EVALUACIÓN DE LA EUTROFIZACIÓN EN AGUA

1. Fundamento

El aumento de la concentración de nutrientes en agua se denomina eutrofización. Los

nutrientes son elementos esenciales para el crecimiento de organismos vivos (C, N, P, K, S, y
algunos metales traza). Es un proceso natural y positivo. Sin embargo, la actividad humana puede
aumentar en exceso la presencia de nutrientes dando lugar a una situación problemática en
numerosas áreas. El drenaje de residuos y suelos agrícolas ricos en fertilizantes, que contienen
elevados niveles de N y P, puede originar un aumento en la población de fitoplacton, el llamado
bloom de algas. La capa de algas se vuelve tan espesa, que no puede penetrar la luz, y se produce
la muerte de aquellas que se encuentran por debajo de la superficie. Cuando las algas se
descomponen, se emplea una cierta cantidad de oxígeno disuelto, comenzando a desaparecer y
provocando la mortandad entre los peces.

2. Determinación.

Se van a realizar las siguientes determinaciones: oxígeno disuelto, clorofila, fosfato, nitrato, y
sulfato.

2.1. Determinación de oxígeno disuelto

2.1.1. Metodología

El oxímetro consiste en un electrodo de plata, otro de oro y un electrolito, todos separados

de la muestra por una membrana permeable a los gases. El oxígeno se difunde a través de la
membrana y se reduce a hidroxilo en el cátodo de oro, según la reacción:

O2 + 2·H2 O + 4·e −− → 4·OH−−

Los eletrones necesarios proceden de un ánodo de plata. Debido a que el electrolito

contiene iones cloruro, la reacción que tiene lugar es:

Ag + Cl −− → AgCl + e −−

A cualquier temperatura, la corriente que fluye entre cátodo y ánodo es proprocional al nivel
de oxígeno exterior a la membrana.

2.1.2. Material

1.- Medidor de oxígeno

2.1.3. Procedimiento.

Calibración

La calibración se efectua de forma automática, utilizando el vaso de calibración OxiCal, con

aire saturadode vapor de agua
- Conmutador principal en posición Cal
- Humedecer la esponja interior del vaso Oxical con varias gotas de agua.
1
 - Secar el electrodo
- Introducir el electrodo en el vaso Oxical
- Calibrar como indica las instrucciones del oxímetro

Medición

- Conmutador principal en posición O2

- Puede obtener la concentración de oxígeno en mg/l o bien como % de saturación
- Sumergir el electrodo en la muestra. Para asegurar el flujo de oxígeno hacia la
membrana, agitar la muestra manualmente o mediante un agitador magnético.
- Lectura tras 30 seg. - 1 minuto.

2.1.4. Cálculos

Expresar el contenido de oxígeno disuelto en mg/l

2.1.5. Observaciones

En otros electrodos de oxígeno se realiza una calibración con dos puntos. En este modelo,
sin corriente residual, un solo punto es suficiente.

Debido a que la saturación de agua con aire requiere tiempo y cuidados, y además es
dudoso el punto de saturación; y por otro lado, como la presión parcial de O2 es la misma en agua
saturada de aire y en aire saturado con vapor de agua, este último sistema es el utilizado en el
Oxical.

2.2. Determinación de clorofila

2.2.1. Metodología

La clorofila, después de extraerla del agua de mar, presenta una absorbancia a 663, 645 y
630 nm según su naturaleza a, b o c.

2.2.2. Materiales y reactivos

- Membrana filtrante de 0.45 µm de celulosa o éster de celulosa

- Sistema de filtración
- Espectrofotómetro de absorción molecular
- tubo de centrífuga
- acetona
- carbonato magnésico

2.2.3. Procedimiento

2.2.3.1. Concentración de la muestra

Utilizar un volumen de agua que contenga aproximadamente 1 µg de clorofila entre 0.5 y 5

litros. Filtrar con una membrana de celulosa o de éster de celulosa se 0.45 µ recubierta previamente
de una delgada capa de carbonato magnésico (10 mg aproximadamente) para evitar una eventual
acidificación del fitoplancton. Efectuar preferentemente la determinación una vez finalizada la
2
filtración.

2.2.3.2. Extracción

Introducir la membrana filtrante en un tubo de centrifugadora. Añadir 10 ml de acetona al

90%, agitar durante 1 minuto vigorosamente para disolver el filtro. Dejar el tubo en la oscuridad y
en frío de 5 a 10 horas de modo que permita la extracción de la clorofila, agitar de vez en cuando y
después centrifugar a 4000 rpm durante 5 minutos. Verter el líquido sobrenadante en una célula de
10 cm.

2.2.3.3. Medidas

Efectuar las medida en el espectrómetro a las longitudes de onda de 750, 663, 645 y 630
nm después de haber regulado el aparato con la disolución de acetona al 90%.

2.2.3.4. Expresión de los resultados

Restar la lectura efectuada a 750 nm de las otras 3 medidas:

E1 es la medida a 663 nm después de la corrección.

E2 es la medida a 645 nm después de la corrección.
E3 es la medida a 630 nm después de la corrección.

Los contenidos de clorofila a, b y c se obtienen a partir de las fórmulas siguientes:

v
clorofila a (µg / l) = (11.64 • E1 − 2.61 • E2 + 0.10 • E2 ) •
l • Vg
v
clorofila b (µg / l) = (20.97 • E2 − 3.94 • E1 + 3.66 • E3 ) •
l • Vg
v
clorofila c (µg / l) = (54.22 • E3 − 14.81 • E2 + 5.53 • E1 ) •
l • Vg

v = volumen de acetona (ml)

l = longitud del trayecto óptico de la cubeta (cm)
Vg = volumen de agua filtrada (l)

2.3. Determinación de fosfato

2.3.1. Metodología

Este método se aplica a la determinación de fósforo inorgánico u ortofosfatos. Se basa en la

reacción en medio ácido entre el anión fosfato disuelto y el molibdato amónico en presencia de
tartrato de K y Sb, para generar ácido fosfomolíbdico el cual es reducido mediante ácido ascórbico
generando una coloración azul debida al Mo y susceptible de determinación colorimétrica.

2.3.2. Material y reactivo

- pipetas aforadas de 2, 5 y 10 ml.

3
- 8 Matraces aforados de 50 ml
- 1 vaso de precipitado de 1 L
- Probeta de 100 ml
- 1 vaso de precipitado de 250 ml
- 1 matraz de 500 ml
- 2 vaso de precipitado de 100 ml
- 2 matraz de 100 ml
- 1 vaso de precipitado de 500 ml
- Espectrofotómetro
- Cubeta de 1cm
- Disolución de ácido sulfúrico 5 N: Diluir 70 ml de de H2SO4 concentrado (98%) sobre agua
hasta un volumen final de 500 ml. Realizar la operación con cuidado y lentamente para evitar
proyecciones.
- Disolución de molibdato amónico al 4%: Disolver 20 g de molibdato amónico en agua y diluir a
500 ml.
- Disolución de ácido ascórbico 0.1 N: Disolver 1.76 g de ácido ascórbico en agua destilada y
enrasar a 100 ml. Esta disolución es fácilmente alterable y ha de prepararse cada vez que se
vaya a utilizar.
- Disolución de tartrato doble de potasio y antimonio: Disolver 0.2743 g de tartrato antimónico
potásico en agua destilada hasta 100 ml.
- Reactivo mixto: Mezclar 50 ml de disolución de sulfúrico 5N, 30 ml de disolución de ácido
ascórbico, 15 ml de disolución de molibdato amónico y 5 ml de disolución de tartrato. Desechar
este reactivo si presenta coloración azulada o verdosa. El reactivo mixto es estable durante 24
h. Guardar en frasco de color topacio.
- Disolución stock de fosfato de 50 ppm: Disolver 0.2196 g de fosfato di-hidrógeno potásico en
agua hasta un volumen de 1 l.

2.3.3. Procedimiento

Preparación de la recta de calibrado: En una serie de matraces numerados de 50 ml introducir

sucesivamente, en el siguiente orden:

Nº de los matraces B 1 2 3 4
Disolución patrón de 50 ppm de PO43-(ml) 0 0.5 1 2 3
Agua destilada (ml) 35 35 35 35 35
Reactivo mixto (ml) 8 8 8 8 8

Enrasar con agua destilada y esperar 10 minutos a que se desarrolle el color. Efectuar las
lecturas en el espectrofotómetro frente a blanco a 882 nm. Representar y calcular la recta de
calibrado, relacionando valores de absorbancia frente a concentraciones de fosfato.

Determinación de fosfatos en agua: En un matraz de 50 ml introducir sucesivamente, en el

siguiente orden:

Nº de los matraces A
Agua problema (ml) ?
4
 Agua destilada (ml) 30
Reactivo mixto (ml) 8

Dejar que se desarrolle el color y llevar a un volumen final de 50 ml en un matraz aforado. Medir la
absorbancia en el espectrofotómetro a 882 nm.

2.3.4. Cálculos

La concentración de fosfatos se determina a partir de la recta de calibrado cuya ecuación se

obtiene por el método de los mínimos cuadrados.

2.4. Determinación de nitrato

2.4.1. Método de la brucina

2.4.1.1. Metodología

El anión nitrato reacciona con brucina en medio ácido sulfúrico, formando un color que
cambia rápidamente a amarillo. El color amarillo es debido a un producto de oxidación de la
brucina, la cacotelina, y sirve de base para la determinación espcetrofométrica de nitrato.

2.4.1.2. Material y reactivos

- Espectrofotómetro
- Cubetas para medida de las absorbancias
- Pipetas graduadas de 1 ml 5 ml y 10 ml
- 8 matraces de 50 ml
- 2 matraces de 100 ml
- 1 matraz de 1000 ml
- 1 pesasustancia
- 1 matraz de 100 ml
- Acido sulfúrico concentrado
- Reactivo brucina-ácido sulfanílico: Disolver 1 g de brucina y 0.1 g de ácido sulfanílico en
unos 70 ml de agua destilada caliente. Añadir 3 ml de ácido clorhídrico concentrado. Dejar enfriar,
diluir y enrasar a 100 ml con agua destilada.
- Disolución madre patrón de nitrógeno nitrato de 1000 mg/l: Disolver 1.629 g de nitrato
potásico en agua destilada y llevar a 1 litro.
- Disolución hija patrón de nitrógeno nitrato de 100 mg/l (Prepararla cada día)

2.4.1.3. Procedimiento

Preparación de la recta de calibrado: En una serie de matraces numerados de 50 ml

introducir sucesivamente:

Número de los matraces B I II III IV V

Solución hija patrón de 100 mg/l de NO3- (ml) 0 1 2 3 4 5

Agua destilada (ml) 5 5 5 5 5 5

5
 Reactivo Brucina-ácido sulfanílico (ml) 1 1 1 1 1 1

Colocar los matraces en un baño de agua

Acido sulfúrico concentrado (ml) 10 10 10 10 10 10

Dejar en la oscuridad 10 min

Diluir con agua destilada hasta 45 ml, aproximadamente

Dejar en la oscuridad 15 min (hasta adquirir la temperatura ambiente)

Correspondiente en mg/l de NO3- 0 2 4 6 8 10

NOTA IMPORTANTE: AÑADIR EL ACIDO SULFURICO LENTAMENTE Y CON

MUCHO CUIDADO

Enrasar con agua destilada. Efectuar las lecturas en el espectrofotómetro frente al blanco a 410 nm.

Determinación de nitratos: En un matraz de 50 ml introducir sucesivamente:

Número de matraz A

Problema (ml)

Agua destilada (ml) 5

Reactivo Brucina-ácido sulfanílico (ml) 1

Colocar los matraces en un baño de agua

Acido sulfúrico concentrado (ml) 10

Dejar en la oscuridad 10 min

Diluir con agua destilada hasta 45 ml, aproximadamente

Dejar en la oscuridad 15 min (hasta adquirir la temperatura

ambiente)

Enrasar con agua destilada. Medir la absorbancia en el espectrofotómetro a 410 nm.

2.4.1.5. Cálculos

La concentración de nitratos se determina a partir de la recta de calibrado cuya ecuación se

obtiene por el método de los mínimos cuadrados.

2.4.1.6. Observaciones

Interfieren los oxidantes o reductores fuertes. Los iones del hierro y el manganeso
tetravalente interfieren ligeramente cuando se encuentran presentes en cantidades a 1 mg/l. Los
nitritos no interfieren en presencia de ácido sulfanílico.

2.4.2. Determinación de nitratos mediante absorción-UV

2.4.2.1. Metodología
6
 Las medidas de absorbancia-UV a 220 nm permiten la determinación de nitratos, que son
absorbentes a esta longitud de onda. No obstante, dado que las materias orgánicas también pueden
hacerlo a esta longitud de onda, se debe hacer una segunda lectura a 275 nm para obtener la
medida relativa sólo a nitratos.

2.4.2.2. Material y reactivos

- Espectrofotómetro UV
- Cubeta de cuarzo de 1 cm
- Agua destilada exenta de nitratos
- Disolución de HCl 1 N
- Disolución patrón concentrade de 200 ppm de nitratos
- Disoluciones diluidas de nitratos con concentraciones comprendidas entre 1 y 10 ppm,
obtenidas por dilución de la concentrada.

2.4.2.3. Procedimiento

A 50 ml de disolución diluida de nitratos y/o agua problema filtrada para eliminar materias
en suspensión, añadir 1 ml de HCl 1 N. Mezclar.

Medir la absorbancia de las disoluciones a 275 nm y multiplicarla por dos, restar la

absorbancia a 220 nm y construir la curva de calibrado.

2.4.2.4. Cálculos

De la curva de calibrado se obtiene la concentración de la muestra.

2.5. Determinación de sulfato

2..5.1 Fundamento

El método se basa en la medida de la turbidez producida por la reacción de

precipitación del ion sulfato con una sal bárica en medio ácido. La precipitación se lleva a cabo en
condiciones tales que se forman cristales de sulfato de bario de tamaño uniforme, que deben
mantenerse en suspensión homogénea un periodo de tiempo suficiente para medir la turbidez.

2.5.2. Material y reactivos

- 2 Matraz aforado de 100 ml

- 7 matraces aforados de 50 ml
- Pipetas graduadas de 1, 5, 10 y 25 ml
- pi-pump de 2, 10 y 25 ml
- 1 vaso de precipitado de 100 ml
- 1 pipeta pasteur
- Espectrofotómetro UV-Visible
- Cubeta de 1 cm
- Disolución madre patrón de sulfato de 1000 ppm: disolver 1.4792 g de sulfato sódico
anhidro en agua destilada y enrasar hasta 1 l
- Disolución patrón de sulfato de 100 ppm: llevar 10 ml de la disolución anterior a un matraz
7
 aforado de 100 ml y enrasar con agua destilada.
- Disolución de goma arábiga al 5%: disolver 5 g de reactivo sólido en agua caliente,
enrasando a unos 100 ml. Dejar enfriar.
- Disolución de cloruro de bario estabilizado: Disolver 10 g de cloruro de bario en 20 ml de
goma arábiga y agua destilada y enrasar hasta 100 ml. Dejar reposar durante 1 hora, filtrar.
- Disolución de HOAc 1/10

2.5.3. Procedimiento

En una serie de matraces numerados de 50 ml introducir sucesivamente, en el siguiente

orden:

Nº de los matraces B 1 2 3 4
Disolución patrón de 100 ppm de SO42-(ml) 0 5 7.5 10 15
Agua destilada (ml) 20 20 20 20 20
Acido Acético 1/10 (ml) 1 1 1 1 1
Disolución de Cloruro de Bario estabilizada (ml) 5 5 5 5 5
2-
Concentración en mg/l de SO4 0 10 15 20 30

Agitar 2 ó 3 veces energéticamente. Después de 15 minutos de reposo, agitar de nuevo y

efectuar las lecturas en el espectrofotómetro frente a blanco a 650 nm.

Determinación de sulfatos en agua: En un matraz de 50 ml introducir sucesivamente, en

el siguiente orden: 10 ml de extracto, 20 ml de agua destilada, 1 ml de la disolución de HOAc y 5
ml de la disolución de cloruro de bario estabilizada. Agitar 2 ó 3 veces energéticamente. Después
de 15 minutos de reposo, agitar de nuevo y efectuar las lecturas en el espectrofotómetro frente a
blanco a 650 nm.

2.5.4. Cálculos

Determinar la concentración de sulfatos en la muestra de agua a partir de la recta de calibrado.

Expresar la concentración de sulfatos como mg SO42- /l.