupos OH
Relleno polar (agua o trietilenglicol soportado sobre sílice o
alúmina y fase móvil apolar.
Inmovilización química (90% de rendimiento)
Competencia del disolvente y del analito por el relleno es
determinante de los factores de retención.
Si OH + X Si (CH2)n L Si O Si (CH2)n L

Solventes no polares (etiléter, cloroformo y n-hexano).
sílice organoclorosilano siloxano

Ecuación de Soczewinski: ln ki’ = ln ki(2) – Si lnx2
n = 8 o 18 X2: fracción molar del componente de más polaridad

L: metil, amino, carboxil, ciano, diol

Rellenos tipo siloxano para fase normal:
Recubrimiento máximo 4 µmol/m2 de grupos.
Silanos residuales se desactivan con clorotrimetilsilano • amino (C3H6NH2) (los más polares)
• diol (C3H6OCH2CHOHCH2OH) (polaridad intermedia)
• dimetilaminopropil (C3H6N(CH3)2) (polaridad intermedia)
• ciano (C2H4CN) (los menos polares)

Cromatografía de fase inversa Criterios de selección

Polaridad de la fase estacionaria similar a la de los analitos.

Fase estacionaria no polar (hidrocarburo) y fase móvil polar (agua,
(Evitar tiempos de retención muy altos).
metanol, acetonitrilo).

Fase móvil con polaridad distinta a la fase estacionaria

Cambios de solvatación del analito en el disolvente es determinante
de cambios de factores de retención. Polaridad creciente:
Hidrocarburos < éteres < ésteres < cetonas < aldehídos <
amidas < aminas < alcoholes < agua
k’ (factor de retención) entre 2 y 5

Indice de polaridad P’ de Synder (J. Chromatog. Sci 1978, 16, 223)

Para una mezcla de solventes A y B: P’ = φAP’A + φBP’B
φA φB: fracciones en volumen
P’A, P’B: índices de polaridad

Cambio de 2 unidades en P’ → cambio de k’ en un factor de 10
k’2 (P’1 – P’2)/2
= 10
k’1

12
 Selectividad α
En fase inversa se ajusta con 3 disolventes: metanol, acetonitrilo
y tetrahidrofurano. Agua para ajustar k’.
En fase normal se ajusta con etiléter, cloruro de metileno y
cloroformo, nhexano para ajustar k’.

Formación de derivados
1) Reducción de polaridad que haga posible el uso de
cromatografía de reparto
2) aumento de respuesta del detector
3) aumento de selectividad de la respuesta

Cromatografía de pares iónicos

Fase móvil: agua + disolvente orgánico (metano o acetonitrilo +
compuesto iónico con contraión de carga opuesta a la del analito.
Contraión forma un par iónico con el analito: especie neutra
retenida por el relleno de fase inversa.

Aplicaciones de la Cromatografía de Reparto

Cromatografía con fases estacionarias quirales
Campo Mezclas típicas
Más apropiada en HPLC que en CG
Fármacos Antibióticos, sedantes esteroides,
Relleno recubierto con un isómero ópticamente activo. analgésicos
Bioquímica Aminoácidos, proteínas,
carbohidratos, lípidos
Productos de alimentación Edulcorantes artificiales,
antioxidantes, aflatoxinas, aditivos
Productos de la industria química Aromáticos condensados,
tensioactivos, propulsores,
colorantes
Contaminantes Pesticidas, herbicidas, fenoles, PCB
Química forense Drogas, venenos, alcohol en sangre,
narcóticos
Medicina clínica Ácidos biliares, metabolitos de
drogas, extractos de orina,
estrógenos.

13
Cromatografía de Adsorción (Líquido-sólido) Cromatografía iónica
Equilibrio de intercambio entre iones de la fase móvil y iones del
Fases estacionarias: sílice y alúmina mismo signo en la superficie de la fase estacionaria (resinas de
Selección del disolvente intercambio).
Fuerza del disolvente ε0 (energía de adsorción por unidad de
superficie). xRSO3-H+ + Mx+ ↔ (RSO3-)x + xH+
ε0 varía no linealmente con la relación de volúmenes de dos sólido disolución sólido disolución
disolventes.

Elección de disolventes xRN(CH3)3 OH- + Ax- ↔ [RH(CH3)3+]xAx- + xOH-

Un aumento de 0.05 unidades de ε0 disminuye k’ en un factor de 3-4.
Cambios de α se logran por ensayos previos con distintos sólido disolución sólido disolución
disolventes.
Ensayos por cromatografía de capa fina
Primera etapa: adsorción de iones en la cabeza de la columna
Aplicaciones de la cromatografía de adsorción
Para compuestos no polares con masa molecular < 5000 Segunda etapa: elución de iones adsorbidos con una disolución
Compuestos con solubilidad limitada en disolventes acuosos diluida de ácido clorhídrico.
Complementario con Reparto [RSO3-B+]s[H+]ac
Separa isómeros KII =
[RSO3-H+]s[B+]ac

Rellenos
[RSO3-B+]s [RSO3-H+]s
= KII Partículas esféricas porosas copolímeros de estireno y
[B+]ac [H+] ac divinilbenceno (8%) emulsionados (estables entre pH 0 y 14).
Activación por grupos ácidos (sulfónico) o básicos (aminas
[H+]ac y [RSO3-H+]s >> [B+] cuaternarias).
Nuevos desarrollos: partículas esféricas (30 a 40 µm), no porosa,
de vidrio o polímero, recubierta con resina de intercambio iónico
[RSO3-B+]s CS
(menor difusión)
= KII =
[B+]ac CM
Fase móvil

Kex alta → tiempo de retención elevado Disoluciones acuosas con metanol u otros disolventes orgánicos
y especies iónicas para formar un buffer.
Tl+ >Ag+>Cs+>Rb+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+
Ba2+>Pb2+>Sr2+>Ca2+>Ni2+>Cd2+>Cu2+>Cp2+>Zn2+>Mg2+>UO22+ Cromatografía iónica con columnas supresoras
SO42->C2O42->I->NO3->Br->Cl->HCO2->CH3CO2->OH->F- Electrolito eluyente enmascara la respuesta del Detector de
conductividad a los iones del analito.

14
 NaBr, NaCl, NaF, NaOH (diluyente)
Columna supresora convierte iones de la fase móvil en especies
Bomba
poco ionizadas
Inyector
Ejemplo:
H+(ac) + Cl-(ac) + Resina+OH-(s) →
NaBr
Resina+Cl-(s) + H2O Eluyente
NaOH NaOH Columna separadora
NaCl + -
Resina OH (s)
Na+(ac) + HCO3-(ac) + Resina-H+(s) → Resina-Na+(s) + H2CO3 (ac) Sistema para
NaF

separación de
analitos aniónicos
usando columna HBr
supresora H2O
Columna supresora
HCl - +
HF Resina H (s)

Conductancia
Detector

Tiempo

Residuos

Aplicaciones orgánicas y bioquimicas

Aminoácidos, vitaminas, azúcares y preparaciones
farmacéuticas, alimentos. (figura 28-25)

Cromatografía de exclusión de iones (para ácidos débiles)

Regeneración (cada 8 – 10 horas)
Desarrollo reciente de supresores de membranas supresoras de
intercambio iónico con regeneración continua: alta velocidad de
intercambio.
Cromatografía iónica con una sola columna: detección debida a
pequeñas diferencias de conductividad entre iones del analito y del
eluyente.
Método fotométrico para detección de iones no absorbentes (figura
28-24
Fase móvil: solución acuosa de HCl diluido
Fase estacionaria: resina de intercambio catiónico en su forma
ácida
Columna supresora de resina catiónica con Ag para supresión de
contribución iónica del eluyente.
Para ácidos y bases débiles (y sus sales): coeficientes de
distribución se relacionan inversamente con las constantes de
disociación.
Aplicaciones a especies ácidas en leche, café, vino, etc.

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 Cromatografía de exclusión por tamaño Propiedades de los rellenos comerciales típicos para la cromatografía
de exclusión por tamaño

Para masas moleculares elevadas

Relleno: partículas poliméricas con una red de poros uniforme (10 Tamaño de Tamaño Límite de exclusión
µm) en los que pueden difundir moléculas del soluto y del Tipo partícula promedio de en peso molecular
disolvente. µm poro, A

Tiempo de residencia depende del tamaño efectivo de las Poliestireno- 10 102 700
moléculas. divinilbenceno 103 (0.1 a 20) x 104
104 (1 a 20) x 104
Moléculas más grandes no se retenidas y eluyen primero. 105 (0.1 a 20) x 105
Separación por tamaño, no implica interacciones química o física 106 (5 a >10) x 106
con el relleno. Sílice 10 125 (0.2 a 5) x 104
300 (0.03 a 1) x 105
Rellenos de sílice: retienen por adsorción y catalizan
500 (0.05 a 5) x 105
descomposiciones. Se modifican por sustituyentes orgánicos
1000 (5 a 20) x 105
(sililación).
Rellenos de copolímeros estireno-divinilbenceno: hidrofóbicos.

Teoría Aplicaciones
Vt = Vg + V i + Vo Filtración sobre gel
Vt: volumen total de la columna Disolventes acuosos y relleno hidrofílicos
Vg: volumen ocupado por matriz sólida del gel Penetrabilidad sobre gel: disolventes orgánicos no polares y
Vi: volumen del disolvente retenido rellenos hidrofóbicos.

Vo: volumen libre exterior Separación de productos naturales de alto peso molecular.
Separación de homólogos y oligómeros

Volumen de elución = Vo: analitos no retenidos Determinación de la distribución de pesos moleculares en

polímeros o productos naturales (comparación con patrones).
Volumen de elución = Vo + K Vi analitos de tamaño intermedio (K
entre 0 y 1). Ventajas

Límite de exclusión: peso molecular por encima del que no existe Tiempo de separación cortos y bien definidos (entre Vo y Vo+Vi)
retención. Bandas estrechas
Límite de penetración: peso molecular por debajo del cual las No hay pérdida de muestra
moléculas pueden penetrar completamente en los poros.
No hay desactivación de la columna

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Desventajas
Número limitado de bandas
No diferencia compuestos de tamaño semejante (isómeros)

Cromatografía de Capa Fina (cromatografía

bidimensional)

Capa delgada de un Soporte inmovilizado sobre una superficie

plana de vidrio, plástico o metal.
Fase móvil se mueve por capilaridad, por gravedad o por un
potencial eléctrico.
Otras modalidades menos usadas (en papel, electrocromatografía)
Características: Rapidez y Bajo costo.
Aplicaciones:
Ensayos previos a los de columna
Control de pureza en la industria.

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