UAA

Departamento de Biología
Laboratorio Biol 431 – Celular-Molecular
Introducción a la Espectrofotometría - JACardé
Introducción:
En este ejercicio trabajaremos con las bases teóricas y técnicas de espectrofotometría. Esta
técnica es parte de casi todo experimento realizado en un laboratorio. Comprende el estudio de la
interacción de la radiación electromagnética (EMR) con moléculas, átomos o iones. Entre las
aplicaciones generales estan: determinación de concentraciones de macromoléculas, cuantificación
de células, densitometrías etc.

Absorción de luz:
La luz o EMR tiene una onda y una naturaleza particulada. La longitud de onda (λ ) de la luz es
la distancia entre picos de las ondas adyacentes (fig 1). La frecuencia (ν ), es el número de ondas
pasando por un punto fijo por unidad de tiempo. Con estos parámetros se define la ecuación:

λ =c/ν ; donde c es la velocidad de la luz.

Fig 1. Ondas: λ vs c

Fotones de distintas λ tienen distintas energías. La energía puede calcularse por

E=hc/λ = hν ; donde h es la constante de Planck.

Por lo tanto a mayor λ , menor la E y viceversa. En otras palabra la E es inversamente proporcional a

la λ .
La figura 2 presenta las relaciones entre la λ de la luz y los mas comunes tipos de EMR.

Que sabemos sobre la radiación en aquellas regiones donde λ es pequeña?

Fig 2. Espectro de la radiación EM.

Cada compuesto tien una cierta λ a la que

absorbe el máximo de E. Cuando una sustancia luce verde (clorofila) a nuestros ojos es porque la luz

1
verde (azul y amarillo) no es absorbida por ella (es transmitida o reflejada) mientras la roja es
absorbida. En una mezcla de compuestos cada uno puede absorber a distintas λ , pero si hay uno
que absorbe a una λ única podemos determinar su concentración dentro de la mezcla usando su λ
especifica.

Ley de Beer-Lambert
Si un rayo monocromático (de 1 λ ) de intensidad inicial Io pasa por una solución, algo de la luz
puede ser absorbida, asi que la luz transmitida I sera menos que la Io. La razon I/Io se le llama
transmitancia y dependerá de:
1. si la concentración © de la solución que absorbe, aumenta, la transmintancia disminuye.
2. Si la distancia (l) que la luz tiene que viajar, aumenta, transmitancia disminuirá
3. Si la naturaleza de la sustancia cambia a otra sustancia que absorbe ma, la transmitancia
disminuirá. La naturaleza de la sustancia es reflejada por ε , (coeficiente de extinción) o su
constante de absorción. Estos factores se combinan en:

Log Io/I=ε lc

El log Io/I se conoce como absorbancia (A).

Esta ley; A=ε lc; se conoce como la Ley de Beer-Lambert.

Para recordar:
- Abs no tiene unidades, es un número que sale del instrumento, se debe incluir la λ a la
que se tomó: A540= 0.3
- El coeficiente de extinción ε , es la absorbancia de una unidad de solución y tiene
unidades recíprocas de concentración y distancia l. Los valores mas comunes son tomados
a una distancia de 1cm y en soluciones 1M. Asi si ε 600= 4000M-1cm -1 significa que una
solución 1M tendrá una Abs de 4000 a λ de 600 nm si se usa una cuveta de 1cm.
- La distancia l, se asume siempre que es 1cm si no se dice lo contrario.

Si una sustancia obedece la ley BL, entonces una gráfica de A vs c sera una línea recta que
idealmente se extiende al infinito, aunque en la realidad puede tornarse curva al pasar unos límites
de c.

Práctica 1.
Medimos la A de una solución X que absorbe a 540 nm. La cuveta es de 1 cm, el coeficiente
de extinción a 540 nm es de 10,000 M-1cm -1 y la A fue 0.4. Cual es la concentración según la ley de
BL?

A= єlc

Blancos: es un reactivo control donde se incluye todo menos la sustancia que se esta probando.
Puede darse el caso que parte de la absorbancia total se deba a los componentes de la mezcla donde
está la sustancia disuelta o diluida. Se obtiene la A para esta mezcla sin el componente de interés y
este número se le resta a la A total de la mezcla con el componente de interés presente.

Práctica 2. Hay un reactivo con color rojizo oscuro que cuando interactua con proteínas se torna
azul. Esta mezcla se lee a 595nm. Cual sería un buen blanco para control de un expto donde vayas a
leer distintas muestras de proteínas usando este reactivo?

Curva estándar:
Cuando la información usada en la práctica 1 no es conocida (el coeficiente, y estar seguro que el
sistema sigue la ley de BL) entonces se recomienda preparar una curva estándar. Esto es una gráfica
de Abs vs cantidades conocidas variables de la sustancia, asi la concentración desconocida puede ser
determinada de la gráfica por inspección y usando la ecuación de la recta.

La concentración desconocida se obtiene de dos formas: Por inspección en la misma gráfica, o

usando la ecuación de la recta, explicada en el 2do ejercicio: y= mx + b; y, absorbancia, m,
pendiente, x concentración y b, intercepto en y.

2
Veamos el siguiente ejemplo.

Tubo # [ ] mM Abs Abs Corregida

1 0 0.05 0.00
2 1 0.15 0.10
3 2 0.25 0.20
4 3 0.35 0.30
5 4 0.45 0.40
6 5 0.55 0.50

Cuanto será la [ ] X si la absorbancia es 0.30?

Abs vs Concentracion

y = 0.1x
0.6

0.4

0.2
(595nm)
Abs corregida
0
0 2 4 6
Concentracion (mM)

Fig 3 – Abs vs Concentracion

y= 0.1x; 0.3=0.1x; 0.1/0.3=x

Recuerde corregir las absorbancia restando la Abs del tubo control o lo que es igual “blanqueando”
con este, asi la correción se hace automática.

Ensayo de proteinas: Esta es una de las pruebas que mas uso hace de la espectrofotometría, y
específicamente haciendo uso de las curvas estándar.

Absorción UV: Las proteínas pueden ser fácilmente probadas con un espectrofotómetro que
mida en la región de luz UV. Los AA Triptófano y Tirosina que absorben fuertemente en los 280 nm.
Esto permite al científico rastrear para proteinas en esta longitud de onda por ejemplo durante
procesos de purificacion por cromatografía. Sin embargo si quieres tener opción a cuantificar
deberás saber el ε a 280nm para esa proteina. Si la proteina tiene muchos grupos R aromáticos, o el
ε es muy bajo, el método de UV no será apropidado.

Agentes colorantes: Este es un método desarrollado por los problemas con el método UV.
Consiste en moléculas de tinte que reaccionan con alguna parte de las proteinas que darán un
complejo con un color que sí puede medirse en espectrofotometría de luz visible.

Uno de los mas comunes es conocido como el método Bradford que usa el tinte conocido
como Coomassie Brillian Blue G-250. Este tiene una carga negativa y es de color rojo con una
absorción máxima a 425 nm. Cuando se une a partes positivas de las proteinas cambia a color azul
que absorbe su máximo a 595 nm. Muchas proteinas producen una curva de respuesta similar a esta
prueba por lo que la misma es útil para muchos ensayos con buena reproducibilidad. Es rápida pues
la reacción ocurre en menos de 5 minutos y el producto es estable por mas de 1 hora. La muestra de
la proteina será de hasta 100 ul para diluir en 3-5 ml del reactivo.

Para recordar:
- la curva estandar será Abs vs miligramos o microgramos de proteina
- usarás la curva para determinar concentración de desconocido

3
 - la Abs del desconocido debe caer dentro de la curva, no puedes extrapolar mas alla del los
puntos mas bajo o alto de la curva.
- Recuerdas como pipetear? Pregunta.

Como funciona el espectrofotómetro, Spectronic 2 o BioRad SmartSpec

-una fuente de luz, un prisma para controlar y seleccionar la longitud de onda, un lugar para la
muestra.
- calibrarlo a 0, al comenzar y justo antes de usarlo. Usar cuvetas de al menos 2 ml,
mientras menos cuvetas mejor.
- No muevas botones si no estas seguro de lo que haces

Teoría básica de espectrofotometría.

Busca en Google.com por Spectrophotometric theory.

Práctica 3: Ley de Beers y las Curvas Estándar

Determinación de cantidad de proteina total en un huevo. En este ejercicio se tratará de determinar

la cantidad de proteina total que hay en un huevo de gallina. Queremos determinar cuanta de esta
proteina esta en la yema, y cuanta esta en la clara. También queremos saber que % del peso total de
un huevo es proteina. Esperamos tener 3 huevos distintos para que haya comparación por ej: uno del
pais, uno americano y alguno otro americano de tamaño distinto.

1. Preparar una curva estándar con distintas cantidades de BSA

a. Encender el Instrumento al menos 15 minutos antes de usarlo.
b. Preparar la solución Bio Rad Protein Assay (Braddford Reagent)
i. Diluir la solución 1:5 con agua destilada, calcula cuanto será el total que usarás
para todo el expto para que lo hagas todo de una sola vez. Si usarás 5 ml por
muestra y mediras 10 muestra pues prepararás un minimo de 50 ml o quizas 75
por si acaso.
ii. Mezclar bien homogeneamente y dejar reposar 5 min
c. Prepara 10 tubos o cuvetas limpias y rotulados 1-10. Sirve la cantidad de ul del stock
de Albúmina de Suero de Bovino (BSA, que esta a una concentración de 1mg/ml) en los
tubos rotulados.
i. 0ul, 10ul, 20ul, 30ul, 40ul, 75ul, 100ul
ii. Cuantos ug de proteinas esta sirviendo en cada tubo?
d. Sirve el volumen de la solución Bio Rad necesaria para completar los ml necesarios en
cada tubo, (este volúmen será de 1 a 3 ml del tinte) incluyendo un tubo extra que
servirá de blanco. Mezcle bien inmediatamente (parafina, o saran wrap) y deje
reposar 5-10 minutos. Observa los colores cuidadosamente para que los asocies con
las lecturas.
e. Leer en el Smart Spec (usando instrucciones del manufacturero)
i. Encendido – 15 minutos antes de usarse.
ii. Seleccionar macromolécula a estudiar - proteina
iii. Escoger ensayo - Bradfford
iv. Seguir instrucciones en la pantalla del instrumento.
v. Medir las muestras de la curva estándar, note los colores y las intensidades,
anote las medidas.
f. Prepare una gráfica de cantidad de proteinas (ug o mg) vs Absorbancia (A) a 595nm.
g. Mide la absorbancia de las dos muestras desconocidas que se te asignarán, aproxima
la concentración a 1)simple vista (comparando colores), 2) por inspección en la gráfica
y 3) calculándo la ecuacion de la recta.

2. Preparación de las muestras del huevo.

4
 a. Pesa el huevo 3 veces para sacar un promedio. Rompa el huevo con mucho cuidado y
separe la clara de la yema.. Pese el cascarón sólo.
b. Mida los volúmenes de la yema y la clara de ellos y regístrelos. Pese cada uno de ellos.
c. Prepare las siguientes diluciones en serie de cada uno de ellos en el buffer PBS o NaCl
que se le provea.
i. 1 ml en 10ml
ii. 1 ml en 10 ml
iii. 1 ml en 10 ml y siga diluyendo hasta que la muestra se vea clara sin turbidez.
Porque?

d. Pruebe 10-20 ul del mas diluído en 1ml del tinte y compare el color que le da con los
colores de las muestras de la curva estándar.
e. Si el color es similar a alguno de los tubos entre la curva, proceda a leerlo.
f. Si el color es similar al del tubo en el extremo inferior, prueba la dilución anterior.
g. Si el color es similar al del tubo en el extremo superior de la curva, debes hacer otra
dilucion.
h. Resume los datos en una tabla y anota bien el procedimiento.

3. Ahora tomando en cuenta todas las diluciones que hicistes, calcula tu factor de dilucion total
(ejercicio 2 de diluciones y gráficas) y determina cuanta proteina total hay en la yema, en la
clara y en el huevo completo.
4. Determina que porciento por volumen y porciento por peso hay en la yema, en la clara y en el
huevo total.
5. Compara con el otro grupo para determinar si hay diferencia en el contenido proteico por
unida de masa o volumen entre un huevo del país y un huevo americano.
6. Recuerda tener en cuenta todas las dilusiones y todos los volumenes usados.
7. Contesta las preguntas que acompañen este modulo.

a. Define Absorbancia, transmitancia, y coeficiente de extinción.

b. Explica brevemente la teoría básica de espectrofotometría.
c. Cual es la Abs teórica de una solución de NADH 0.1M a 340 nm.
d. Que dilución habria que hacer para que la lectura anterior dé una absorbancia de 3.1.?
e. Diez ul de una dilución 1/10 de una muestra se añadió a 1 ml del reactivo Bradfford. La
absorbancia a 595nm fue de 0.78 y de acuerdo a la curva estándar correspondia a
0.95mg de proteinas en el eje de x. Cual sera la concentración de proteinas de la
solución original?

8. Presenta tu informe sobre la diferencia de los huevos (o entre yema y clara) si la hay en
terminos de hipótesis.

Ejercicio Opcional: Determinar un espectro de absorción para un tinte.

- Colocar una muestra del tinte en la cuveta
- Someter la muestra a el paso de todo el espectro EM por ella.
- Obtener la absorbancia para cada largo de onda y preparar una grafica de longitud de
onda vs abs.
- Repetirlo con una muestra que tenga proteinas.
- Compararlos.