Estudio de proteinas en fósiles

Concepción BORJA PEREZ

Universidad de Granada
Facultad de Medicina
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

RESUMEN

Los estudios de Biología Molecular, aplicados a la Paleontología y Paleoantropología, han permitido obtener
datos objetivos e independientes de las características fenotípicas para identificar e interrelacionar a las especies.
El hallazgo de Biomoléculas preservadas en el tiempo: (DNA y proteínas) ha hecho posible la caracterización
de restos fósiles y su localización en un lugar adecuado del árbol evolutivo. En este sentido, fueron los estudios
pioneros de Lowenstein los que demostraron la presencia de colageno especie-específico en fósiles de hasta 1,9
millones de años mediante técnicas inmunológicas.
En el presente trabajo mostrarnos la detección y caracterización, mediante técnicas Inmunes de albúmina
en un fósil con una edad de 1,6- 1,8 millones de años (VMO). La identificación y caracterización de la albúmina
fósil se realizó con antisueros policlonales frente a albúmina humana, albúmina de babuino y albúmina de caballo
mostrando el estudio de Semejanza Inmune la cercania de la albúmina detrectada en el fósil VMO con la albúmina
humana y albúmina de Babuino y su distanciamiento de la albúmina de Caballo. No obstante confirmarnos estos
resultados con Anticuerpos monoclonales frente a albúmina humana y descartamos la presencia de albúmina
contaminante. Para ello antes de proceder a la extracción proteica propiamente dicha en EDTA y acético,
"lavamos el fósil" en un medio salino como el PBS, con el objetivo de solublizar e identificar la posible existencia
de proteínas contaminantes no intimamente unidas al hueso.

1. ESTUDIO DE FOSILES: PALEONTOLOGIA Y PALEOANTROPOLOGIA

De forma tradicional el método de investigación de la Paleontología y Paleoantropología se ha basado en

el análisis de las formas, por lo que el estudio de huesos y dientes fósilizados se ha visto limitado al estado de
conservación anatómica, así como a las características individuales y dependientes del sexo. En consecuencia, se
han producido disputas irreconciliables al romper paradigmas o establecer nuevos criterios en la clasificación de
las especies. De ahí, la necesidad de introducir otras disciplinas con métodos de investigación objetivos, que hagan
posible la valoración de un fenómeno tan complejo como el estudio de restos fosilizados y, al mismo tiempo,
eliminen el componente subjetivo y emocional que siempre despierta el origen y evolución del hombre. Por todo
ello, es de suma importancia el estudio de relaciones filogenéticas en especies vivas, ya que sólo su conocimiento
servirá de guía y control para poder extrapolar relaciones filogenéticas en especies fósiles.

2. BIOLOGIA MOLECULAR EN ESTUDIOS FILOGENETICOS

Desde que Charles Darwin publicó en 1859 "El origen de las especies," y describió, por primera vez, como
los organismos evolucionan y las especies están relacionadas entre sí por antepasados comunes, los estudios
filogenéticos se han realizado mediante el estudio comparado de la anatomía, la fisiología y el comportamiento.
Pero es sólo cuando se introducen los análisis comparativos moleculares entre las secuencias de ácidos
nucleicos y proteínas, cuando se establece directamente el grado de divergencia genética, pues, en ellas se
encuentra escrita toda la información que caracteriza a un ser vivo. Esta es la razón por la que DNA y Proteínas
se utilizan para la construcción de árboles filogenéticos, ya que aportan datos objetivos e independientes de las
características fenotípicas para interrelacionar a las especies.
El estudio de DNA se ha hecho en base a secuenciación de nucleotidos, grado de hibridación, enzimas de
restricción o amplificación por PCR entre otras, mientras que en el estudio de proteínas ha sido la secuenciación
de aminoácidos, las propiedades electroforéticas y propiedades inmunológicas los pilares sobre los que se establece
el grado de homología o disparidad molecular. Los estudios sobre distancia genética molecular establecieron el
concepto de que la proporción de bases sustituidas en el DNA, o la cantidad de aminoacidos sustituidos en las

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proteínas, es una constante función del tiempo y, además, que el número de diferencias en la comparación del
DNA o proteínas de dos especies es una medida de su tiempo de divergencia frente a un ancestro común (Wilson
et al. 1977).
El estudio de Proteínas mediante técnicas inmunes permite evaluar el grado de similitud o disparidad
antigénica entre dos especies mediante una reacción antígeno-anticuerpo. Por tanto, la distancia inmune puede
emplearse para construir árboles filogenéticos a partir de proteínas homólogas (Fith and Margoliash, 1967;
Champion et al., 1974; Lowenstein, 1980). El RIA (radioinmunoanalisis) permitió a Lowenstein realizar árboles
de albúmina y colágeno en toda una serie especies, desde los primates a la anémona de mar (Lowenstein, 1981a).
Los árboles filogenéticos moleculares construidos a partir de distintas proteinas hornológas compararon organis-
mos tan diversos como levaduras, plantas, insectos, peces, reptiles y mamíferos proporcionando información
coherente sobre sus relaciones filogenéticas.

3. PALEONTOLOGIA MOLECULAR: PRESERVACION MOLECULAR EN FOSILES (PROTEINAS Y DNA)

Con la introduccion de la Biología Molecular y el estudio de DNA y proteínas en Paleontología y

Paleoantropología se propone por primera vez el estudio del registro fósil a partir de biomoléculas preservadas
en el tiempo.
La preservación molecular es un fenómeno, variable, dependiente basicamente, de la propia naturaleza de
las moléculas y del ambiente deposicional. El hallazgo de Carbohidratos, Proteínas y Acidos Nucleicos sólo se
consigue en ambientes protegidos de la actividad enzimática microbiana, ligado a la deshidratación de tejidos y
en ausencia de radicales libres, ya que son éstos los que inician el ataque oxidativo, provocando la ruptura
molecular. (Eglinton et al. 1991, Ambler et al. 1991).
Las proteínas fósiles contenidas en huesos, conchas y dientes sufren cambios, tanto en cantidad como en
calidad, con el paso del tiempo. Si un hueso fresco contiene un 20% de proteína en su interior, este porcentaje
queda reducido a 0,1% cuando se trata de huesos con miles de años (Wickoff, 1972).Y las moléculas proteicas
que permanecen sufren fragmentación, racemización de aa. y toda una serie de procesos de degradación que
hacen dificil obtener información. A pesar de ello, distintos análisis sobre huesos y dientes del Pleistoceno han
sugerido que el colágeno es una proteína capaz de resistir las vicisitudes de fosilización y tiempo geológico,
(Bucci et al., 1969; Wickoff, 1972), demostrando diferencias significativas con colágeno moderno, tanto en su
perfil cromatográfico (Armstrong et al., 1983) como en su estructura fibrilar bajo el microscopio electrónico
(Wickoff et al., 1963). Sin embargo, la falta de especificidad de estos estudios hace que no se puedan establecer
relaciones filogenéticas en especímenes fósiles.
En 1980 Lowenstein con un radioinmunoanálisis (RIA) obtiene información especie-específica de proteínas
fósiles y demuestra que, a pesar del tiempo y degradación, aún conservan parte de sus características inmunológicas
y suministran por tanto, informacion genética (Lowenstein 1981a). Con la introducción del RIA, técnica que
combina la sensibilidad de los métodos radiactivos con la especificidad de reacciones inmunológicas (Odell,
1971), se consiguió un método preciso para la detección y caracterización de proteínas, lo que la convirtió en
una técnica ideal para el estudio de proteínas en fósiles. Los datos bibliográficos muestran como la retención de
información específica abarca desde moluscos de 80 millones de años (Westroek et al., 1979) a toda una serie
de fósiles, tanto humanos corno animales, de distintas edades y procedencia geográfica.
Con un RIA en fase sólida, Lowenstein fue capaz de detectar colágeno y albúmina en fósiles tan viejos corno
1,9 millones de años (Lowenstein, 1981a). El estudio de colágeno inmunorreactivo, realizado por Lowenstein en
una serie de fósiles humanos con edades que oscilan entre 900 años aC. para una momia egipcia y un millón
cuatrocientos mil años para un Australopithecus robustus etíope, demuestra de una forma directa, la presencia de
proteínas con información especie-específica (Lowenstein, 1980a).
Por otra parte, las posibilidades de obtener información de proteínas en restos fósiles o arqueológicos no
quedan reducidas a colágeno y albúmina. En 1985, Ascenzi et al., 1985 hace un estudio de hemoglobina (Hb)
en huesos que comprenden edades dentro de un rango de 15 a 4.500 años, utilizando un método inmune
conocido como Dot-Blotting.
En 1987 es la osteocalcina la proteína elegida para el estudio de restos fósiles. En esta ocasión, el estudio
se realizó sobre huesos de bóvido de 12.000 años, 13 millones de años y el diente de un roedor de 30 millones
de años. El método analítico utilizado fue inmunológico, empleándose un RIA y un ELISA sobre placas de
polivinilo para la detección de osteocalcina (Ulrich d. al 1987).
En 1989, Patricia R. Smith y Michael Wilson desarrollan un ELISA para detectar y cuantificar hemoglobina

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de restos de cementerios romanos y medievales. Los resultados mostraron distintos patrones de reactividad y
concentración de hemoglobina por mgr. de hueso. Los estudios se continúan, y en 1992 Cattaneo analiza la
presencia de albúmina en toda una serie de restos óseos de diversa antigüedad. Las ¡nuestras proceden de huesos
de la Guerra Civil Inglesa (1644), Medievales (1.100-1.400), Primeros Sajones (450-600), Romanos (100-200),
Edad de Hierro (400 aC) y Edad de Bronce (2.200-1700 aC) (Cattaneo et al., 1992). Dentro del estudio se
incluyeron huesos frescos humanos y animales para que sirvieran de controles positivos y negativos respectiva-
mente. El ensayo se realizó corno un ELISA de inhibición no competitivo (Clark and Engvall 1981), utilizando
un Ac. monoclonal de la clase IgG anti albúmina humana especie-específico. Estos análisis no mostraron una
correspondencia entre la cantidad de proteína en estudio y la edad cronológica de los huesos (Cattaneo et al.,
1992), apreciándose cantidades de albúmina en los huesos de la Guerra Civil Inglesa muy próximos o iguales
a los encontrados en huesos de la Edad de Bronce.

4. OBETIVOS

Con estas perspectivas nos propusimos analizar mediante antisueros policlonales y Acs. monoclonales la
presencia de proteínas en los fósiles de Venta Micena, Cueva Umbría, Cueva Victoria y Atapuerca, con el objetivo
de identificarlas, caractrizarlas y determinar la especie-especificidad de las mismas. Utilizamos una metodología
con datos cuantificables y reproducibles que, evitaran el análisis subjetivo de los fósiles en estudio, algunos de
los cuales habian sido objeto de fuertes polémicas.

5. MATERIAL Y METODOS

Las muestras para análisis se tomaron de restos óseos fosilizados. En todo momento se mantuvieron con-
diciones de máxima esterilidad, utilizando mascarilla y guantes para la manipulación del fósil, y escalpelo para
la toma de muestra. Con el escalpelo se cortó o limó parte del fósil para obtener pequeños trozos o polvo de
hueso.

5.1. Extraccion de proteínas

El hueso fosilizado, una vez triturado y reducido a polvo, se puso a agitar con los medios de extracción en
tubos de vidrio de 20 ml. Una solución de EDTA (Merck, R.E Alemania) al 0,2 M, fue el primer medio
utilizado, ya que, al ser un quelante del calcio, desestructura la matriz ósea de hidroxiapatita cálcica en la que
han estado envueltas las proteínas, liberándolas para su análisis. Después de 10 dias en agitación continua y
temperatura ambiente se centrifugó durante diez minutos a 2000 rpm, obteniéndose dos medios de separación
bien definidos, uno constituido por el sobrenadante y, el otro, por un residuo sólido depositado en el fondo. El
sobrenadante se recogió con jeringa y se alicuotó en tubos de plastico de 0,5 ml (Beckman, E.E.U.U.), siendo
posteriormente guardado a -70° C. hasta su análisis. Por otro lado, el depósito sólido fue de nuevo resuspendido
en el siguiente medio, constituido esta vez por ácido acético (Panreac, España) al 0,5 M, con objeto de solubilizar
proteínas no solubles en la solución de EDTA, o que se hallasen íntimamente unidas al hueso. Corno en el caso
anterior y tras diez días de extracción en agitación continua, se centrifugó y aspiró el sobrenadante, siendo
alicuotado y almacenado hasta su estudio a -70° C. No obstante, para descartar la presencia de proteínas en
superficie o no íntimamente adheridas al hueso, modificamos el protocolo de extracción. Realizamos una nueva
toma de muestra, pero esta vez realizando un lavado previo del fósil en PBS antes de proceder a la extracción
proteica propiamente dicha en EDTA y acético. De forma simultánea a la extracción de los fósiles y con objeto
de evidenciar cualquier posible contaminación, las disoluciones de PBS, EDTA y acético fueron estudiadas en
todos los ensayos simultaneamente con los fósiles.

5.2. Estudio de proteinas en fosiles

Para el análisis de proteínas fósiles escogimos técnicas de enzimoinmunoanalisis (EIA) por su gran especi-
ficidad y sensibilidad, permitiendo evidenciar ng o pg de proteíena. El estudio se llevó a cabo mediante la técnica
ELISA, que se desarrolló en placas de Poliestitireno 96 pocillos y fondo en U, Nunc-inmuno-plate, maxisorp.
U 96. (Nunc. Dinamarca) Los fósiles fueron analizados de forma conjunta con una curva de calibración de la

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proteína en estudio, empleando para la construcción de la misma, concentraciones de proteína que oscilaron
desde, 1 pgr/m1 PBS hasta, 10 pg/M1 PBS.
La técnica se desarrolló en varias fases. La primera fue la incubación de la muestra en estudio, por lo que
100 X11/pocillo del extracto fósil, proteína estándar o controles fueron incubados durante tres horas a 37° C.
Transcurrido este tiempo, se lavó la placa tres veces con tampón de lavado (PBS-Tween 0,05 %) en un lavador
de placas atomático Bioteck (Cultek, España) y, a continuación, se procedió a bloquear con gelatina al 1%
(Merck, R_F.Akmania), durante 1 hora, a 37° C y, el resto, a 4° C durante toda la noche, para evitar las uniones
inespecíficas de los antisueros a la placa. De nuevo se lavaron los pocillos con tampón de lavado y se incubaron
100 X11/pocillo del primer antisuero, diluido en tampón de dilución (tampón de bloqueo diluido al 1/10 en
tampón de lavado), durante 1hr. a 37° C. Tras la incubación del primer antisuero, se retiró el sobrenadante,
eliminando de esta forma los Acs. no unidos al Ag, y, de nuevo, se volvieron a lavar los pocillos durante diez
veces en el lavador de placas automático. El siguiente paso fue la incubación, durante 2 hr a 37°C, de 100 111/
pocillo del segundo Ac. marcado con peroxidasa. Finalmente, los pocillos se lavaron diez veces y, para revelar la
reacción se añadieron 200 pl/pocillo del substrato ortodifenilendiamina dihidrocloruro: OPD (Sigma, St.Louis,
MO.) disuelto en tampón fosfato-citrato pH 5, acido cítrico 0,1 M (Merck, RE Alemania), fosfato disódico 0,2
M (Probus, España) y agua destilada más H202 (Panreac,España) al 0,02 %. La reacción enzimática se dejó
transcurrir durante 30 minutos en oscuridad y a temperatura ambiente. Se paró con 50 1.11 de ácido sulfúrico al
96 % (Panreac, España), diluido al 1/8 en agua destilada, y se leyó en un espectrofotóme a una longitud de
onda de 490 nm. (lector de placas Bioteck (Cultek, España). El estudio de proteínas fósiles se realizó tanto con
antisueros policlonales como con anticuerpos monoclonales dirigidos frente a albúmina e IgG. Las concentra-
ciones de los antisueros utilizados en los ensayos dependieron de la calidad de los mismos, haciéndose una
titulación previa a su uso.Tres antisueros policlonales dirigidos frente a albúmina humana, albúmina de babuino
y albúmina de caballo se produjeron en nuestro laboratorio para detectar, caracterizar y determinar especie-
especificidad de proteínas en fósiles.
El proceso seguido para la obtención de los antisueros policlonales anti albúmina humana, anti albúmina de
babuino y anti albúmina de caballo se realizó basicarnente en tres fases: Inmunización, Reinmunización y
Extracción sanguínea. La inmunización para producir antisueros específicos frente a albúmina se llevó a cabo en
ratones machos de la cepa BALB/c. Para ello, se preparó 1 mg de albúmina (Sigmia.St.Louis,M0), disuelto en
1 ml de PBS (PH 7.4) que fue mezclado y emulsionado con 1 ml de adyuvante completo de Freund (Sigma.
St Louis,MO ). De esta emulsión se le inyectó a cada ratón 0.2 ml (100 lig) por vía intraperitoneal. Las dosis
siguientes de reinmunización se practicaron con un intérvalo de tres semanas y con 0.2 ml de una solución de
1 mg/ml (100 lig) emulsionado en 1 ml de adyuvante completo de Freund por vía subcutánea. Por último,
después de tres dosis, se procedió a la extracción sanguínea, que se realizó a los tres días de la última reinmunización.
Los ratones fueron anestesiados con éter y, una vez dormidos, se procedió a sangrarlos. La sangre se extrajo del
plexo venoso retroorbitario, utilizando un capilar de cristal (Lane-petter, 1976). Se dejó coagular y posteriomente
fue centrifugada. El suero obtenido fue alicuotado y guardado a -70° C hasta su estudio.
Una vez obtenidos los antisueros policlonales mediante inmunización específica se titularon antes de su uso,
oscilando las concentraciones utilizadas en los distintos ensayos entre 1/3500 y 1/5000.
Por otra parte, la producción de anticuerpos monoclonales anti albúmina humana se realizó también en
nuestro laboratorio mediante la producción de hibridomas en ratones (García-Pacheco 1990). Con esta técnica
se consiguieron diez Acs. monoclonales, de los que fueron escogidos mega-1,' mega-2 y, mega-3 por su espe-
cificidad y sensibilidad en el estudio de albúmina humana. La purificación de los Acs. monoclonales se hizo
mediante Cromatografia de afinidad del líquido ascítico (Garcia-Pacheco 1990) estudiando asimismo un Ac.
monoclonal anti albúmina humana de la casa comercial Seralab denominado f-9 (Seralab, Gran Bretaña).
El estudio de IgG humana e IgG de caballo se realizó con antisueros de la casa comercial Sigma (Sigma,
St. Louis, MO). Los Acs monoclonales frente a IgG humana fueron: GG-7 y GG-5 que representan distintos
clonos de Acs dirigidos frente a distintos epítopos de de IgG humana.

5.3. Expresión de los resultados

Las técnicas empleadas en el análisis de fósiles son colorimétricas y expresan los resultados en mU de
absorbancia. La cuantificación de los resultados obtenidos en mU de absorbancia se transforman en ng de
proteína mediante la extrapolación de los mismos sobre la curva de proteína estándar de la muestra problema.
Asimismo, representamos los resultados en gráficas para valorar de forma conjunta la sensibilidad y detectabilidad
del antisuero con la curva de proteína, el extracto fósil y la reactividad inespecífica con PBS o background. Los

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 ESTUDIO DE PILOTEINAS EN FÓSILES

valores obtenidos frente a los fósiles se expresaron en ng/pocillo de proteína, aunque, en ocasiones, lo hicimos
en ng/mg de hueso para poder comparar huesos extraidos a distintas concentraciones (Fig. 1).

5.4. Expresión de especi-especificidad

La especie-especificidad determinada por métodos inmunes constituye uno de los datos más importantes en
el estudio de fósiles. Nosotros, para obtenerla hicimos reaccionar los extractos fósiles con antisueros frente a
albúmina de distintas especies. Las absorbancias obtenidas por ELISA se extrapolaron a las correspondientes curvas
de calibración, obteniendose distintos valores en ng de proteína, tanto más altos cuanto más cercano se encuentre
el fósil a la especie en estudio (Fig.-2).
En el estudio de albúmina, a partir de los datos obtenidos con el fósil frente a cada uno de los antisueros
policlonales se construyó el grado de Semejanza Inmunológica. La especie-especificidad representada como
semejanza inmune expresa la cercania o distancia del fósil con las especies en estudio, para ello, se divide el valor
máximo en ng de proteína por los otros valores obtenidos, representando, estos últimos, el distinto grado de
reactividad cruzada (Fig.-3).

6. RESULTADOS: ESTUDIO DEL CRANEO DE ORCE

6.1. Presencia de albumina en el craneo de Orce

La detección y caracterización de albúmina en el cráneo de Orce se realizó mediante el estudio de

reactividad de un antisuero policlonal anti albúmina humana con el extracto del fósil VMO (OSK). La cuantificación
de la albúmina detectada se determinó, extrapolando los resultados obtenidos frente al fósil en la correspondiente
curva de calibración de albúmina humana.

6.2. Presencia de albumina en los distintos extractos del fósil

El estudio de albúmina en el Cráneo de Orce se hizo en los dos medios utilizados para la extracción del
fósil: EDTA y acético. Como se puede ver en la Fig.-4 aunque en los dos casos se detectó la presencia de
albúmina, la cantidad obtenida en el extracto del fósil en EDTA fue superior a la obtenida en el extracto del
fósil en acético, lo que indica, que la mayor parte de proteína se elude en el primer paso de la extracción.

6.3. Influencia de la cantidad de hueso examinado

Comprobada la presencia de albúmina en OSK examinamos distintas concentraciones de hueso. Para ello,
realizamos dos extracciones de hueso paralelas en igualdad de condiciones, pero con concentraciones diferentes:
3mg/ml y lmg/ml. En la Fig.-5 se aprecia como la cantidad de albúmina detectada con un antisuero policlonal
anti albúmina humana es superior para el extracto fósil con mayor concentración.

6.4. Especie-especificidad de la albumina detectada en el cráneo de Orce

El estudio preliminar del cráneo de Orce con un antisuero policlonal anti albúmina humana había revelado
la presencia de albúmina (Fig.-4 y Fig.-5). No obstante, para descartar que estuviésemos detectando una reacción
cruzada con albúmina de alguna otra especie, se realizó de forma simultánea un estudio con tres antisueros
policlonales dirigidos frente a albúmina humana, albúmina de babuino y albúmina de caballo. La reactividad de
estos antisueros policlonales con OSK expresada en mU de absorbancia se extrapoló en las correspondientes
curvas de calibración. Los resultados representados en la Fig.-6 y expresados en ng de proteína permitieron
comprobar como los valores superiores se habían obtenido frente a anti albúmina humana, seguidos por anti
albúmina de babuino y anti albúmina de caballo, observando, sin embargo, que la intensidad de la reacción con
anti albúmina de babuino fue superior a la detectada con anti albúmina de caballo Fig.-6. Con objeto de
homogeneizar resultados y comparar las concentraciones de OSK con cada uno de los antisueros policlonales,
los valores obtenidos se expresaron corno Semejanza Inmunologica, lo que permitió realizar un estudio compa-
rativo y determinar especie-especificidad (Fig.-7). En la citada figura se observa, que la albúmina detectada en
OSK se encuentra más próxima a la albúmina humana, seguida de la albúmina de babuino y más alejada de la
albúmina de caballo.

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La Semejanza Inmune representada por la unidad se correspondió, en este fósil, con el antisuero anti
albúmina humana, frente al que se obtuvo la máxima reactividad en ng de proteína. Las reactividades frente a
los otros dos antisueros anti albúmina de babuino y anti albúmina de caballo son expresión de reactividad cruzada
y se representa por valores inferiores a la unidad (Fig.-7).

6.5. Reacción del cráneo de Orce con anticuerpos monoclonales anti albumina humana

Para confirmar los resultados obtenidos con antisueros policlonales, decidimos realizar un estudio con
anticuerpos monoclonales anti albúmina humana. Una bateria de Acs. monoclonales formados por niega-1,
niega-2, mega-3 y f-9 se emplearon para tal análisis.
Los resultados con OSK mostraron positividad para todos los Ac. monoclonales, si bien, la reactividad y
concentración de la albúmina detectada estuvo en relación con el Ac. en estudio. En la Fig.-8, Fig-9, Fig.-10
y Fig.-11 se puede valorar de forma individual la forma de reaccionar de los Acs. monoclonales anti albúmina
humana mega-1, mega-2, mega-3 y f-9 con el extracto fósil OSK.
La distinta reactividad de los Acs. monoclonales con OSK queda representada en la Fig.-12 corno ng de
albúmina/mg de hueso. En esta figura se pone de manifiesto, al realizar un estudio comparativo con el antisuero
policlonal anti albúmina humana, cómo mega-1, que es el Ac. monoclonal más dehil, es sin embargo, el que
reacciona relativamente con mayor intensidad con OSK, seguido por mega-3 y f-9. En contraste, niega-2, que
es un Ac. con reactividad marcada frente a albúmina humana nativa, es el que reacciona de forma menos intensa,
lo que se debe probablemente, a la distinta reactividad de los Acs. monoclonales con la albúmina fósil.

6.6. Detección de albumina en el cráneo de Orce en comparación con hueso fresco y hueso
reciente

Cuando comenzamos el estudio de fósiles seguirnos el protocolo descrito por Lowenstein en 1980 para
detectar y caracterizar próteinas. Como él ya habia descrito, Utilizamos una solución de EDTA para desestructurar
la malla osea y proceder a la extracción proteica. Sin embargo, cuando identificamos albúmina humana en el
craneo de Orce, pensamos que quizás, estuviésemos detectando proteínas no pertenecientes al hueso, procedentes
del contacto con la mano o saliva del manipulador. Para descartar la presencia de estas proteínas modificamos
el protocolo de extracción y procedimos a analizar la pieza craneal de forma secuencial en tres medios distintos
:1°PBS (medio salino), 2°EDTA (quelante del calcio) y por último acético. El objetivo fue lavar al hueso en
un medio salino (PBS) antes de su estudio para solubilizar proteínas en superficie o no intimamente unidas al
mismo.
Los huesos como se puede ver en la Fig.-13 fueron estudiados de forma consecutiva en tres medios, PBS,
EDTA y Acético. Los resultados obtenidos con el fósil tras modificar el protocolo de extracción, son comparados
con los resultados de un hueso humano fresco (h. quirurgico) y un hueso occipital humano reciente, procedente
del departamento de cirugia y sus especialidades, (alrededor de 10 años,) ambos extraidos y analizados en las
mismas condiciones. En la Fig.-13 se representan los valores para los distintos huesos en cada uno de los medíos
estudiados.
En ella se aprecia, cómo el hueso quirúrgico humano y el hueso reciente contienen albúmina en los tres
medios: PBS, EDTA y acético. La detección de albúmina en PBS indica que al menos parte de la proteína se
encuentra en superficie o no intimamente unida al hueso y, probablemente proceda de sangre remanenente que
es lavada con facilidad en PBS. Por el contrario, el fósil OSK, no presenta albúmina en el extracto de PBS, la
mayor parte de esta proteína se detecta en el extracto de EDTA, lo que nos indica, que la albúmina detectada
se encontró intimamente ligada al hueso. Las cantidades de albúmina en este medio fueron muy elevadas en hueso
fresco, aunque OSK presentó valores en EDTA próximos al hueso reciente estudiado.

6.7. Estudio de albumina en la tierra de Orce

Tierra del estrato sedimentario donde se encontró el cráneo de Orce fue analizada mediante un antisuero
policlonal anti albúmina humana para comprobar si en ella se detectaba la presencia de albúmina. Como se puede
ver en la Fig.-13 esta proteína no se encuentra en el medio físico donde apareció el fósil.

6.8. Estudio de otras proteinas: IgG

Al igual que la albúmina, la inmuniglobulina IgG fue estudiada en el extracto fósil de Venta Micena VM-
O (OSK).

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Como se puede ver en la Fig.-14 y Fig.-15 se utilizaron dos Acs. monoclonales frente a IgG humana: GG-
5 y GG-7. La reactividad de estos anticuerpos frente a OSK fue baja, poco discriminativa y sólo ligeramnete
superior al background. Por lo que considerarnos a este fósil dudoso para la citada proteína.

7. DISCUSION

Con la introducción de la biología molecular en los estudios filogenéticos de especies vivas y especies fósiles
se abren nuevas vías de conocimiento para comprender el origen y evolución de las especies. En este sentido,
los análisis comparativos moleculares de ácidos nucleicos y aminoácidos han ayudado a aclarar algunas discrepan-
cias y paradojas existentes en la evolución y, bajo este punto de vista, el estudio molecular de fósiles es del
máximo interés, ya que permite la caracterización de dichos restos y la localización en un lugar adecuado del
árbol evolutivo (Lowenstein et al., 1981)
Los trabajos publicados por Lowenstein en 1981, en los que describió la presencia de colágeno y factores
del suero, mediante técnicas inmunes, en fósiles de hasta 1,9 millones de años (Lowenstein, 1981a), nos animaron
a plantearnos la detección y caracterización de biomoléculas en los fósiles encontrados en Venta Micena, algunos
de ellos de dificil clasificación.
Lo primero que buscamos fue una técnica que permitiera detectar cantidades exiguas de proteínas y la
técnica ELISA inicialmente nos pareció la más adecuada por su elevada detectabilidad y especificidad. La segunda
cuestión fue decidir el tipo de proteína a estudiar. Ya que, si bien el colágeno era la proteína más abundante en
hueso, presentaba el gran inconveniente de ser una proteína conservada; es decir, poco evolucionada y con gran
homología entre especies. Sobre todo, los colagenos de especies cercanas que apenas se diferencian entre sí y,
por tanto, ofrecen una discriminación molecular más inexacta y dificil. Un caso semejante al colágeno era la
osteocalcina, otra proteína abundante en hueso que había sido detectada en fósiles de bóvidos de alrededor de
12.000 años, así como en el diente de un roedor de 30 millones de años (Ulrich et al., 1987), pero, al igual que
el colágeno, era una proteína muy conservada. La albúmina, por el contrario, es ideal en los estudios de
evolución, puesto que ha experimentado modificaciones importantes a lo largo del tiempo, existiendo diferencias
marcadas entre especies; es decir, es una proteína muy evolucionada (Wilson et al., 1977), lo que permite
discriminar adecuadamente incluso especies muy relacionadas. Esta característica, junto con la de ser una
proteína con alta concentración en tejidos la conviertieron, en nuestro objeto de estudio para detectar, carac-
terizar y determinar especie-especificidad en fósiles.
Aunque diversos autores habían estudiado albúmina en huesos arqueológicos, con una edad entre 1.000 y
4.500 años (Cattaneo et al., 1992), Lowenstein, en 1981, sugiere la ausencia de esta proteína en restos óseos
fosilizados, por considerar que la albúmina es una proteína soluble, posiblemente "lavada" en un corto periodo
de tiempo. Sin embargo, es este mismo autor el que observa factores del suero en fósiles de millones de años
(Lowenstein, 1981a) y describe, posteriormente, la presencia de albúmina asociada a restos minerales, en sedi-
mentos cristalizados de orina de rata, con 20.000 años (Lowenstein et al., 1991). Pero son los trabajos de Prager
los que muestran cómo la albúmina es afectada por los cambios diagenéticos y se producen alteraciones de
tamaño, carga y solubilidad, que modifican «sus características físico-químicas y antigénicas, provocando entre
otros factores, la pérdida de solubilidad (Prager et a/.1980). Desde nuestro punto de vista, esto representaría un
mecanismo indirecto de preservación molecular, al facilitar el atrapamiento de esta proteína en la red de hidroxiapatita
cálcica del hueso. Esta posibilidad fue la que nos determinó a hacer un estudio de albúmina, aunque la mayor
parte de las publicaciones sobre detección de proteínas séricas en fósiles, correspondiera a especímenes de "sólo"
unos cuantos miles de años.
No encontramos apenas datos bibliográficos en referencia a estudios de proteínas en fósiles tan antiguos (1.8
millones de años), a excepción de los trabajos de Lowenstein en 1980 y Ulrich en 1987. Por otro lado, aunque
en los últimos años habían proliferado los estudios de DNA en tejidos blandos de distintas especies animales y
vegetales con millones de años eran muy escasos los estudios de DNA en hueso, siendo los trabajos pioneros
de Catherine Hánni (Hánni et al., 1990), Erika Hagelberg (Hahelberg et al.,1991), Satoshi Horai (Horai et al.,
1991) y Meijer et al., 1992 sobre huesos de 150 a 5.500 años los que aportaron alguna luz sobre información
genética, a partir de DNA, en restos óseos preservados.
De todas formas, como ya hemos comentado, se habían publicado algunos trabajos sobre la detección de
proteínas plasmáticas, mediante métodos inmunes, en restos óseos arqueológicos de unos pocos miles de años
(Ascenzi y Brunori, 1985; Smith y Wilson, 1989; Cattaneo, 1992). En general, destacaríamos que estos estudios
se centraron en un pequeño número de huesos de la misma especie en los que no se determina especie-

55
 BORJA PÉREZ, C.

especificidad de la proteína detectada. Por lo tanto, cuando iniciamos nuestro trabajo, a la carencia de bibliografía
se sumó la escasez de datos sobre el material estudiado, y el que éste perteneciera a huesos relativamente jóvenes.
Estas consideraciones previas acerca de los estudios moleculares en fósiles nos hicieron pensar, en primer
lugar, que debíamos efectuar un amplio muestreo de los mismos para disponer de un volumen global lo
suficientemente extenso como para poder sacar conclusiones fiables y, en segundo lugar, que el estudio debía
abarcar diversos parámetros que nos permitieran un análisis en profundidad. Por todo, decidirnos el estudio de
huesos de diferente especie, edad, y yacimiento (Venta Micena, Cueva Umbría, Cueva Victoria y Atapuerca),
incluyendo el estudio de dos proteínas evolucionadas: albúmina e IgG.
El estudio de especie-especificidad en los fósiles lo realizamos con antisueros policlonales frente a albúmina
e IgG de distintas especies animales. Para ello, extrapolamos la reactividad de los antisueros con los fósiles, medida
en naU de absorbancia, a la correspondiente curva de calibración de la proteína estándar, obteniendo distintos
valores en ng de proteína, tanto más altos cuanto más cercano se encuentre el fósil a la especie frente a la que
va dirigido el antisuero. Pero, a diferencia de Lowenstein (Lowenstein, 1980a), que expresa los resultados en
tanto por ciento de captación del segundo Ac., nosotros lo hicimos en ng de proteína. En nuestra opinión, la
forma de expresar Lowenstein los resultados supone, implicitamente, considerar una homogeneidad en la
potencia de los primeros antisueros empleados en la identificación de las proteínas, mientras que con la extrapolación
sobre la curva de calibración comparamos antisueros aunque estos presenten distinta potencia. La especie-
especificidad en términos de Semejanza Inmunológica, la expresamos para albúmina, al igual que Lowenstein,
en razón del grado de reconocimiento de los antisueros con los fósiles, pero, de nuevo, y a diferencia de éste,
lo hicimos en ng de proteína. Sin embargo, después de un amplio analisis sobre huesos de diferentes yacimientos,
especies y edades, en algunos fósiles la presencia de proteínas fue exígua y obtuvimos resultados poco discriminativos,
mientras que en otros, observamos patrones de reactividad frente a los antisueros poco específicos, por lo que
destacaríamos la presencia de fósiles positivos, fósiles negativos y fósiles de dificil clasificación. No obstante, en
este trabajo como sintesis y modelo de los estudios de proteínas en fósiles presentamos los resultados y discusión
de uno de los fósiles más polémicos: "El Cráneo de Orce" (OSK).

7.1. Cráneo de orce

Al iniciar el estudio inmunológico de las proteínas fósiles del cráneo de Orce, el problema estaba claramente
planteado desde el punto de vista paleontológico. El cráneo de Venta Micena sólo podía pertenecer a un
homínido (Gibert, 1984; Gibert et al., 1987) o a un équido (Agustí and Moyá-Soló, 1987), por lo que, desde
el principio, los estudios se centraron en dos especies: hombre y caballo.
Los estudios realizados dentro del área de la paleontología, para determinar la identidad de este fósil, han
sido muy diversos. Desde el análisis morfométrico comparativo con distintas especies animales (Gibert et al.,
1989) hasta el análisis fractal, que indica como las suturas del fragmento craneal de Venta Micena quedan
comprendidas dentro del entorno de variación de los representantes infantiles del género Horno analizados (Gibert
y Palmqvist, 1995). Asimismo, desde el punto de vista inmunológico, el estudio del fósil OSK, mediante un
antisuero policlonal anti albúmina humana, reveló la presencia de albúmina en los dos medios utilizados en la
extracción: EDTA y acético. Comprobamos que la mayor cantidad de albúmina se detectaba en EDTA, aunque
seguimos evidenciando, en menor cantidad, albúmina en acético (Fig.-4). Estos resultados pusieron de mani-
fiesto que la proteína, fundamentalmente, se había eluido en el primer paso de la extracción; si bien, el hecho
de detectar albúmina en una extracción posterior, de acético, nos sugería una intima unión al hueso de la
proteína detectada .
Por otro lado, dos extracciones independientes del fósil en EDTA, pero con distinta concentración, OSK-
3 mg/nal y OSK-1 mg/ml, mostraron un paralelismo entre la cantidad de hueso examinada y los valores
obtenidos de albúmina, según se puede ver en la Fig.-5. No obstante, en una tercera extracción de OSK-5 mg/
nal (Fig.-13), no encontramos un nuevo aumento en la cantidad detectada, lo que atribuimos a un menor
rendimiento en la extracción de proteínas, probablemente debido a un incremento en la concentración del fósil.
El estudio de especie-especificidad en el fósil VM-0 mostró que la albúmina detectada no pertenecía a un
équido y se encontraba, sin embargo, cercana a la albúmina humana (Fig.-6). El estudio de Semejanza Inmune
con albúminas de diferentes especies, nos permitió comprobar, asimismo, la cercanía de la albúmina detectada
en OSK con la albúmina humana y albúmina de babuino, y su distanciamiento de la albúmina de caballo (Fig.-
7). El estudio de dos extracciones independientes de OSK por Lowenstein confirmó nuestros resultados. Este
autor, al igual que nosotros, muestra como OSK reacciona de forma más intensa con un sueropoliclonal anti
albúmina humana que con un suero policlonal anti albúmina de caballo (Lowenstein, comunicación personal).

56
 ESTUDIO DE PROTEINAS EN FÓSILES

La detección de albúmina cercana a la humana en este fósil, mediante antisueros policlonales, se ratificó con
una batería de anticuerpos monoclonales anti albúmina humana, que previamente habían sido estudiados con
albúmina de caballo para descartar su reactividad con esta proteína.
Los análisis con los distintos Acs. monoclonales anti albúmina humana mostraron que se detectan cantidades
variables de albúmina en función del anticuerpo utilizado (resultados representados de forma individual en las
Fig.-8, Fig.-9, Fig.-10, y Fig.-11).
Los Acs. monoclonales permiten examinar una zona muy restringida del antígeno (epítopo), integrada por
una secuencia de entre 6 y 10 aminoácidos. Por lo tanto, su aplicación en el estudio de proteínas fósiles tiene
el interés de que la mayor o menor reactividad obtenida es un índice del estado de mejor o peor preservación
de los epítopos reconocidos (Borja et al., 1992). Así parece demostrarlo el hecho de que los monoclonales mega-
1 y mega-3 reaccionen de forma más intensa frente a la albúmina fósil, que el monoclonal f-9 y mega-2
12), cuando es este último uno de los que reacciona más intensamente con la albúmina nativa. Nosotros
interpretamos esta distinta reactividad como expresión de que los epítopos reconocidos por niega-1 y niega-3
deben estar mejor preservados en el fósil que los detectados por mega-2 y f-9. En contraste con estos resultados
frente a los monoclonales, el valor obtenido frente al antisuero policlonal anti albúmina humana fue intermedio,
lo cual estaría en relación con la mezcla de los distintos anticuerpos que lo forman y que le permiten reconocer
simultaneamente diferentes zonas del antigéno, unas mejor preservadas que otras (Fig.-12).
No hemos podido establecer en este punto estudios comparativos con otros autores y, en este sentido, sólo
destacaríamos la detección por Cattaneo et al., 1991, de albúmina humana mediante un Ac. monoclonal en
huesos de la edad de Bronce. Pero no conocemos ningun trabajo donde se realice de forma conjunta un estudio
de reactividad con distintos Acs. monoclonales, a fin de determinar la preservación de los distintos epítopos
reconocidos.
A pesar de los datos expuestos, en los que definimos la especie-especificidad de la albúmina encontrada en
el fósil OSK y confirmamos la presencia de albúmina cercana a la humana mediante Acs monoclonales, decidimos
que era importante descartar la presencia de albúmina contaminante. Para ello, realizamos una segunda toma de
muestra y extracción de proteínas, pero, esta vez, antes de proceder a la extracción propiamente dicha en EDTA
y acético, lavamos el fósil en un medio salino como el PBS, con el objetivo de identificar la posible existencia
de proteínas contaminantes no intimamente unidas al hueso (material y métodos).
El análisis comparativo de los valores de albúmina en el fósil con un hueso fresco y un hueso reciente,
extraídos según protocolo modificado en PBS, EDTA y acético, demostró como estos dos últimos huesos tienen
albúmina en superficie, que es facilmente "lavada" en un medio salino como el PBS. A diferencia de ellos, el
fósil OSK no presentó ni rastro de proteína en este medio salino (Fig.-13). La albúmina detectada en PBS en
el hueso fresco y hueso reciente no se debe, evidentemente, a la contaminación exógena, sino a la sangre
"atrapada" en ambos tipos de huesos. La albúmina procedente de esta sangre atrapada, en un hueso como OSK
con el tiempo, o es lavada o se integra en la matriz mineral durante el proceso de fosilización. Es por ello, que
no detectamos esta proteína en la extracción del fósil con PBS. El hecho de que sólo detectemos albúmina
cuando desestructuramos la malla ósea de hidroxiapatita calcica con un quelante del calcio como el EDTA, nos
indica que esta proteína se encuentra intimamente integrada en el hueso y su procedencia no es exógena.
Hay un dato que nos llama la atención, y es que las cantidades de albúmina, en EDTA, del fósil y un hueso
reciente (occipital) son similares (Fig.-13). Para comprender este fenómeno hay que valorar los especiales mecanismos
de preservación acontecidos en el yacimiento de Venta Micena y que han propiciado la fosilización de OSK, en
contraste con los mecanismos naturales de destrucción que afectan a los huesos en el cementerio. Normalmente,
la albúmina detectada en el hueso reciente está destinada a desaparecer de seguir su evolución natural, de ahí
que las cantidades sean bajas. Sólo circunstancias especiales que impidan su destrucción facilitarán que conserve
sus características morfológicas y, en algunos casos también, sus características biológicas contenidas en las
biomoléculas. Basicamente, la capacidad fosilífera del yacimiento de Venta Micena, se debería al rápido enterra-
miento de los huesos en un medio fangoso con ambiente reductor, tal y como lo demuestra la ausencia de estrías
en los huesos por mecanismos de insolación (Gibert, 1992). Esta sería una posible explicación, pero no la única,
para comprender las cantidades relativamente altas de albúmina en los fósiles. El hecho de que técnicas electroforéticas
y de isoelectroenfoque con las que hemos tratado de "visualizar" las proteínas del OSK en extractos concentrados
de este fósil no hayan permitido evidenciar ninguna banda (resultados no presentados), nos sugiere que las
cantidades detectadas reflejan valores superiores a los reales, debido, probablemente, al estado de desnaturalización
en que estas proteínas se encuentran. De hecho, nosotros hemos comprobado experimentalmente que hay un
incremento de reactividad en la albúmina desnaturalizada frente a su homológa nativa. En principio, nos pareció
un resultado paradójico, puesto que una proteína desnaturalizada pierde o altera parte de sus epítopos antigenicos,

57
 BORJA PÉREZ, C.

y su reactividad con los Acs debería disminuir. Pero, si tenemos en cuenta que los estudios se han realizado
mediante ELISA en placas de poliestireno y, que la adhesividad de las proteínas al plástico es un fenomeno con
un rendimiento inferior al 100 16, se puede comprender, que cualquier factor que aumente este rendimiento
producirá de forma paralela un aumento en la detectabilidad de la proteína.
Y esto es precisamente lo que proponen Ishikawa et al., 1980 y Conradie et al., 1983 para explicar el
aumento de detectabilidad en proteínas desnaturalizadas, un aumento de la adhesividad de las proteínas al plástico
dependiente de las modificaciones sufridas en sus caracteristicas hidrofóbicas. Este fenómeno puede explicar la
detectabilidad de las proteínas fósiles a pesar de que se encuentren en muy bajas concentraciones.
El estudio se completó con el análisis de la tierra del estrato sedimentario donde fue encontrado el cráneo
mediante un antisuero policlonal anti albúmina humana. En la Fig.-13 se muestran los valores obtenidos para la
"tierra" en relación con las cantidades de albúmina para OSK. La ausencia de proteína en este medio nos
permitió descartar albúmina contaminante en la matriz de arena en la que el cráneo había estado enterrado.
En una segunda etapa nos decantamos por el estudio de IgG mediante dot-blotting cuantificado, con la
extracción de proteínas según protocolo modificado. Los resultados de OSK en la detección de IgG humana
mediante los Acs monoclonales GG-5 y GG-7 mostraron valores bajos y cercanos al background, por lo que no
hemos podido establecer datos definitivos con respecto a esta proteína (Fig.-14 y Fig.-15).

8. CONCLUSIONES

1.- Las proteínas pueden ser extraídas, detectadas y caracterizadas en huesos fósiles de hasta 1,6-1,9 millones
de años mediante técnicas inmunes como ELISA y Dot-blotting. Así, se ha podido establecer la cecanía
inmunológica del fósil OSK con la especie humana, aunque otros fósiles no han podido ser identificados por
métodos inmunes.
2.- A lo largo de nuestro estudio hemos comprobado, que aunque la edad del fósil puede influir en la
cantidad de proteínas detectadas, nosotros al igual que otros autores, no encontramos una relación directa entre
ambas variables.

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59
 BORJA PÉREZ, C.

3000 - ESPECIE - A

2400 ' 1500

curva estandar
1200
1800 - —19— curva estandar
8
900
— — backg.

600
teactividad con fósil ti fósil • fó sil
ng. detectados en fósil
600 - 300

backEound
O

01 11) 100
0.1 1 10 100
ng. de proteína

ng. de proteína ESPECIE - B

Fig. 1. Representación esquemática de resultados. En 1500

la gráfica se puede valorar de forma conjunta la

reactividad inmune de un antisuero con la curva de 1200
5 --e— curva estandar
E
proteína estándar, la reactividad con el fósil y la
900
reactividad inespecífica con PBS o background. En le backg.
eje de abscisas se expresan los resultados como ng. de e
600
3g • fósil
proteína y en el eje de ordenadas como mU de
fósil
absorbancia. 300

01 ID 100

ng. de proteína
Fig. 2. En esta figura se representa la distinta reactividad
ESPECIE - C
de un fósil hipotético con tres antisueros dirigidos fren-
te a una proteína de la especie A, B y C. La extrapolación
indica que el fósil se encuentra más proximo a A y más 1500

alejado de C.
1200
—e— curva standar

3 900
e — backg.

600
• fósil

FUSIL 300

o
1.00 01 10 l00

ng. de proteína
• 0.80

Fig. 3. Estudio de similitud inmune de un

0.60
T fósil en relación con la reactividad presentada
1 con tres antisueros dirigidos frente a una pro-
•^, 0.40 teína de las especies A, B y C. A la máxima
T
cc reactividad frente a un antisuero se le asigna el
0.20 valor 1. La reactividad frente a los otros dos
antisueros se expresa en tanto por 1 y se co-
0,00 rresponde con la reactividad cruzada.
A B C

60
 ESTUDIO DE PROTEINAS EN FÓSILES

anti albúmina humana

3200
—e— alb.humana
2560

— backg. anti albúmina humana

1920
e
.o
• as k (id ta
1280 3200
746

640 Á osk acet.

I 2560
alb. humana
E
(1
0.1 10 'E 1920
100 z — backgr.

albúmina humana (ng) 1280

7.46 • osk

Hg. 4. Estudio de reactividad, mediante ELISA, de un 640

antisuero policlonal anti albúmina humana frente a

dos extractos de cráneo de Orce en EDTA y acético O
0.1 1 10 100
(3 mg de hueso/mi). Los números sobre la curva in-
dican ng de albúmina detectados en el fósil.
albúmina humana (ng)

anti albúmina humana anti albúmina babuíno

3200 3200

alb. humana
2560 6.13 2560
S 5 alb. babuino
E E
— backg.
1920 1920
5 — backg,
"11o • osk-3 -e
.> 1280 1280
1 • osk
640 • osk-1 3.06
640

o
o
1 10 100
0.1 1 10 100

albúmina humana (ng)

albúmina babuino (ng)

anti albúmina caballo

Fig. 5. Estudio de reactividad, mediante ELISA, de
un antisuero policlonal anti albúmina humana frente 3200
a dos extractos de cráneo de Orce en EDTA (3 mg
de hueso/mi) y (1 mg de hueso/mi). Los números
2560
sobre la curva indican ng de albúmina detectados en alb. caballo
z
el fósil. u 1920
a — — backg.
oo
128(1
• osk

640 0.28
Fig. 6. Reactividad de tres antisueros policlonales anti
albúmina humana, anti albúmina de babuino y anti
albúmina de caballo con un extracto de cráneo de
0.1 10 100
Orce en EDTA (3 mg/m1). Los números sobre la curva
indican ng de albúmina detectados en el fósil. albúmina caballo (ng)

61
 BORJA PÉREZ, C.

OSK mega-1

1 0I) 800

a
0.80 1,40
5 ▪ alb. humana
o E
o
5 0.60 480
5 — backg.
\T
320
E 0.40
• osk
r.51
160
0.20

0
(1.00
0.1 10 100
humana babuino caballo
ALBUMINA5
albúmina humana (ng)

Fig. 7. Semejanza Inmunológica del extracto de
cráneo de Orce en EDTA con albúmina humana,
albúmina de babuino y albúmina de caballo (resul-
tados obtenidos de 7 experiencias distintas).
Hg. 8. Estudio de reactividad, mediante ELISA, del
Ac. monoclonal anti albúmina humana mega-1 con
un extracto de cráneo de Orce en EDTA (3 mg.de
hueso/mi). Los números sobre la curva indican ng de
albúmina detectados en el fósil.

niega-2 mega-3

2500 1500

2000 1200
—o— alb. humana alb. humana
E
1500 900
— backg. •1
a backg.
1000
• osk
600 4.08
• osk
T
500
300

o
o
0.1 10 100
0.1 1 10 100
albúmina humana (ng)
albúmina humana (ng)

Hg. 9. Estudio de reactividad mediante ELISA del Ac.
monoclonal anti albúmina humana mega-2 con un ex-
tracto de cráneo de Orce en EDTA (3 mg.de hueso/mi).
Los números sobre la curva indican ng de albúmina
detectados en el fósil.
Fig. 10. Estudio de reactividad, mediante ELISA, del
Ac. monoclonal anti albúmina humana mega-3 con
un extracto de cráneo de Orce en EDTA (1 mg.de
hueso/m1). Los números sobre la curva indican ng de
albúmina detectados en el fósil.

62
 ESTUDIO DE PROTEINAS EN FÓSILES

f-9 mAb anti albúmina humana

300
60
250
9
—e— alb. humana

200 48
backg.
2 150
a • osk
36

100
ro

50 24

0.1 10 100 elg

1
E
albúmina humana (ng)
12

Fig. 11. Estudio de reactividad, mediante ELISA, del
Ac. monoclonal anti albúmina humana f-9 con un
extracto de cráneo de Orce en EDTA (1 mg.de hueso/
m1). Los números sobre la curva indican ng de albú-
mina detectados en el fósil.
fd
o
niega-1 niega-2 niega-3 f-9 poli-I poli - 3
Fig. 12. Estudio, mediante ELISA, de OSK con un
antisuero policlonal anti albúmina humana y los Acs
monoclonales niega-1, niega-2, mega-3 y f-9. Los
resultados se expresan en ng de albúmina mgr de hueso
para poder comparar extractos de fósil con distintas
concentraciones. Los valores del antisuero policlonal
con los extractos de OSK 1 mg y 3 mg en EDTA se
representan de forma conjunta para comprobar como
los valores son superponibles al expresar los resultados
corno ng /mg de hueso.

350
320 -
290
-260-
PBS
230
29 //'
EDTA
20

15 ACETICC
10

O
H. Fresco H. Reciente OSK Tierra

Fig. 13. Estudio comparativo de reactividad, mediante ELISA, de un antisuero policlonal anti albú-
mina humana con hueso fresco (5 mgs/rnl), hueso occipital reciente (3,5 mgr/ml de 10 arios), OSK
en EDTA(5 mgr/ml) y tierra del estrato sedimentario de orce(21 mgr/ml) en los medios de extrac-
ción PBS, EDTA y Acético. Los resultados se expresan en ng de albúmina / mg de hueso.

63
 BORJA PÉREZ, C.

GG-5

1500

1200
—e— IgG Human
E
900
backg.

600
nsk

300

0.1 1 10 100 Fig. 14. Estudio, mediante dot-blotting cuantifi-

cado, de OSK con el antisuero monoclonal anti
IgG humana (ng) IgG humana GG-5.

GG-7

2500

2000
—a— IgG humana
E

1500
ro backg.

1000
ro • osk

500

Fig.-15. Estudio, mediante dot-blotting cuantifica-

do de OSK con el antisuero monoclonal anti IgG 0.1 10 I00
humana GG-7.
IgG humana (ng)

64