UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA

DEPARTAMENTO DE FITOPATOLOGIA
LABORATÓRIO DE BACTERIOLOGIA DE PLANTAS
36.571-000 VIÇOSA - MG – BRASIL

CONSTATAÇÃO DA PRODUÇÃO DE BACTERIOCINAS POR

ISOLAMENTOS DE BACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS

Reginaldo da Silva Romeiro, PhD

Professor Titular da UFV

TELEFONE:(O31)899-2620 - FAX:(031)899-2240 - E-Mail: rromeiro@mail.ufv.br

 Introdução

Bacteriocinas têm sido conceituadas como substâncias produzidas por bactérias e que
são capazes, em baixas concentrações, de inibir a multiplicação de outras bactérias
taxonomicamente afins (Brock, 1974; Jack et al., 1995; Riley, 1998; Stanier et al., 1986). São
elas, consequentemente, antibióticos por definição (Davies, 1990; Klement et al., 1990;
Kurylowicz, 1981; Riley, 1998; Romeiro, 1995). Originalmente essas substâncias eram
denominadas "colicinas" pois a maioria das pesquisas eram conduzidas com isolamentos de
Escherichia coli mas, após a constatação de que sua síntese era comum outros grupos
bacterianos, Jacob et al. (1953) cunharam o termo mais genérico bacteriocina para designá-
las.

Histórico

Em conformidade com Jack et al. (1995), já no final do Século IXX, Pasteur e Joubert
relataram a ocorrência de interações antagonísticas entre bactérias, ao observar que um
isolamento bacteriano (talvez E. coli) era capaz de interferir com o crescimento de Bacillus
anthrax. Da mesma forma, Babes, citado pelos mesmos autores observou, em 1985, a
inibição de Corynebacterium diphteriae por um isolamento de Staphylococcus sp., isolamento
esse que passou a ser utilizado no tratamento de difteria na época, sob forma de nebulizadores
para aplicação nasal (Florey, 1946). Contudo, foi o trabalho pioneiro de Gratia (1925) o
primeiro claramente elucidadtivo sobre bacteriocinas, ao encontrar que um isolamento de E.
coli produzia, em meio líquido de cultura, uma substância termoestável e dializável, capaz de
inibir, em baixas concentrações, o crescimento de outro isolamento da mesma espécie. É
possível que esse tenha sido o passo inicial para o estudo das bacteriocinas (Jack et al., 1995).

Natureza

Bacteriocinas geralmente são de natureza protéica (Stanier et al., 1986), variando de

polipeptídeos de baixo peso molecular como os sintetizados por espécies do grupo
corineforme fitopatogênico (Gross & Vidaver, 1979) a moléculas protéicas grandes e
particuladas como as produzidas por patovares de Pseudomonas syringae (Klement et al.,
1990; Smidt & Vidaver, 1986). No caso do isolamento K84 de Agrobacterium radiobacter,
usado comercialmente para o biocontrole da galha incitada por A. tumefaciens (Kerr, 1980), a
bacteriocina ("Agrocina 84") produzida não é de natureza protéica mas um análogo da adenina
(Figura 1b).

Síntese

A síntese de bacteriocinas parece ser codificada por gens localizados em plasmídeos,

na maioria dos casos estudados (Kerr & Tate, 1984; Stanier et al., 1986). Por exemplo (Figura
1a), o isolamento de K84 de A. radiobacter carrega o plasmídeo pAgK84 (para produção e
resistência à Agrocina 84) e o plasmídeo pAt84b, o qual permite a conjugação e transferência
do plasmídeo pAgK84 (Kerr & Tate, 1984; Ryder et al., 1987).

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Modos de ação

Células de estirpes sensíveis possuem em sua superfície sítios receptores que são
bioquimicamente reconhecidos pela bacteriocina (Jack et al., 1995; Riley, 1998), num
processo de complementaridade molecular, à semelhança de outras moléculas informacionais
(Lehninger, 1976). A partir desse processo de reconhecimento, o bacteriocina ganha o interior
da célula via processos ainda não muito bem esclarecidod e, dependendo da interação
microbiana em foco, múltiplos mecanismos de ação podem atuar, isolada ou
concomitantemente, ocasionando a morte de células sensíveis. Dentre esses, como
mencionado por Jack et al. (1995) e também por Riley (1998), a morte das células sensíveis
pode dar-se por alterações na permeabilidade do sistema de membranas, inibição de síntese e,
ou, degradação de ácidos nucléicos, interferência com a síntese de proteínas, bloqueio da
síntese de peptídeo-glicano, interferência com a geração de energia, comprometimento do
fenômeno de transdução, etc.

Significado Biológico

Em termos de ecologia bacteriana, assume-se que as estirpes produtoras possuem uma

vantagem adicional sobre aquelas incapazes de sintetizá-la e que a ela são sensíveis. Riley
(1998) considera isso uma "vantagem competitiva" quando microrganismos, por serem
taxonomicamente afins, possuem potencialidades bioquímicas e fisiológicas semelhante, para
disputarem nichos ecológicos no ambiente em que vivem. Em Fitopatologia, certas estratégias
de biocontrole de enfermidades ancoram-se na capacidade do antagonista ser produtor de uma
bacteriocina à qual o patógeno alvo é sensível (Ren et al., 1993; Stockwell et al., 1993;
Togashi et al., 1996; Yi & Son, 1993; Kerr, 1980; Kerr & Tate, 1984; Napoleão et al., 1998).

Procedimentos

Numa primeira tentativa, o cultivo da bactéria cuja capacidade de produzir

bacteriocinas tenciona-se investigar pode ser feito em um meio de rotina adequado, como por
exemplo o meio 523 de Kado & Heskett (1970). Contudo, Klement et al. (1990) lembram que
a produção pode ser função do meio de cultura utilizado, da idade da cultura e das condições
de incubação, podendo vir a ser necessário variar esses parâmetros para ajuste da metodologia.

1.Método da sobrecamada (Figura 2)

a) Cultivar os isolamentos cuja capacidade de produção de bacteriocinas deseja-se testar, em

meio líquido, por 24 h, a 25-28oC
b) Proceder ao semeio desses isolamentos em placas de Petri contendo o meio sólido. Para
tanto, com alça de repicagem, depositar uma gota de cada cultura em meio líquido, em
pontos eqüidistantes na superfície do meio.
c) Incubar as placas a 25-28oC até que as colônias apresentem crescimento bem evidente (24
a 48 h).
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d) Inverter as placas. Adicionar, com pipeta estéril, 1 ml de clorofórmio à superfície interna
da tampa de cada uma delas. Aguardar 20 minutos. Esse procedimento pode ser
substituído pela exposição da placa aberta a luz ultravioleta (UV, microbicida, λ = 254nm)
por 15-30 minutos (Huang et al., 1996; Iacobellis et al., 1995; Kairu, 1997; Romeiro,
1989; Romeiro et al., 1988; Siqueira, 1988; Siqueira & Romeiro, 1999).
e) Entreabrir as placas em ambiente assético durante 30 minutos para eliminação dos
resíduos de clorofórmio, quando for o caso.
f) Fechar as placas novamente e retorná-las à posição normal.
g) Adicionar a 5 ml de meio semi-sólido fundente, 0,1 ml da cultura ou culturas indicadora(s)
crescida(s) em meio líquido por 24 h a 25-28oC. Agitar cuidadosamente, girando o tubo
nas palmas das mãos, para homogeneizar sem permitir a formação de bolhas.
h) Verter os 5 ml de meio semi-sólido sobre a superfície das placas que contêm as colônias
previamente inativadas com clorofórmio ou UV. Cuidar para que o meio semi-sólido
forme uma camada homogênea quanto a espessura sobre toda a superfície do meio.
i) Incubar as placas a 25-28oC. Examiná-las após 1, 2 e 5 dias a fim de verificar a ocorrência
de halos de inibição (Figura 3)

2.Método de semeio por estrias (Figura 4)

Esse método, mais qualitativo que quantitativo, é útil quando se deseja testar um
grande número de culturas. Foi utilizado, por exemplo, por Moura (1996) e Moura et al.
(1995), para detectar atividade antimicrobiana em actinomicetos de solo contra R.
solanacearum. Sua grande vantagem é permitir testar vários isolamentos produtores e
indicadores, simultaneamente, na mesma placa.
a) Preparar placas contendo uma camada delgada de meio de cultura adequado ao
crescimento das estirpes produtoras.
b) Proceder ao semeio das poteciais indicadoras, em riscas paralelas e equidistantes,
de comprimento um pouco menor que o diâmetro da placa. Incubar sob condições
que favoreçam o bom desenvolvimento das estirpes
c) Proceder à morte das estirpes produtoras, como anteriormente descrito
(Clorofórmio, UV ou combinação dos dois).
d) Verter meio de cultura propício ao desenvolvimento das estirpes cuja
sensibilidade deseja-se testar, de modo a formar uma sobrecamada de 1mm de
espessura. Aguardar a solidificação.
Semear as estirpes indicadoras, por meio de estrias paralelas e equiditantes entre si, mas em
ângulo reto com as estrias anteriormente feitas na camada de baixo. Incubar e aguardar
descontinuidade de crescimento nas estrias da sobremacada, indicativas de produção de
bacteriocinas pela estirpe semeada na camada de baixo (Figura 5).

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 PRODUÇÃO DE AGROCINA K84
A O
||
B
R1 - O - P - NH
|
RESISTÊNCIA A AGROCINA K84 -O

N
N

N
N
Cromossoma pAgK84 R2 - O - CH2

R3 - O

Figura 1: Agrocina 84, uma bacteriocina produzida por Agrobacterium radiobacter. (a) -
Plasmídeo pAgK84, que contém gens que codificam para a síntese; (b) - Estrutura
proposta para a Agrocina 84, adaptada de Kerr (1980)

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 PLACA DE PETRI MEIO SÓLIDO CAMADA BÁSICA

P
E R
SEMEIO
S O
INCUBAÇÃO POR PONTOS
T D
I U
RADIAÇÃO
R T
UV (254nm)
P O
E R
I A
E N
S D
T I
I C INCUBAÇÃO
R
P
A
D
+ SOBRECAMADA
CAMADA BÁSICA
MEIO SEMI-
E O
SÓLIDO
R
A

Figura 2: Esquema explicativo do método de sobrecamada para detecção da produção de

bacteriocinas

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Figura 3: Produção de bacteriocina, detectada pelo método de sobrecamada, entre estirpes de
Rhizobium japonicum, observando-se nítido halo de inibição à direita. (Foto -
Cortesia do Prof. Sérvio Túlio Cassini - UFV)

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 Primeira Camada
Semeio das estirpes Incubação,
produtoras crescimento e morte
(UV ou CHCl3)

Segunda camada
Semeio das estirpes
Inibições indicadoras

Figura 4: Esquematização do procedimento para detecção de produção de bacteriocinas pelo

método de estrias ou riscas

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 Primeira Camada
Semeio das estirpes Incubação,
produtoras crescimento e morte
(UV ou CHCl3)

Segunda camada
Semeio das estirpes
Inibições indicadoras

Figura 5: Produção de bacteriocina, detectada pelo método de estrias, em que as produtoras

são actinomicetos e as indicadoras isolamentos de R. solanacearum. (Foto -
Cortesia da Profa. Andréa B. Moura, UFPel-RS)

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