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PRESENTAN:
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INTRODUCCIÓN
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Objetivo:
Hipótesis:
Marco teórico
Esta clasificación incluye las mezclas de ambos tipos, tal como las de almidón y
policaprolactona, ya comercializadas en el primer mundo.
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La velocidad de la biodegradación depende de la flora microbiana, la temperatura,
la humedad y la presencia de oxígeno. Los microorganismos no segregan
enzimas capaces de romper las uniones químicas de las macromoléculas
poliméricas que constituyen los plásticos sintéticos commodities más usados
comúnmente, en su mayoría derivados del petróleo.
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d) Bajos niveles de metales pesados, y la ausencia de efectos negativos
sobre la calidad del compost obtenido en la biodegradación y un compost
normal, no teniendo que existir diferencias de resultados bajo las mismas
condiciones.
Producción industrial de PHA:
La producción a nivel industrial de bioplásticos representa una desventaja ante los
creados a base de hidrocarburos ya que estos son hasta veces más costosos en
su producción que los plásticos comunes. Sin embargo se ha tratado de diseñar
día con día procesos efectivos y de bajo costos para su generación entre uno de
los mas efectivos podemos mencionar el siguiente:
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Selección de la bacteria:
La selección de la bacteria se basa en distintos factores como peligrosidad al
manejarse, alimentación, manejo de la misma y rendimiento ante los resultados
esperados para esto nos basamos en la siguiente tabla:
Pseudomonas:
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Con el reciente análisis de secuencias del RNAr 16S se han definido la taxonomía
de muchas especies bacterianas y como resultado, el género Pseudomonas
incluyen algunas cepas clasificadas anteriormente dentro de las Chryseomonas y
Flavimonas Otras cepas clasificadas previamente en el género Pseudomonas,
ahora son agrupadas en los géneros Burkholderia y Ralstonia.
Reactivos:
Caldo Nutritivo
Caldo Lactosado
Caña de Azúcar
Sacarosa
Sulfato de Amonio
Fosfato Dibásico de Potasio
Sulfato de Magnesio Heptahidratado
Fosfato Monobásico de Sodio
Ácido Cítrico
Violeta de Genciana
Yodo Lugol
Solución Alcohol – Cetona
Safranina
Solución Amortiguadora Buffer
Solución de Yodo
Solución de Cloro
Solución del Número de Mc Fandell
Solución patrón 0.313 N
Solución HCl 0.1 N
Solución de NaOH 3 N
Solución de Microelementos
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• Sulfato de Fierro 2 g/l
• Cloruro de Manganeso Tetrahidratado 0.03 g/l
• Cloruro de Calcio Dihidratado 2 g/l
• Cloruro de Cobre Dihidratado 0.01 g/l
• Sulfato de Zinc Heptahidratado 0.1 g/l
• Ácido Bórico 0.3 g/l
• Cloruro de Cobalto Sextahidratado 0.2 g/l
• Cloruro de Níquel Sextahidratado 0.02 g/l
• Molibdato de Sodio Dihidratado 0.03 g/l
Material y Equipo:
Gradilla
Soporte universal
Pinzas para bureta
Bureta
3 Matraces Erlenmeyer
Agitador magnético
Tubos de ensaye con tapa
Crioviales
Balanza digital
Espátula plana
Espátula acanalada
8 vidrios de reloj
Cinta testigo
Pipetas
Perilla
Autoclave
Incubadora
Propipetas
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3 matraces volumétricos de 1 lt.
3 matraces kitazato con tapón bihoradado
3 Termómetros
3 Pipetas volumétricas rotas rellenas con algodón
Manguera
1 Bomba para pecera
Centrífuga
Microscopio
Portaobjetos
Cubreobjetos
Baño María
Refrigerador
Asas Bacteriológicas
Pinzas Morh
4 Mecheros Bunsen
pHmetro
Papel destraza
Procedimiento:
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Imagen 1 (interior autoclave)
• Con una sola asada se inocula en 15 tubos de ensaye con caldo nutritivo y
se mantiene en la incubadora durante 24 hrs. a 35ºC.
Para el bioreactor:
• Se colocan los matraces kitazato dentro del baño maría que deberá
contener agua suficiente para cubrir el interior de los mismos.
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Imagen 2 (Bioreactor)
Para el medio de cultivo:
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Imagen 3 (Bioreactor)
Estrategia de la Fermentación:
• A las pipetas volumétricas rotas se les agrega algodón para que de esta
manera funcionen como un filtro para la entrada de aire, (si el tamaño de la
pipeta no es suficiente para que la pipeta cubra el nivel del medio de cultivo
en el bioreactor, se coloca un trozo de manguera el cual debió haber sido
esterilizado previamente en solución de yodo).
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Imagen 5 (Comienzo de estrés a los Mios)
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Imagen 8 (Secado de bacterias para tinción Gram)
• Lavar abundantemente.
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Imagen 10 (Adición de Yodo-Lugol en tinción de Gram)
• Lavar abundantemente.
• Lavar abundantemente.
• Cubrir con safranina durante un minuto.
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Imagen 12 (Adición de safranina en tinción de Gram)
• Lavar abundantemente.
• Observar a inmersión en el microscopio.
Determinación de la biomasa
• La biomasa se determinó de forma indirecta mediante el Número de
McFandell, de esta manera se puede conocer la cantidad existente en
millones de colonias dentro del cultivo.
2 0.2 gr 9.8 ml
3 0.30 gr 9.7 ml
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• Se centrifugó el caldo de fermentación durante 45 minutos a 5000 r.p.m., y
congeló a -15ºC.
Imagen 13 (Centrifuga)
Técnica que faltó por realizar
Observaciones:
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En el bioreactor correspondiente a la concentración de 10 gramos de caña de
azúcar se observó después de efectuarse la fermentación que la formación de
“espuma” a diferencia de los otros dos casos fue mucho mayor.
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Imagen 16 (Matraz con 25 gramos de caña observación de la bacteria)
Resultados Obtenidos:
Tinción de Gram: Se ve que la cepa es en realidad Pseudomona pp, Gram
negativa.
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Número de McFandell: Esta parte nos fue indicando el crecimiento de las
bacterias a través de la comparación de la turbidez de cada Número de McFandell
con cada etapa del proceso indicando el aproximado del número de colonias
formadas en cada etapa.
Conclusión:
En base a los resultados obtenidos durante el proceso, se determinó que la mejor
concentración delas tres estudiadas es la de 30 gramos de caña de azúcar, para
el desarrollo de la Pseudomona pp por que existe una mayor cantidad de
nutrientes, pero no nos resulta adecuado para la generación del polímero, ya que
para ello nos resultó más eficiente la concentración de 20 gramos, esto se aprecia
en el precipitado obtenido en los crioviales.
Bibliografía:
• Cortázar, J. y Malagón, D. 2001. Evaluación experimental de tres métodos
de recuperación de tres polímeros biodegradables del tipo PHAs
sintetizados por Pseudomonas. Trabajo de Grado. Universidad Nacional de
Colombia. Bogotá, Colombia.
• Barbosa, M, Espinosa A, Malagón D y Moreno N. 2005 Producción de
Poli-β-hidroxibutarato PHB Por Ralstonia eutropha ATCC 17697.
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Universitas Scientiarum,Pontificia Universidad Javeriana, Revista de la
Facultad de Ciencias.
• Duarte, A. 1995Introducción a la Ingeniería Bioquímica. Facultad de
Ingenieria, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia.
• http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/MicrobeWiki
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Anexos:
CALCULOS:
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Solución de Hidróxido de Sodio (NaOH) al 3 N:
1 14.8
2 14.7
3 14.9
Promedio= 14.8
1 7.5
2 7.5
3 7.5
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Promedio= 7.5
Apéndices:
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de
peptidoglucano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara
interna de la pared celular y unida a la membrana plasmática, se encuentra el
ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado
solamente en el peptidoglucano
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