Professional Documents
Culture Documents
Trabajo de laboratorio:
Cuantificación de proteínas por el método de Bradford
Objetivos
Generar una curva de calibración y estimar la concentración proteica
de una muestra incógnita.
Introducción
Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es
una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de
purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la
actividad específica de una preparación enzimática, para el
diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos.
Con esta práctica se pretende
Método de Bradford
Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también
Serva Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe
en dos formas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la
forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un
coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. Este método es
sensible (1-25 µg), simple, rápido, barato y pocas sustancias
interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren
están los detergentes y las soluciones básicas.
Reactivo de Bradford
Reactivo preparado del siguiente modo: mezclar 10 mg de Comassie Blue
G-250 con 10 ml de fosfórico al 88% y 4,7 ml de etanol absoluto.
Añadir H2O hasta 100 ml. Filtrar a través de papel de filtro y guardar
en la oscuridad.
Procedimiento
Añadir 950 µl del reactivo de Bradford a los tubos estándar y muestras
problema preparadas como se indica en la Tabla. Dejar a temperatura
ambiente y leer Absorbancia a 595 nm frente al blanco. El color es
estable 1 hora.
• Curva de calibración
Muestra 1 (blanco) 2 3 4 5 6
µg BSA en muestra 0 5 10 15 20 25
µl BSA (0.5 µg/µl) 0 10 20 30 40 50
µl agua 50 40 30 20 10 0
Reactivo de Bradford 950 950 950 950 950 950
Absorbancia a 595 nm
• Incógnitas
Muestra M M(1/5)
µg BSA en muestra ? ?
µl de M 50 10
µl agua 0 40
Reactivo de Bradford 950 950
Absorbancia a 595 nm
Bioquímica 1 – Diplomatura en Ciencia y Tecnología – Universidad Nacional de Quilmes
Análisis de resultados
Absorbancia a 280 nm
Bibliografía
Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72:
248-254.