FIJACION NO SIMBIOTICA DEL NITROGENO

MICROBIOLOGIA.

Bioquímica de la fijación del nitrógeno

La fijación del nitrógeno es un proceso reductor y el amoníaco es

el primer producto detectable de dicho proceso. Suponiendo que cada vez
se transfieren dos pares de electrones, podrían formarse como productos
intermediarios diimida e hidracina.

La fijación biológica del N 2 es efectuada por las bacterias de vida

libre o algas verde azules que hacen uso del N 2 por medios no
simbióticos y por asociaciones simbióticas compuestas por un
microorganismo y una planta superior.

Los siguientes organismos sean capaces de llevar a cabo la fijación

de nitrógeno : una gran variedad de actinomicetos, cepas de hongos de
los géneros Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Mucor, Penicillium y
Phoma, muchas levaduras y especies de varios géneros bacterianos.

a) Bacterias Aerobias: Azomonas, Azotobacter, Beijerinckia,

Derxia, Methylomonas, Mycobacterium, Spirillum.

b) Bacterias Anaerobias Facultativas: Bacillus, Enterobacter,

Klebsiella.

c) Bacterias Anaerobias : Clostridium,Desulfotomaculum,

Desulfovibrio.

d) Bacterias Fotosintéticas: Rhodomicroblum, Rhodopseudomas y

Rhodospirillum de las bacterias púrpuras no sulfurosas;
 Chloromatium y Ectothiorhodospira de las bacterias púrpuras
sulfurosas; Clorobium de las bacterias verdes sulfurosas.

e) Algas Verde-Azules: Anabaena, Anabaenopsis, Aulosira,

Calothrix, Cylindrospermum, Fischerella, Gloeocopsa,
Hapalosiphon, Lyngbya, Mastigocladus, Nostoc, Oscillatoria,
Plectonema, Scytonema, Stigonema, Tolypothrix,
Trichodesmium, Westeiellopsis.

Mecanismo de la fijación asimbiótica de nitrógeno.

Virtanen y Laine (1939) suponían que el mecanismo de la reacción
mediante la cual fijan nitrógeno los Azotobacter y Rhizobium es
problamente el mismo.
Fijadores libres.

El descubrimiento de los fijadores libres es contemporáneo del de

los simbióticos y se debe a WINOGRADSKY, quien en 1885 observó un
aumento progresivo del nitrógeno combinado en muestras de suelo al que
había añadido una solución nutritiva de azúcar; aisló, por último, a partir
de estos cultivos de enriquecimiento primario, una bacteria anaerobia
estricta, esporulada, capaz de desarrollarse indefinidamente en un medio
desprovisto de nitrógeno combinado, y a la que dominó Clostridium
pasteurianum.

Poco después, BEIJERINCK y VAN DELDEN(1902)aislaron unas

bacterias aerobias estrictas que presentaban la misma propiedad, y a las
que denominaron Azotobacter, describiendo varias especies (A.
Chroococcum y A. Agilis). Después se han descrito otras especies más de
este mismo genero(A. Vinelandii, A. Indicus, A. Beijerinckii). Son
bacterias gramnegativas, de gran tamaño y forma ovoidal; las
mayores( A. Chroococcum) miden de 2 a 3u por 3 a 6 u.
AZOTOBACTER

Todas las azotobacterias son aerobias estrictas y aparentemente

poseen la más alta tasa respiratoria que se conoce.

Estas bacterias utilizan pocos compuestos nitrogenados: N 2 , amonio,

nitrato, nitrito, urea, y ocasionalmente, una molécula que contenga
nitrógeno orgánico. Los miembros de este genero son mesófilos y su
temperatura óptima cercana a los 30 ºC. Cuando las cepas de Azotobacter
utilizan la forma gaseosa del elemento, la ganancia de Nitrógeno puede
exceder 1.0 mg de nitrógeno por mililitro de medio de cultivo.

La bacteria fijadora de N 2 que se encuentra con mayor frecuencia en

suelos de regiones templadas. Las densidades de Azotobacter varían de
cero a varios miles por gramo y no es común encontrar cifras que
sobrepasen 103 , siendo aún más raro encontrar valores que exceden 104
por gramo en suelos de la zona templada y en muchas de las zonas
tropicales. La escasez de estos organismos en tales sitios, indica que no
son un constituyente importante para la fijación de N 2 .
El genero Azotobacter(del francés azote, nitrógeno, y del griego
bakterion, bastoncillo)

Células sin endosporas , Bacilos relativamente grandes, o incluso

cocos, a veces casi con aspecto de levaduras. El tipo de flagelación de
éste genero se ha establecido definitivamente como peritrical. Aerobios
estictos, gramnegativos, que se desarrollan habitualmente en pelicula
sobre la superficie del medio nutritivo; fijan nitrógeno atmosférico si se
les proporciona carbohidrato u otra fuente de energía. Crecen mejor en
medios con escaso nitrógeno; son bacterias del suelo y del agua.
Se han identificado tres especies: Azotobacter chroococcum, A.
Agile y A. Indicum.
 Horner y Allinson (1994)han formado que, en ausencia de nitrógeno
atmosférico, estas bacterias pueden asimilar varios compuestos
nitrogenados orgánico, entre ellos urea, ácido aspártico, asparagina ,
adenina y ácido glumático.
Se distinguen varias especies presentes en distintos hábitats. Todas
las especies son gram-negativas, de tamaño relativamente grande y en
condiciones determinadas son móviles por flagelación peritrica. Son
estrictamente aerobias y oxidan muchos compuestos orgánicos.
Las células de Azotobacter chroococcum se disponen de dos en dos.
En el caso de Azotobacter y de algunas otras bacterias se requiere
molibdeno para llevar a cabo la fijación de nitrógeno.
El amoníaco reduce la fijación de nitrógeno.

ESPECIES DE AZOTOBACTER Y HABITAT DE LAS MISMAS

Tamaño y Características Procedencia y
Especie
forma coloniales hábitat
3,11.2um
Mucosas, de coloración
A. chroococcum generalmente Suelo
oscura producen cistes.
de dos en dos.
3,3. 2,8 um Segregan un pigmento
A.agile Canales y
aislados o de amarillo de
grutas
dos en dos. fluorescencia blanca.
Grandes, mucosas;
3,4.1,5 um Segregan un pigmento
A. vinelandii generalmente amarillo de Suelos
de dos en dos. fluorescencia verde;
forman cistes.
En suelos
ácidos,
A. Indicum Grandes, mucosas,
2 um. principalmente
(Beijerinckia) incoloras.
lateríticos, pH
5,0.
 Los azotobacter, al igual que los demás fijadores no fototrofos, son
quimioheterotrofos. Utilizan como fuente de carbono y energía una gran
variedad de ácidos orgánicos, de azúcares y de sus derivados alcohólicos
como el manitol, que es el sustrato más empleado para aislarlos y
cultivarlos. La fijación del NH 2 es una propiedad facultativa, inhibida
por el nitrógeno amoniacal, el cual es utilizado de modo preferente
cuando se encuentra en el medio. La fijación del nitrógeno es inhibida
también por presiones parciales elevadas de 02 y se favorece con
condiciones microaerófilas. La cantidad de N 2 fijado por Azotobacter es
aproximadamente el doble que la fijada por los clostridios, y del orden
de 20mg por gramo de azúcar metabolizado (WILSON y BURRIS, 1953).

BEIJERINCKIA
Las especies de Beijerinckia son también fijadoras aerobias de N 2 ,
pero sólo crecen bien en condiciones ácidas y algunas veces se
desarrollan a un pH tan bajo como 3. Las especies de Beijerinckia se
encuentran en suelos tropicales y se han aislado cepas en Sudamérica,
Asia, Norte de Australia y áreas tropicales de Africa; su número varía de
unos pocos a varios miles por gramo. Beijerinckia raramente se
destribuye en suelos de la zona templada.

DERXIA
De igual manera, Derxia es un género aerobio, ácido tolerante y
crecerá en un medio con Ph de 5 a 9. En suelos de Asia y Brasil se han
detectado cepas de Derxia, pero el grupo ha recibido escasa atención.

CLOSTRIDIUM
Los anaerobios dominantes que utilizan N 2 son miembros del genero
Clostridium. Las poblaciones de Clostridios fijadores de N 2 en terrenos
de cultivo pueden ser tan pequeñas como 102 o tan grandes como 105 por
gramo .Bajo algunas condiciones se han detectado 106 clostridios por
gramo. Las especies dominantes que utilizan N2 parecen ser C.
Pasteuranum, C. Butrycum y C. Acetobutylicum.
Los clostridios proliferan cuando se agrega materia orgánica y
frecuentemente son abundantes alrededor de las raíces de los vegetales.
En contraste con las azotobacterias, que generalmente son más
abundantes, los clostridios se encuentran en sitios con pH de 5.0 y son
capaces de crecer aun a pH de 9.0. La incorporación de N 2 , bajo
condiciones adecuadas, es apreciable y se fijan más de 180 ug de
nitrógeno por mililitro de medio de cultivo. La eficiencia es baja y sólo
de 2 a 10 mg de nitrógeno se asimilan por gramo de carbohidrato
consumido.
Clostridium pasteurianum(butyricum), bacilo móvil, anaerobio,
grampositivo y esporógeno; probablemente muy difundido en suelos ricos
en humus. Este microbio es capaz de fijar nitrógeno atmosférico en
pequeñas porciones. Otras quince especies, por lo menos de Clostridium
han resultado ser capaces de fijar nitrógeno.
Se ha observado que, además de C. Pasteurianum, también fijan N 2
otros muchos Clostridios (doce de las quince especies estudiadas), las
bacterias anaerobias sufatorreductoras (Desulfovibrio desulfuricans) y
formadoras de metano (Methanobacterium Omelianskii).
Es posible que el efecto principal de Azotobacter en la fertilidad de los
suelos se deba a otras causas distintas de la fijación de nitrógeno en
particular al hecho de que estas bacterias excretan factores de
crecimiento para los vegetales (giberelina) y sustancias antibióticas para
micorrizas patógenas (MISHOUSTINE, 1962).

ALGAS VERDES AZULES

Las algas verde-azules son comunes en campos bien drenados pero
son más abundantes en suelos inundados. Muchas algas verde-azules del
suelo crecen en soluciones de cultivo carentes de compuestos
nitrogenados y llevan a cabo un aumento en el contenido de nitrógeno del
medio.
 La fijación del nitrógeno realizada por las cepas activas se estimula
por incremento de la intensidad luminosa, aunque la luz en exceso es
inhibitoria. Invariablemente la transformación es lenta y una ganancia de
30 a 115 ug de nitrógeno por mililitro de solución requiere de 1 ½ a 2
meses para la mayoría de los aislamientos de Aulosira, Anabaenopsis,
Anabaena, Cylindrospermun, Nostoc y Tolypothrix. Por lo tanto, la
fijación es mucho menos más rápida que con azotobacterias o clostridios.
Algunas algas crecen lentamente en cultivos puros en la oscuridad, con
tal que haya azúcar que pueda utilizarse como fuente de carbono u
energía para el metabolismo heterótrofo, aunque las ganancias de
nitrógeno son pequeñas.

Es probable que la fijación de N 2 en la oscuridad, realizada por las

algas verde-azules, no sea de importancia ecológica. Algunas algas
verde-azules filamentosas, tales como Anabaena, Cylindrospermum y
Mastigocladus, poseen estructuras conocidas como Heteroquistis. Bajo el
microscopio de luz, es característico el heteroquiste con una pared
gruesa dando la apariencia de ser una célula vacía; sin embargo esta
célula tiene una función particular en las especies filamentosas, pues es
aquí donde ocurre la fijación activa del N 2 . A partir de los heteroquistes,
el nitrógeno es transferido fácilmente a células vegetativas adyacentes.

En algunas especies filamentosas que poseen heteroquistes también

es posible que las células vegetativas puedan metabolizar. Algunas algas
verde-azules filamentosas que no producen heteroquistes( Lyngbya,
Oscillatoria. Phormidium y Plectonema) y una forma unicelular no
heterosquística como Gloecapsa pueden utilizar N 2 .

LOS LÍQUENES
Los líquines pueden fijar N 2 , siempre y cuando estos contengan una
alga verde-azul. De los organismos que viven en simbiosis y constituyen
el liquen , el agua y el hongo, el primero es sin duda el que utiliza la
fuente gaseosa de nitrógeno. Los líquenes (clasificados como si fueran
organismos separados )tales como Collema, Lichina, Peltigera y
Sterocaulon asimilan de esta manera el N2, proceso que puede ayudar a
su crecimiento en hábitats costeros pobres en nitrógeno, como el
subártico, regiones áridas y dunas glaciales.

De la misma manera, las algas verde-azules son capaces de asimilar

N 2 cuando viven en simbiosis con algunas hepáticas, una pteridófita
(azolla), una angiosperma (Gunnera) y plantas clasificadas entre las
Cycadaceae.

BACTERIAS FOTOSINTÉTICAS FIJADORAS DE N 2

Las bacterias fotosintéticas fijadoras de N 2 se dividen en 3 grupos:
bacterias púrpura no sulforosas, bacteerias púrpura sulforosas y bacterias
verdes sulfurosas. Todas son afectadas favorablemente por la luz, pero
son inhibidas por el O 2 . La tasa de asimilación del N 2 por las bacterias
fotoautótrofas es muy lenta, requiriendose de períodos de semanas para
obtener ganancias de 100ug de nitrógeno por mililitro de medio de
cultivo.

LAS BACTERIAS PÚRPURA NO SULFUROSAS

Las bacterias púrpura no sulforosas se encuentran en suelos
anegados y en zanjas, cieno de lagos o fondos marinos, pero están
ausentes en tierras de cultivo o bosques . Sin embargo, cuando suelos de
los trópicos se inundan, algunas veces pueden florecer estas bacterias.
De esta manera, los campos de arroz de Asia pueden mostrar algunas
veces la presencia de 10 a 105 células de bacterias púrpura no sulfurosas
o de casi ninguna a 103 células de bacterias púrpura sulforosas por
gramo; algunas veces se han registrado cifras superiores.
KLEBSIELLA
Poco se sabe acerca de la ecología o frecuencia de otras bacterias
fijadoras de N 2 . Muchos aislamientos de Klebsiella catalizan la reacción,
pero la abundancia de este genero en la naturaleza no se ha estudiado
ampliamente. Sin embargo, en estudios individuales de suelos se ha
descubierto la presencia de 20 a 18,000 Klebsiella y menos de 103
células de Enterobacter y Bacillus por gramo potencialmente capaces de
utilizar N 2 . Algunas veces, Bacillus Polymyxa puede ser el principal
fijador de N 2 en ciertas regiones de la tundra de Alaska.

Fijación de nitrógeno por bacterias libres y por cianofíceas.

Hasta 1949 se consideró que la capacidad para fijar nitrógeno era
una característica limitada tan sólo a algunas bacterias principalmente a
miembros de los géneros Closridium y Azotobacter. Se sabe que muchas
otras bacterias también son cappaces de fijar nitrógeno molecular entre
las que se encuentran las bacterias fotótrofas y muchas cianofíceas, las
bacterias que producen metano y las que reducen los sulfatos, pero
también Aerobacter, Achromobacter y otras.

CIANOFITAS
No tiene que minusvalorarse la fijación de nitrógeno por parte de
las cianofíceas cuando menos en los campos de arroz (30-50 kg de
nitrógeno/ha/año).

En unas 40 especies de cianofíceas se ha comprobado la capacidad

de fijar nitrógeno en cultivo puro. Las cianofíceas se encuentran entre
los organismos colonizadores de suelos pobres(tierras volcánicas) y se
encuentran en lugares extremos del Antártico a temperaturas próximas al
punto de congelación y también en fuentes termales. Viven
independientemente o bien en simbiosis con hongos dando lugar a los
líquenes formados por cianofíceas.
FACTORES QUE AFECTAN LA FIJACION DE NITROGENO

Un gran número de factores ambientales rigen la taza y magnitud de

la fijación de N 2 no simbiótica y la transformación está marcadamente
afectada por las características físicas y químicas del hábitat.

En realidad, las sales de amonio son usadas preferentemente y

frecuentemente en una proporción más grande que el nitrógeno
molecular, por lo que la presencia de amonio inhibe en efecto la fijación.

Para el desarrollo de los microorganismos se necesitan muchos

nutrientes inorgánicos, solo algunos cuantos éstan implicados en el
metabolismo de N 2 , es decir son indispensables para la proliferación en
N 2 . Algunos se requieren en menos cantidades para el crecimiento en
sales de amonio o en otros compuestos de nitrógeno combinado. El
molibdeno; hierro, calcio y cobalto son críticos para la reacción de
fijación. El molibdeno se requiere para el metabolismo del N 2 ; pero los
microorganismos no usarán nitrato de la misma forma a menos que el
molibdato esté presente, aunque el requerimiento de molibdeno para la
utilización del nitrato es menor que la fijación N 2 .

Sin embargo, el crecimiento en sales de amonio se lleva a cabo

rápidamente en ausencia del molibdeno.
También se ha demostrado un requerimiento de calcio por algas
verde-azules y algunas especies de Azotobacter durante la asimilación
del N 2 , aunque el calcio puede ser reemplazado algunas veces por
estroncio.

El pH predominante tiene una marcada influencia en la abundancia

de estos organismos. Por ejemplo, Azotobacter es característicamente
sensitivo a altas concentraciones del ion hidrógeno.
 Su ausencia esta asociada directamente con el pH. Como regla
general los ambientes que presenta una acidez mayor a la de un pH de 6
están libres de organismos o contienen muy pocas azotobacterias. De
igual manera, las bacterias generalmente no crecerán ni fijarán N 2 en un
medio de cultivo que tenga un pH menor que 6.0.

Las especies de Beijerinckia no poseen la sensibilidad de las

azotobacterias a la acidez y se desarrollan y fijan el N 2 en intervalos de
pH de 3 a 9. Sin embargo, las algas verde-azules se desarrollan
pobremente en medios de cultivo y son escasas en suelos con acidez
mayor a un pHde 6.0.

Frecuentemente, la taza de fijación ésta determinada por la humedad

del suelo. Las ganancias son insignificantes cuando hay poco agua
disponible, pero la taza y la magnitud del proceso se incrementa
conforme la humedad empieza a ser más abundante. Algunas veces, la
actividad es grande a la capacitación de campo o cerca de ésta y
ocasionalmente, bajo condiciones de anegamiento; el nivel óptimo de
agua varía con ell tipo de suelo y la cantidad de materia orgánica
degradable.

La temperatura también tiene una gran influencia en el metabolismo

de N 2 . A bajas temperaturas, es evidente muy poca actividad; el aumento
de temperatura estimula la captación microbiana del gas. El proceso se
lleva a cabo a temperaturas moderada, pero cesa a escasos grados por
arriba de la temperatura óptima.

BACTERIAS FIJADORAS DE NITRÓGENO

Las bacterias fijadoras de nitrógeno que se desarrollan de forma

natural en el suelo, se conocen desde hace más de un siglo. Representan
un biofertilizante ecológico y se dividen en dos grandes grupos: Las
simbióticas, especificas de las leguminosas, como el Rhizobium, y las
libres, que viven en el suelo y no necesitan la planta para su
reproducción, como el Azotobacter y el Azospirillum, entre los más
importantes en agricultura.

El Azotobacter y el Azospirillum, en concentraciones adecuadas,

pueden sustituir al nitrógeno químico(Urea, amoníaco...)sin merma de la
producción y a menor coste.

Otras ventajas comprobadas del uso de estas bacterias como

biofertilizante son:

a) Producen fitohormonas, como el ácido indolacètico y las

citoquininas, capaces de acelerar y potenciar el crecimiento de las
plantas.

b) Al permanecer vivas durante años y reproducirse en el suelo, no

sólo no lo degradan sino que contribuyen a su enriquecimiento en
nitrógeno y a su regeneración de forma ecológica y gradual, incluso en
terrenos de alta concentración salina.

c) Se ha compr0bado que fertilizando los cultivos con estas

bacterias y con nitrógeno químico en un porcentaje entre el 20 y 50% del
utilizado normalmente, se consigue un aumento de producción sobre las
cosechas obtenidas únicamente con fertilizante químico al 100%. Esto es
debido a que, al liberarse la bacteria de su función fijadora de nitrógeno,
produce más factores de crecimiento vegetal, En cereales de secano, esto
puede suponer el ahorro del abonado de cobertera.

d) Crea una barrera protectora contra hongos y bacterias patógenas

en la raíz de la planta, por lo que ésta crece más sana y fortalecida.

e) Producen enzimas que solubilizan los fosfatos y los hacen más

accesibles a la planta, así como factores que facilitan la absorción de
oligoelementos.
 f) Se ha demostrado que resisten mejor las condiciones de sequía y
los climas áridos ya que se forman alginatos en las raíces de las plantas.

g) Como consecuencia de todo lo anterior, es un mayor desarrollo

de las raíces de las plantas, con el consiguiente beneficio general para
ésta, así como el peso de los frutos.

h) También se ha comprobado un mayor índice de germinación de

semillas comparada con otros sistemas de abonado.

i) Las nuevas estirpes de Azotobacter y Azospirillum son capaces

de fijar un 72,64% más de nitrógeno atmosférico, que las estirpes
originales.

Hay pues un cúmulo de ventajas para el usuario, económicas,

ecológicas, A corto, medio y largo plazo en la progresiva sustitución de
la fertilización química por las bacterias naturales, totalmente
inofensivas para el medio y el ser humano.