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PROCEDIMIENTO QU- 001 PARA LA CALIBRACIN EQUIPOS DE ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCIN ATMICA

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Este procedimiento ha sido revisado, corregido y actualizado, si ha sido necesario. La presente edicin se emite en formato digital. Hay disponible una edicin en papel que se puede adquirir en nuestro departamento de publicaciones. Este procedimiento de calibracin es susceptible de modificacin permanente a instancia de cualquier persona o entidad. Las propuestas de modificacin se dirigirn por escrito, justificando su necesidad, a cualquiera de las siguientes direcciones: Correo postal Centro Espaol de Metrologa C/ del Alfar, 2, 28760 Tres Cantos, Madrid Correo electrnico cem@cem.es

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NDICE

Pgina 1. OBJETO ............................................................................................... 4 2. ALCANCE............................................................................................. 4 3. DEFINICIONES .................................................................................... 5 4. GENERALIDADES ............................................................................. 12 4.1. Partes integrantes de los equipos de Espectrofotometra de Absorcin Atmica .12 4.2. Descripcin de las bases de la tcnica.15 5. DESCRIPCIN................................................................................... 16 5.1. Equipos y materiales................................................................... 16 5.2. Operaciones previas y puesta en marcha del equipo ................ 19 5.3. Determinacin experimental de la curva de calibracin............. 25 5.4. Toma de datos...................... 28 5.5. Tratamiento de datos: determinacin y estipulacin de la curva de calibracin ........................................................... 28 6. CLCULO DE LA INCERTIDUMBRE ASOCIADA A LA CALIBRACIN .............................................................................. 34 7. REFERENCIAS .................................................................................. 40 8. ANEXOS ............................................................................................. 41 Anexo: Ajuste por regresin polinmica............................................. 41

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1. OBJETO El presente procedimiento tiene por objeto mostrar un mtodo posible para la calibracin de Equipos de Espectrofotometra de Absorcin Atmica (E.A.A.) con distintas variantes instrumentales.

2. ALCANCE El presente procedimiento puede aplicarse para la calibracin, para un cierto elemento en unas condiciones experimentales determinadas, de Espectrofotmetros de Absorcin Atmica (con sus correspondientes accesorios instrumentales: generadores de hidruros, inyectores automticos), tanto los que verifican la atomizacin por la accin de una llama o mediante una cmara de grafito. Dicha calibracin, por corresponder a un equipo que constituye un sistema instrumental complejo y por tratarse de una tcnica espectrofotomtrica, se lleva a cabo por interpolacin sobre la correspondiente recta de regresin. Por otra parte, hay que tener en cuenta que, para poder aplicar la correspondiente calibracin para el desarrollo de la determinacin analtica de un elemento, debe efectuarse un tratamiento anlogo de los patrones y de las muestras y, adems, deben coincidir lo ms posible las naturalezas qumicas de sus matrices. En algunos casos, con el objeto de obviar el efecto de las posibles interferencias de la matriz de las muestras, se emplea la estrategia de la cuantificacin mediante el procedimiento de adicin de patrn que se basa en la determinacin de la diferencia de absorbancias entre la muestra y alcuotas de la misma fortificadas con concentraciones conocidas del elemento en estudio, determinndose de este modo la relacin absorbancia/concentracin del analito. Cabe sealar que en el presente procedimiento de calibracin nicamente se contempla el caso del establecimiento de la curva de calibracin correspondiente al anlisis directo de patrones, excluyndose el tratamiento de la tcnica de patrn aadido, dado que est muy vinculada a la propia naturaleza de las muestras objeto de ensayo.

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3. DEFINICIONES Ajuste de un sistema de medida [1] (3.11) Conjunto de operaciones realizadas sobre un sistema de medida para que proporcione indicaciones prescritas, correspondientes a valores dados de la magnitud a medir. NOTA 1 Diversos tipos de ajuste de un sistema de medida son: ajuste de cero, ajuste del offset (desplazamiento) y ajuste de la amplitud de escala (denominado tambin ajuste de la ganancia). NOTA 2 No debe confundirse el ajuste de un sistema de medida con su propia calibracin, que es un requisito para el ajuste. NOTA 3 Despus de su ajuste, generalmente un sistema de medida debe ser calibrado nuevamente. Calibracin [1] (2.39) Operacin que bajo condiciones especificadas establece, en una primera etapa, una relacin entre los valores y sus incertidumbres de medida asociadas obtenidas a partir de los patrones de medida, y las correspondientes indicaciones con sus incertidumbres asociadas y, en una segunda etapa, utiliza esta informacin para establecer una relacin que permita obtener un resultado de medida a partir de una indicacin. NOTA 1 Una calibracin puede expresarse mediante una declaracin, una funcin de calibracin, un diagrama de calibracin, una curva de calibracin o una tabla de calibracin. En algunos casos, puede consistir en una correccin aditiva o multiplicativa de la indicacin con su incertidumbre correspondiente. NOTA 2 Conviene no confundir la calibracin con el ajuste de un sistema de medida, a menudo llamado incorrectamente autocalibracin, ni con una verificacin de la calibracin.

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NOTA 3 Frecuentemente se interpreta que nicamente la primera etapa de esta definicin corresponde a la calibracin. Desviacin tpica experimental [2] (B.2.17) Para una serie de n mediciones de un mismo mensurando, la magnitud s que caracteriza la dispersin de los resultados, dada por la frmula:

s=

(xi x )
n i =1

n 1

siendo xi el resultado de la i-sima medicin y x la media aritmtica de los n resultados considerados.


NOTAS 1. Considerando la serie de n valores como muestra de una distribucin, x es

un estimador insesgado de la media , y s 2 es un estimador insesgado de la


2 varianza de dicha distribucin.

2.

La expresin s

n es una estimacin de la desviacin tpica de la

distribucin de x y se denomina desviacin tpica experimental de la media. 3. La desviacin tpica experimental de la media en ocasiones se denomina, incorrectamente, error de la media.

Ensayo Operacin tcnica que consiste en la determinacin de una o ms caractersticas o cualidades de un determinado, producto, material, equipo, organismo, fenmeno fsico, proceso o servicio de acuerdo con un procedimiento especificado. Error de medida [1] (2.16) Diferencia entre un valor medido de una magnitud y un valor de referencia.

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NOTA 1 El concepto de error de medida puede emplearse: a) cuando exista un nico valor de referencia, como en el caso de realizar una calibracin mediante un patrn cuyo valor medido tenga una incertidumbre de medida despreciable, o cuando se toma un valor convencional, en cuyo caso el error es conocido. b) cuando el mensurando se supone representado por un valor verdadero nico por un conjunto de valores verdaderos, de amplitud despreciable, en cuyo caso el error es desconocido. NOTA 2 Conviene no confundir el error de medida con un error en la produccin o con un error humano. Incertidumbre de medida [1] (2.26) Parmetro no negativo que caracteriza la dispersin de los valores atribuidos a un mensurando, a partir de la informacin que se utiliza NOTA 1 La incertidumbre de medida incluye componentes procedentes de efectos sistemticos, tales como componentes asociadas a correcciones y a valores asignados a patrones, as como la incertidumbre debida a la definicin. Algunas veces no se corrigen los efectos sistemticos estimados y en su lugar se tratan como componentes de incertidumbre. NOTA 2 El parmetro puede ser, por ejemplo, una desviacin tpica, en cuyo caso se denomina incertidumbre tpica de medida (o un mltiplo de ella), o una semiamplitud con una probabilidad de cobertura determinada. NOTA 3 En general, la incertidumbre de medida incluye numerosas componentes. Algunas pueden calcularse mediante una evaluacin tipo A de la incertidumbre de medida, a partir de la distribucin estadstica de los valores que proceden de las series de mediciones y pueden caracterizarse por desviaciones tpicas. Las otras componentes, que pueden calcularse mediante una evaluacin tipo B de la incertidumbre de medida, pueden caracterizarse tambin por desviaciones tpicas, evaluadas a partir de funciones de densidad de probabilidad basadas en la experiencia u otra informacin.

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NOTA 4 En general, para una informacin dada, se sobrentiende que la incertidumbre de medida est asociada a un valor determinado atribuido al mensurando. Por tanto, una modificacin de este valor supone una modificacin de la incertidumbre asociada. Material de referencia [1] (5.13) Material suficientemente homogneo y estable con respecto a propiedades especificadas, establecido como apto para su uso previsto en una medicin o en un examen de propiedades cualitativas NOTA 1 El examen de una propiedad cualitativa comprende la asignacin de un valor a dicha propiedad y de una incertidumbre asociada. Esta incertidumbre no es una incertidumbre de medida. NOTA 2 Los materiales de referencia con o sin valores asignados pueden servir para controlar la precisin de la medida, mientras que nicamente los materiales con valores asignados pueden utilizarse para la calibracin o control de la veracidad. NOTA 3 Los materiales de referencia comprenden materiales que representan tanto magnitudes como propiedades cualitativas. EJEMPLO 1 Ejemplos de materiales de referencia que representan magnitudes: a) agua de pureza declarada, cuya viscosidad dinmica se emplea para la calibracin de viscosmetros. b) suero humano sin valor asignado a la concentracin de colesterol inherente, utilizado solamente como material para el control de la precisin de la medida. c) tejido de pescado con una fraccin msica determinada de dioxina, utilizado como calibrador. EJEMPLO 2 Ejemplos de materiales de referencia que representan propiedades cualitativas: a) carta de colores mostrando uno o ms colores especificados. b) ADN conteniendo una secuencia especificada de nucletido. c) orina conteniendo 19-androstenediona.

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NOTA 4 Algunas veces un material de referencia se incorpora a un dispositivo fabricado especialmente. EJEMPLO 1 Sustancia de punto triple conocido en una clula de punto triple. EJEMPLO 2 Vidrio de densidad ptica conocida, en un soporte de filtro de transmitancia. EJEMPLO 3 Esferas de granulometra uniforme montadas en un portamuestras de microscopio. NOTA 5 Algunos materiales de referencia tienen valores asignados que son metrolgicamente trazables a una unidad de medida fuera de un sistema de unidades. Tales materiales incluyen vacunas a las que la Organizacin Mundial de la Salud ha asignado Unidades Internacionales (UI). NOTA 6 En una medicin dada, un material de referencia puede utilizarse nicamente para calibracin o para el aseguramiento de la calidad. NOTA 7 Dentro de las especificaciones de un material de referencia conviene incluir su trazabilidad, su origen y el proceso seguido (Accred. Qual. Assur.:2006). NOTA 8 La definicin segn ISO/REMCO es anloga, pero emplea el trmino proceso de medida para indicar examen (ISO 15189:2007, 3.4), el cual cubre tanto una medicin de la magnitud como el examen de una propiedad cualitativa. Material de referencia certificado (MRC) [1] (5.14): Material de referencia acompaado por la documentacin emitida por un organismo autorizado, que proporciona uno o varios valores de propiedades especificadas, con incertidumbres y trazabilidades asociadas, empleando procedimientos vlidos. EJEMPLO Suero humano, con valores asignados a la concentracin de colesterol y a la incertidumbre de medida indicados en un certificado,
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empleado como calibrador o como material para el control de la veracidad de la medida. NOTA 1 La documentacin mencionada se proporciona en forma de certificado (vase la Gua ISO 31:2000). NOTA 2 Procedimientos para la produccin y certificacin de materiales de referencia certificados pueden encontrarse, por ejemplo, en las Guas ISO 34 e ISO 35. NOTA 3 En esta definicin, el trmino incertidumbre se refiere tanto a la incertidumbre de la medidacomo a la incertidumbre del valor de la propiedad cualitativa, tal como su identidad y secuencia. El trmino trazabilidad incluye tanto la trazabilidad metrolgica del valor de la magnitud como la trazabilidad del valor de la propiedad cualitativa. NOTA 4 Los valores de las magnitudes especificadas de los materiales de referencia certificados requieren una trazabilidad metrolgica con una incertidumbre de medida asociada (Accred. Qual. Assur.:2006). NOTA 5 La definicin de ISO/REMCO es anloga (Accred. Qual. Assur.:2006) pero utiliza el calificativo metrolgica tanto para una magnitud como para una propiedad cualitativa. Medicin [1] (2.1) Proceso que consiste en obtener experimentalmente uno o varios valores que pueden atribuirse razonablemente a una magnitud. NOTA 1 Las mediciones no son de aplicacin a las propiedades cualitativas. NOTA 2 La medicin supone una comparacin de magnitudes, e incluye el conteo de entidades. NOTA 3 Una medicin supone una descripcin de la magnitud compatible con el uso previsto de un resultado de medida, un procedimiento de medida y un sistema de medida calibrado conforme a un procedimiento de medida especificado, incluyendo las condiciones de medida.

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Resolucin de un dispositivo visualizador [1] (4.15) Mnima diferencia entre indicaciones visualizadas, que puede percibirse de forma significativa. Trazabilidad metrolgica [1] (2.41) Propiedad de un resultado de medida por la cual el resultado puede relacionarse con una referencia mediante una cadena ininterrumpida y documentada de calibraciones, cada una de las cuales contribuye a la incertidumbre de medida NOTA 1 En esta definicin, la referencia puede ser la definicin de una unidad de medida, mediante una realizacin prctica, un procedimiento de medida que incluya la unidad de medida cuando se trate de una magnitud no ordinal, o un patrn. NOTA 2 La trazabilidad metrolgica requiere una jerarqua de calibracin establecida. NOTA 3 La especificacin de la referencia debe incluir la fecha en la cual se utiliz dicha referencia, junto con cualquier otra informacin metrolgica relevante sobre la referencia, tal como la fecha en que se haya realizado la primera calibracin en la jerarqua. NOTA 4 Para mediciones con ms de una magnitud de entrada en el modelo de medicin, cada valor de entrada debiera ser metrolgicamente trazable y la jerarqua de calibracin puede tener forma de estructura ramificada o de red. El esfuerzo realizado para establecer la trazabilidad metrolgica de cada valor de entrada debera ser en proporcin a su contribucin relativa al resultado de la medicin. NOTA 5 La trazabilidad metrolgica de un resultado de medida no garantiza por s misma la adecuacin de la incertidumbre de medida a un fin dado, o la ausencia de errores humanos. NOTA 6 La comparacin entre dos patrones de medida puede considerarse como una calibracin si sta se utiliza para comprobar, y si

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procede, corregir el valor y la incertidumbre atribuidos a uno de los patrones.

4. GENERALIDADES Debe tenerse en cuenta que los Espectrofotmetros de Absorcin Atmica, equipos objeto del presente procedimiento de calibracin, constituyen Sistemas Instrumentales Complejos que constan de mltiples partes las cuales, a menudo, suponen variables operativas alternativas y permiten tambin el acoplamiento de distintos accesorios (como inyectores automticos, dispositivos de generacin de hidruros). Otro aspecto de inters se deriva de la capacidad de aplicacin de dicha tcnica en la determinacin analtica de distintos elementos. Ambas circunstancias, sin soslayar la oportunidad de verificar peridicamente las especificaciones de alguno de los componentes del equipo, implican la necesidad de efectuar calibraciones globales del Sistema Instrumental completo que constituye el Espectrofotmetro de Absorcin Atmica, particularizadas para cada elemento en unas condiciones experimentales prefijadas. En este apartado se describen, adems de los fundamentos bsicos de la tcnica, los elementos integrantes de los Espectrofotmetros de Absorcin Atmica. 4.1. Partes integrantes de los equipos de Espectrofotometra de Absorcin Atmica Los principales elementos (con las variables operativas correspondientes) son: 4.1.1. Sistema neumtico Gas combustible (para el caso de atomizacin por llama), siendo los ms comunes: Acetileno Otros gases menos empleados: Hidrgeno, Propano, Butano Gas oxidante (para el caso de atomizacin por llama).

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Aire xido nitroso Gas de purga y enfriamiento (para el caso de atomizacin electrotrmica): Argn Gas de arrastre (para el caso de EAA con cmara de vapor fro): Argn Reguladores de presin y caudal de los gases: Mecnicos o electrnicos 4.1.2. Dispositivos de introduccin de muestras y/o transferencia de muestras al elemento de atomizacin Los usados ms frecuentemente son: Por aspiracin y/o nebulizacin de las muestras y de los patrones de calibracin. Inyeccin manual o automtica de las muestras y patrones de calibracin en la cmara de atomizacin. Dispositivos para la generacin de vapores fros (para la determinacin de mercurio) y para la generacin de hidruros (para la determinacin de arsnico, selenio, antimonio, estao,). Inyectores de Flujo Segmentado (FIAS).

Adems, en algunos equipos se emplean: Inyectores para muestras slidas. Diluidores automticos de muestras y/o patrones de calibracin. 4.1.3. Cmara y fuente de atomizacin (por llama o electrotrmica)

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Mechero con llama aire-acetilnica. Mechero con llama xido nitroso-acetilnica. Cmara de grafito, que incorpora: Tubo de grafito (con o sin plataforma L'Vov) Sistema de calentamiento (longitudinal o transversal) Circuito de gas inerte de purga y enfriamiento Circuito de refrigeracin con agua 4.1.4. Sistema ptico Fuentes de energa radiante y modulada (generalmente ubicadas en un portalmparas mltiple), siendo susceptible el control de su intensidad y energa. Lmparas de ctodo hueco (monoelementales) Lmparas de descarga sin electrodos (multielementales). Rendija regulable en anchura (en algunos equipos tambin en altura). Selector de longitud de onda. Monocromador. otomultiplicador. Corrector de la radiacin de fondo: Lmpara de deuterio. Efecto Zeeman. Cmara para vapor fro. 4.1.5. Gestin de la seal medida Amplificador logartmico (para convertir la transmitancia medida en absorbancia).

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Convertidor analgico/digital. Dispositivo de amortiguacin del ruido de fondo.

4.1.6. Registro de datos Registrador grfico de tipo potenciomtrico. Sistema informatizado: Integrado en el equipo. Externo (soportado en un PC). 4.2. Descripcin de las bases de la tcnica 4.2.1. Fundamento La Espectrofotometra de Absorcin Atmica se basa en la absorcin selectiva de radiacin luminosa a una longitud de onda determinada por parte de los tomos (o iones simples) en estado gaseoso de los distintos elementos susceptibles de anlisis mediante la citada tcnica. Dado que la absorcin atmica se rige tericamente por la ley de Beer-Lambert que expresa la proporcionalidad directa entre la absorbancia y la concentracin del analito (tanto en la disolucin de muestra a ensayar como en los patrones de calibracin), es posible el establecimiento de curvas (o rectas) de calibracin que representen estadsticamente la correspondiente relacin absorbancia/concentracin del elemento objeto de anlisis. En el siguiente apartado se ofrecen una serie de consideraciones y criterios para el desarrollo de las actividades de la presente calibracin. 4.2.2. Consideraciones generales sobre la calibracin de los equipos de Espectrofotometra de Absorcin Atmica Dada la complejidad y multiplicidad de las partes integrantes de los Espectrofotmetros de Absorcin Atmica, equipos cuya calibracin constituye el objeto de este documento, y ante la imposibilidad

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prctica por parte de los usuarios de efectuar calibraciones por separado de los distintos componentes, en el presente procedimiento se plantea la oportunidad de efectuar una calibracin global del equipo basada en la determinacin y verificacin de la funcin de respuesta (denominada recta o curva de calibracin) individualizada para cada elemento susceptible de medida por el equipo en unas condiciones de trabajo determinadas. A partir del tratamiento estadstico de los datos de la calibracin se establecer el criterio para la determinacin de los intervalos de confianza y para el clculo de la incertidumbre asociada a las medidas de cuantificacin a llevar a cabo.
NOTA Cabe comentar que en la redaccin del presente procedimiento se ha procurado generalizar las operaciones y clculos para que se abarquen al mximo todas las variantes operativas de la presente tcnica analtica.

5. DESCRIPCIN En el presente apartado se describen las consideraciones a tener en cuenta sobre los equipos y tambin de los materiales y reactivos involucrados en las actividades de calibracin de Espectrofotmetros de Absorcin Atmica y las operaciones a llevar a cabo para la realizacin de dichas actividades. 5.1. Equipos y materiales Las buenas prcticas analticas y los requisitos de las normativas concernientes a los sistemas de aseguramiento de la calidad analtica (como por ejemplo ISO 17025) establecen como criterio general que todos equipos de medicin y ensayo utilizados en el laboratorio, debern calibrarse antes de su puesta en servicio y posteriormente, cuando sea necesario de acuerdo con el programa de calibracin establecido (sin excluir la necesidad u oportunidad de la calibracin en cada uso) y, adems, deben estar sometidos a un adecuado mantenimiento preventivo. En consecuencia, el laboratorio deber disponer de un plan y un programa estrictos tanto por lo que se refiere a las operaciones de calibracin como a las de mantenimiento

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de los equipos. Adems, habr de disponer de los registros de calibracin (as como de los de verificacin, mantenimiento preventivo y mantenimiento correctivo) convenientes que permitan asegurar la trazabilidad de las medidas realizadas con dichos equipos. Por lo que se refiere a los materiales de referencia empleados en el desarrollo de las calibraciones (vase al respecto la definicin en el apartado 3 del presente procedimiento), deber asegurarse su trazabilidad respecto a patrones nacionales o internacionales, o bien deber ponerse de manifiesto satisfactoriamente la exactitud e incertidumbre de la concentracin de los analitos de inters en los patrones correspondientes, en base al contraste de respuestas en relacin con patrones de reconocida solvencia o a partir de la participacin de ejercicios de intercomparacin entre laboratorios. Respecto los materiales de referencia para la calibracin de Espectrofotmetros de Absorcin Atmica debe indicarse que en la actualidad son asequibles en distintas fuentes patrones (mono o multielementales) con la suficiente trazabilidad. Cabe sealar, por otra parte, que la concentracin de dichos patrones suele ser elevada (tpicamente de 1000 mg/L) y que, por tanto, el usuario deber efectuar diluciones de los mismos para poderlos emplear en las correspondientes calibraciones del equipo, debindose extremar en dicho paso las precauciones tanto materiales (empleando materiales volumtricos y/o gravimtricos calibrados, utilizando agua y reactivos exentos de impurezas) como operativas (encargando dicha actividad a personal cualificado). Los equipos y materiales necesarios para la realizacin de la calibracin de los equipos de Espectrofotometra de Absorcin Atmica se presentan en el listado siguiente: Espectrofotmetro de AA. Equipos auxiliares (inyector automtico, generador de hidruros). Fuente de radiacin apropiada (lmpara del elemento objeto de la calibracin).

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Gases necesarios: Para sistemas de atomizacin por llama: acetileno + aire (u xido nitroso). Para sistemas de atomizacin electrotrmica: argn. Sistema de aporte de muestra: Manual. Automtica. Inyector de flujo segmentado (FIAS). Generador qumico de vapores. Sistema de atomizacin: Por llama acetileno y aire (o acetileno y xido nitroso). Electrotrmica. Tubos de grafito para atomizacin electrotrmica. Equipos volumtricos necesarios, calibrados. Materiales de referencia: Distintas disoluciones (siempre en nmero superior a 3, y ms conveniente 5) de un material de referencia certificado conteniendo concentraciones conocidas del elemento en un medio apropiado (por ejemplo disolucin acuosa de cido ntrico M mol/L). Las concentraciones de dichas disoluciones abarcarn lo ms extensamente posible el rango lineal de determinacin del elemento. Reactivos: Agua doblemente desionizada (exenta de metales). cidos (exentos de metales). Modificadores de matriz (como: nitrato de lantano, nitrato de paladio, nitrato de magnesio). Reactivos para la generacin qumica de vapores (como: tetrahidruro de boro y sodio, cloruro de estao (II)).

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Manual/es de instrucciones o procedimiento/s de mantenimiento de los equipos, sus partes y/o accesorios. Otros materiales auxiliares: Material volumtrico: Matraces de clase A. Pipetas de clase A. Microjeringas. Cpsulas o viales portamuestras. Recipientes. Balanza analtica. Sistemas de filtracin. Reactivos. 5.2. Operaciones previas y puesta en marcha del equipo

uso

Antes de iniciar la calibracin se realizarn las siguientes operaciones previas: 5.2.1. Con el objeto que la persona que realice la calibracin est familiarizada con el manejo del equipo, se comprobar la disponibilidad del manual de instrucciones del fabricante y, si lo hubiera, del procedimiento de uso y/o mantenimiento del mismo. 5.2.2. Aunque, dadas las caractersticas constructivas y funcionales de los Espectrofotmetros de Absorcin Atmica, las condiciones ambientales (si no son extremas) no afectan en principio al funcionamiento de dichos equipos y, por ende, al resultado de la calibracin, dicho proceso deber procurar realizarse manteniendo una temperatura ambiente comprendida entre 15 C y 30 C que es el margen normal de tolerancia en el que, segn los fabricantes, los equipos de Espectrofotometra de Absorcin Atmica mantienen sus especificaciones. NOTA En el planteamiento del presente procedimiento puede considerarse que la temperatura no ejerce una influencia significativa sobre el resultado de la calibracin. Sin embargo, cuando figuren operaciones

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de pesada y/o dilucin, la temperatura puede contribuir de forma apreciable en la incertidumbre del resultado correspondiente. 5.2.3. Se comprobar que el Espectrofotmetro de Absorcin Atmica y los accesorios correspondientes estn conectados a una base de enchufe que incluya un conductor de proteccin o toma de tierra. Para la realizacin de la calibracin previamente habr que efectuar una serie de operaciones, tales como: 5.2.4. Especificacin de las condiciones experimentales: Debern especificarse directamente o comprobar que estn perfectamente especificados los aspectos (listados a continuacin), y mediante referencias cruzadas a: Manual/es de instrucciones (o uso) del equipo, sus partes y/o accesorios. Procedimiento normalizado de trabajo concerniente al ensayo al que aplica la calibracin correspondiente. Otros documentos (normas, referencias bibliogrficas con solvencia tcnica reconocida...). Siendo los aspectos: Elemento. Longitud de onda. Amplitud de rendija. Modo de trabajo (absorcin o emisin). Tipo de tratamiento y/o sistema de transferencia de muestras. Naturaleza, pureza y caudales de los gases. Tipo de mechero (en funcin del comburente). Naturaleza y composicin de los patrones de calibracin. Naturaleza y pureza de los modificadores de matriz (si aplica).

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Concentracin (y modo de preparacin) de las disoluciones de los modificadores de matriz. Naturaleza y pureza de los reactivos de generacin qumica de vapores (si aplica). Concentracin (y modo de preparacin) de las disoluciones de los modificadores de matriz. Condiciones de la introduccin de muestras y otros reactivos o modificadores (si aplica). Programa de atomizacin (si sta es electrotrmica), programa de generacin qumica de vapores (si aplica) Modo de recogida y tratamiento de datos de las medidas. Criterio de aceptacin del resultado de la calibracin. Criterios auxiliares sobre frecuencia de ensayos de blancos, repeticiones, muestras de control
NOTA Tngase en cuenta que muchas de las especificaciones y condiciones que se indican en los apartados siguientes estarn descritas en los Manual/es de instrucciones o procedimiento/s de uso y mantenimiento de los equipos, sus partes y/o accesorios y/o tambin en los procedimientos de ensayo correspondientes, normas

NOTA Tngase en cuenta, como se ha comentado anteriormente, que cuando se aplica el resultado de la calibracin en la cuantificacin de muestras reales, para poder garantizar la efectividad operativa, tanto los patrones de calibracin como las muestras (o sus extractos finales) han de presentar una matriz lo ms coincidente posible y tambin han de haber sido sometidos al mismo tipo de tratamiento de atomizacin y/o manipulacin. Dadas las numerosas variantes posibles, en el presente procedimiento no se contempla el aspecto relativo al tratamiento de las muestras y materiales de referencia, circunscribindose al caso de la calibracin por anlisis directo de patrones.

5.2.5. Comprobar la disponibilidad de la lmpara del elemento correspondiente. 5.2.6. Comprobar la disponibilidad y vigencia de los materiales de referencia apropiados, cuyas caractersticas de trazabilidad (origen,

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concentracin, incertidumbre, caducidad,) deben estar bien determinadas y reflejadas en los correspondientes certificados (los cuales han de ser accesibles al operador). Tambin debe disponerse de reactivos y agua exentos de los eventuales elementos susceptibles de interferir con la calibracin a efectuar. 5.2.7. Comprobar la disponibilidad de todo el material volumtrico necesario para preparar las diluciones de los patrones a utilizar en la calibracin (recomendndose para ello el uso de material volumtrico de Clase A) y, adems, debe disponerse de la seguridad que dicho material presenta el suficiente grado de limpieza (por ejemplo lavado previamente con una disolucin de cido ntrico 0,1 mol/L) para evitar posibles interferencias espurias que pudieran desvirtuar la calibracin. 5.2.8. Comprobar en los indicadores de presin de las botellas de los gases correspondientes (combustible, oxidante o purga) que existen suficientes reservas de cada uno de los que deban utilizarse con el equipo para llevar a cabo la presente calibracin y anlisis de la posterior secuencia de muestras. 5.2.9. Comprobar que se hallan efectivamente instalados y conectados correctamente los dispositivos de tratamiento de muestras y de atomizacin (por ejemplo la presencia del mechero de llama correspondiente, el generador de hidruros) que sean necesarios para la determinacin del elemento objeto de estudio en las condiciones prefijadas en el apartado 5.2.4. y que figuran en el manual de instrucciones (o uso) del equipo, sus partes y/o accesorios u otro documento donde figuren especificaciones u otra informacin de inters. NOTA En caso concreto de trabajo mediante atomizacin por llama, comprobar especficamente que el mechero instalado corresponde al tipo de llama apropiado (aireacetilnica u xido nitroso-acetilnica). NOTA En caso de trabajo mediante atomizacin electrotrmica, para realizar la calibracin, se recomienda comprobar visualmente la ausencia de envejecimiento (o deterioro) del tubo de grafito.

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Una vez realizadas las comprobaciones indicadas anteriormente se proceder a la puesta en marcha el equipo NOTA En el presente apartado se describen las operaciones como si fueran a realizarse de modo manual pero debe considerarse que en los modernos Espectrofotmetros de Absorcin Atmica varias (o todas) de las operaciones que se describen a continuacin pueden realizarse automticamente mediante la ejecucin de rutinas del programa de gestin y control del equipo. Tngase en cuenta tambin que, en muchos de los equipos actuales, se realizan automticamente una serie de comprobaciones iniciales sobre las prestaciones de los distintos componentes significativos y, en caso de resultar insuficientes, a veces no es posible continuar con la secuencia analtica hasta la resolucin del problema causante de la anomala operativa detectada. Adems, en algunos casos, los programas correspondientes disponen de utilidades que verifican la optimizacin de las distintas condiciones de trabajo. NOTA MUY IMPORTANTE El analista deber conocer perfectamente todos los factores de riesgo asociados tanto al uso del equipo como a la manipulacin de gases, reactivos, patrones y muestras y comprobar que se aplican todas las medidas de seguridad e higiene pertinentes. 5.2.10. Conectar a la red el equipo, sus partes y/o accesorios y dejar transcurrir unos 15-30 minutos para permitir un calentamiento homogneo de las partes electrnicas. 5.2.11. Conectar la aspiracin del extractor de aire (normalmente estar instalado en conexin con una campana). ambiente

5.2.12. Seleccionar la lmpara del elemento correspondiente, ubicarla en la posicin de trabajo y comprobar, siguiendo las instrucciones del fabricante, su correcto alineamiento fsico. NOTA En los equipos ms modernos esta operacin se realiza de forma automtica.

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5.2.13. Seleccionar la intensidad media de corriente de la lmpara tal como se describe en el manual de instrucciones (o uso) del equipo u otro documento donde figuren especificaciones o informacin de inters. 5.2.14. Ajustar las presiones apropiadas en los manorreductores de las botellas de gases (y, si ha lugar, en los puestos de gases intermedios) 5.2.15. Ajustar (o programar) los caudales de los gases a las condiciones de trabajo adecuadas al elemento objeto de la calibracin, teniendo en cuenta las caractersticas especficas de la fuente de atomizacin tal como se describe en el manual de instrucciones (o uso) del equipo. 5.2.16. Encender la llama, si se trabaja en dicho modo de atomizacin tal como se describe en el manual de instrucciones (o uso) del equipo. 5.2.17. Seleccionar la anchura de rendija adecuada tal como se describe en el manual de instrucciones (o uso) del equipo u otro documento donde figure dicha especificacin. 5.2.18. Seleccionar la longitud de onda correspondiente tal como se describe en el manual de instrucciones (o uso) del equipo, tal como se describe en el manual de instrucciones (o uso) del equipo u otro documento donde figure dicha especificacin. 5.2.19. Ajustar la ganancia tal que el indicador est situado en la parte central de la escala de medida de dicha magnitud, tal como se describe en el manual de instrucciones (o uso) del equipo. 5.2.20. Tal como se describe en el manual de instrucciones (o uso) del equipo, efectuar un ajuste fino de la longitud de onda para obtener la mxima indicacin del dispositivo de medicin de la energa, tendiendo en cuenta que, si se sobrepasa el lmite superior del intervalo admisible de trabajo, deber graduarse convenientemente la ganancia. 5.2.21. Tal como se describe en el manual de instrucciones (o uso) del equipo, verificar el correcto alineamiento ptico de la lmpara,

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disminuyendo el nivel de la ganancia, si fuera preciso, hasta situarlo en la zona ptima de trabajo. 5.3. Determinacin experimental de la curva de calibracin 5.3.1. Seleccionar el modo en que deba efectuarse la medicin de la seal por parte del equipo (bien sea por alturas o por integracin de reas). Fijar tambin el valor apropiado del tiempo de medida de dicha seal. 5.3.2. Seleccionar una opcin de presentacin de los datos de las respuestas del equipo que corresponda a (o incluya) la informacin sobre los valores de las absorbancias medidas. 5.3.3. En caso de trabajo con Espectrofotmetros de Absorcin Atmica con Cmara de Grafito, programar los parmetros de las distintas etapas del ciclo analtico, adems de otras condiciones operativas especficas. NOTA En este paso deber seleccionarse tambin el orden de los patrones, blancos y de las muestras, se escoger si se efectuarn repeticiones, la eventual adicin automtica de modificadores de matriz, la intercalacin de patrones de control de calidad y/o blancos entre la secuencia de muestras de ensayo, la activacin del dispositivo de correccin de fondo 5.3.4. Para comprobar el buen funcionamiento del equipo y la limpieza de sus partes se analizar un patrn del blanco, constituido por una alcuota del mismo disolvente que el resto de los patrones de calibracin conteniendo, adems, los mismos reactivos que presentarn las muestras (o sus extractos) y los patrones de calibracin. Posteriormente, segn se describe en 5.3.7, se efectuar la correspondiente correccin del cero. NOTA En los equipos ms modernos se memoriza la seal relativa al ensayo del blanco y dicha correccin se efecta automticamente.

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5.3.5. Comprobar el correcto funcionamiento tanto de la aspiracin como del drenaje (en caso de trabajo con atomizacin por llama) o bien de la correcta introduccin de la muestra en el tubo de grafito (cuando se emplee la opcin de atomizacin electrotrmica). NOTA Tngase en cuenta que debern extremarse las precauciones de limpieza de la cmara de atomizacin, bien sea manteniendo constantemente la aspiracin durante los lapsos entre las lecturas de los distintos patrones de calibracin (para el caso de atomizacin por llama) o, con el fin de eliminar el efecto memoria en caso de atomizacin electrotrmica, realizando anlisis peridicos de blancos intercalados entre la secuencia de dichos patrones. 5.3.6. Para verificar el correcto funcionamiento del equipo se analizar un patrn cuya concentracin sea intermedia respecto el intervalo de calibracin del elemento en estudio y cuya absorbancia, en las condiciones de trabajo ptimas, sea conocida (a menudo dicho valor est indicado en las instrucciones del equipo o bien el operador lo conocer por propia experiencia). En caso de no obtenerse la absorbancia prevista, procdase al reajuste de la posicin del mechero y, eventualmente, a una nueva comprobacin y/o ajuste de la energa y de la ganancia. NOTA En los manuales de los equipos de Espectrofotometra de Absorcin Atmica suele incluirse informacin precisa sobre la realizacin de la verificacin comentada ms arriba. Cabe sealar que a menudo dicha operacin se realiza en base a la denominada concentracin caracterstica (o masa caracterstica) que corresponde a la concentracin (o masa) del analito que proporciona una absorbancia determinada (generalmente se fija dicho valor en 0,004 4 u.a.). 5.3.7. Analizar un nuevo blanco y ajustar el cero. 5.3.8. A continuacin, sin variar ya las condiciones experimentales prefijadas en las etapas previas, se determina la funcin de respuesta del equipo para el elemento dado. As, se analizar el primer patrn de calibracin, obtenindose la absorbancia (hasta lectura estable en caso

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de emplearse atomizacin por llama), cuyo dato se almacenar en el correspondiente sistema de registro. Tngase en cuenta que la lectura del patrn a veces se realiza de forma mltiple. Al respecto deber disponerse de un registro de los pares experimentales absorbancia/concentracin y posteriormente, de forma automtica (en los equipos que estn dotados de un sistema de gestin de datos) o bien mediante la realizacin de dicho clculo aparte, se determinarn los promedios correspondientes. NOTA Es recomendable efectuar una lectura mltiple de la absorbancia de cada patrn (por ejemplo x3) y determinar el promedio de las absorbancias medidas. 5.3.9. La operacin descrita en el punto anterior ir repitindose con el resto de los patrones (como mnimo 3, siendo ms aconsejable de 5 a 7) del elemento objeto de la calibracin, abarcando todo el rango correspondiente a dicho elemento. 5.3.10. Una vez realizadas las mediciones experimentales, se determinarn, mediante un mtodo de ajuste estadstico tal como se describe posteriormente, los parmetros de la curva de calibracin incluyendo los intervalos de confianza de la misma (vase al respecto los distintos epgrafes del apartado 5.5 del presente procedimiento donde se exponen los detalles especficos de dicho ajuste). 5.3.11. Dado que durante las operaciones de preparacin y puesta en marcha se realizan distintos ajustes (descritos en los apartados anteriores), la calibracin para cada elemento deber realizarse previamente a cada sesin de anlisis y, adems, siempre que se realice algn ajuste suplementario o cuando los resultados del programa de control de calidad analtica (normalmente planteado en base a la intercalacin entre muestras de blancos, duplicados y/o muestras de control) lo requiera.

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5.4. Toma de datos En relacin a los procesos de calibracin de equipos, para garantizar la trazabilidad de las medidas realizadas con los mismos, resulta necesario registrar y evaluar las actividades llevadas a cabo, adems de los resultados obtenidos. Para ello es conveniente disponer de formatos de registro (de tipo manual o en base informatizada) donde, como mnimo, se registrarn los siguientes datos: Elemento objeto de la calibracin. Absorbancias y/o concentraciones. Clculos concernientes al ajuste de la recta de calibracin. Clculos concernientes a la incertidumbre asociada a la calibracin. Validacin de la calibracin. Fecha. Hora. Analista. Adems es conveniente registrar cualquier otro dato secundario (incluidas las condiciones ambientales) o circunstancial que permita asegurar la trazabilidad de todo el proceso 5.5. Tratamiento de datos: determinacin y estipulacin de la curva de calibracin La calibracin de un equipo de Espectrofotometra de Absorcin Atmica para un elemento determinado, en unas condiciones experimentales dadas, constituye un ejemplo tpico de calibracin indirecta, por la cual la seal proporcionada por el equipo (absorbancia) tiene una naturaleza distinta a la concerniente al elemento en el patrn (concentracin). Por

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tanto, el objeto de la calibracin consistir en la determinacin de la funcin magnitud del patrn/respuesta del equipo. Cabe sealar, por otra parte, que la aplicabilidad de la ley de Beer-Lambert para la presente tcnica analtica, indica que la relacin expresada por la funcin absorbancia/concentracin ser lineal, no obstante, hay que tener en cuenta que, dadas las influencias de distintos factores (tanto instrumentales como operativos), la distribucin ms representativa de los pares absorbancia/concentracin obtenidos en el proceso de calibracin deber determinarse mediante ajustes estadsticos ms o menos convencionales. Dado que la funcin de calibracin (que relaciona las absorbancias medidas por el equipo de Espectrofotometra de Absorcin Atmica con las concentraciones del analito en los distintos patrones de calibracin) puede expresarse como una curva de la cul el tramo que incluye el intervalo de menores concentraciones por encima del lmite de cuantificacin suele ser de tipo rectilneo y puesto que la calibracin puede realizarse contemplando solamente el tramo de linealidad estricta (tramo recto representativo de una recta de regresin de absorbancias respecto concentraciones) o en un rango ms amplio (ajuste curvilneo por una regresin de tipo polinmico, cuyos grados generalmente estarn comprendidos entre 2 y 4), en el presente apartado se considerarn y se compararn ambas situaciones, teniendo en cuenta que, para simplificar, se considerar que las varianzas resultan ser constantes a lo largo de la curva de calibracin correspondiente.
NOTA Cabe sealar que el planteamiento que se presenta a continuacin est basado en el ajuste y tratamiento de la funcin de calibracin mediante mtodos de regresin. Dada la anterior premisa, en sentido estricto debera verificarse que, por una parte, las absorbancias medidas en el Espectrofotmetro de Absorcin Atmica son directamente proporcionales a la concentracin de los patrones de calibracin (a lo largo del rango considerado) y, por otra, que las incertidumbres concernientes a las concentraciones del elemento en dichos patrones son significativamente menores que el error cometido en la medicin de las variables dependientes (absorbancias) y en consecuencia despreciables frente a stas. Por tanto, la metodologa que se expone a continuacin (que resulta ser la ms utilizada) supone meramente una aproximacin a la situacin real.

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5.5.1. Estimacin de los parmetros de la recta de calibracin Introduccin Sea la recta de regresin calculada por la expresin: y = a + bx Donde: x: concentraciones de los patrones de calibracin empleados. y: lecturas de absorbancias (corregidas para el blanco). a: ordenada en el origen de la recta de calibracin. b: pendiente de la recta de calibracin. La estimacin de a y b se obtiene en base a forzar que sea mnima la suma de los cuadrados de las desviaciones (yi yi) entre los valores experimentales yi y las ordenadas correspondientes yi de la recta de regresin calculada. Si p es el nmero de magnitudes de referencia (patrones de concentracin distinta) y ni el nmero de resultados (absorbancias medidas por el equipo) para una determinada magnitud i (i=1,2,,p), dichos resultados se designan por yi (=1,2,,ni). Por lo tanto, el nmero total de pares concentracin/absorbancia (xi,yi) ser: (1)

N = n i
La pendiente b ser de la forma:

(2)

b=

W 1y W 11

(3)

Donde los residuales W1y y W11 , respectivamente, son:


W 1y = ( x i x )( y i y ) = x i y i
i

( n i x i )( y i )
i

(4)

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W 11 = n i x i x
i

) =
2

2 ni x i

( ni x i )
N

(5)

NOTA Aunque en el presente desarrollo terico del tratamiento del ajuste de regresin de la funcin de calibracin se considera el caso general de que las mediciones de cada patrn pueden ser mltiples, stas expresiones (y las siguientes), obviamente, se simplifican notablemente cuando ni =1. Las medias aritmticas de xi e yi se calculan, respectivamente, a partir de:

=
i

ni x i N

(6)

y =

y i

(7)

Y, por otra parte, la ordenada en el origen de la recta de calibracin se calcula a partir de la aplicacin de la siguiente expresin:
a = y bx = 1 y i b n i x i N i

(8)

La estimacin de la varianza de los residuos (tambin denominada varianza residual) puede realizarse en base al cuadrado de la desviacin tpica:

s2 =

Q N 2

(9)

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Donde N es el nmero total de mediciones realizadas en el transcurso de la calibracin, mientras Q expresa la dispersin de los puntos experimentales alrededor de la recta de regresin calculada. Dicho parmetro, a nivel prctico, se determina mediante la siguiente expresin:

Q = W yy b W 11 = W yy
2

(W )
1y

W 11

(10)

Siendo, por otra parte, el residual Wyy:

W yy =
i

y i 2 2 i y i y = y i N i

(11)

En este punto cabe considerar que la pendiente de la recta de regresin presenta una varianza igual a:

2 = b

2
W 11

(12)

Cabe considerar que b2, en ausencia de datos proporcionados por la experiencia a largo plazo, ser reemplazable en la frmula anterior por el valor calculado del cuadrado de la desviacin tpica sb2 (segn 9). As, el valor de la varianza de la pendiente de la recta de calibracin podr calcularse por:
s2 = 2 sb = W 11 s2

ni (x i x )

(13)

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Por otra parte, la varianza de la ordenada en el origen a de la recta y la covarianza de a y b (pendiente), respectivamente, sern:
1 x2 2 a = 2 + x 2 2 = 2 + b y n W 11 x 2 Cov (a, b ) = x 2 2 = b W 11

(14)

(15)

5.5.2. Determinacin de los intervalos de confianza de la recta de calibracin En el caso en que la varianza sea constante respecto el dominio de las abscisas (concentraciones). NOTA. Tngase en cuenta que la premisa de que la varianza ser constante (respecto al dominio de abscisas) a lo largo de la recta de calibracin. En sentido estricto, dejar de cumplirse normalmente para niveles de concentracin prximos al lmite de cuantificacin y para niveles prximos al extremo superior del rango lineal. Por lo tanto, debern extremarse las precauciones para la definicin de un rango lineal til de trabajo. NOTA Cabe tener en cuenta que distintos programas de estadstica y hojas de clculo de uso comn permiten el clculo de los distintos parmetros significativos y los intervalos de confianza de la recta de regresin. Es importante sealar que el operador deber estar familiarizado con el uso de dichos programas y establecer alguna estrategia para la validacin de las hojas de clculo correspondientes. A continuacin se expone el mtodo, paso a paso, para la determinacin de dichos intervalos. A partir de la aplicacin de distintas frmulas del apartado 5.5.1 se determinan, con N-2 grados de libertad, los siguientes parmetros:
x , b,

n i (x i x )

y tambin s 2

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El intervalo de confianza del resultado de una medida experimental de la absorbancia, m0 (que en este caso se considera constante) que corresponde a una concentracin x0, calculada mediante la recta de regresin, depender de la estimacin de stot que se calcula a partir de la expresin:
s b 1 n0 1 + N

s tot

(x 0 x ) 2 ni (x i x )
2

(16)

Donde n0 es el nmero de ensayos que han proporcionado la medida (absorbancia en el presente caso) y el resto de parmetros se ha definido anteriormente en el apartado 5.5.1. La expresin del intervalo de confianza de la medida con un nivel de confianza (1- ) es de la forma:
x 0 t 1 s tot
2

7)

Donde:

x0: valor de x calculado a partir de la recta de calibracin. t: se obtiene de la tabla del test de Student, para un nivel de confianza del 95 %, con N-2 grados de libertad.

6. CLCULO DE LA INCERTIDUMBRE ASOCIADA A LA CALIBRACIN Hay que tener en cuenta que las fuentes principales de incertidumbre que se presentan en la calibracin de un equipo de Espectrofotometra de Absorcin Atmica son: Variaciones aleatorias de las medidas experimentales concernientes tanto a los patrones como a las muestras. Errores aleatorios en la asignacin de la concentracin de los patrones empleados en la obtencin de la curva de calibracin.

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Errores sistemticos asignables tanto a la concentracin de los patrones como a las medidas experimentales. Desviaciones apreciables de la linealidad correspondiente. En relacin a los cuatro factores enumerados, debe destacar que el que posee mayor significacin es el primero de ellos. As, la determinacin de la incertidumbre asociada al clculo de las concentraciones mediante interpolacin sobre la curva de calibracin (ajustada segn una recta de regresin), considerando como principal factor de contribucin la variabilidad aleatoria de las medidas experimentales, se efecta tal como se describe a continuacin. Sea la recta de calibracin:

y =a x + b
Sobre la base de lo expuesto en el prrafo anterior, la varianza Sx puede estimarse mediante la siguiente expresin:
Sx = s2 b2

(18)

donde b es la pendiente de la recta de regresin (que se calcular a partir de las frmulas 3-5 de 5.5.1) y S2 es la varianza de los valores de y respecto a la recta de regresin que puede calcularse segn:

(y y ) =
i

N 2

(19)

Representando yi y el residual de la isima medida efectuada en el desarrollo de la calibracin


u (c o )

que corresponde a la contribucin de la calibracin a la

incertidumbre global del proceso analtico, puede calcularse (segn las referencias 5 y 7) por aplicacin de la siguiente expresin:

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s u (c o ) = b

c o c 1 1 + + p n W 11

(20)

donde:

s= b= p= n= CO = c =

Vase la frmula 21 (expuesta a continuacin). Pendiente de la recta de calibracin. n de medidas de la muestra cuya concentracin ha sido CO. n de medidas realizadas para la calibracin. valor de concentracin determinado en la muestra. Valor promedio de la concentracin de los patrones empleados en la calibracin. i= Indicativo del n de patrn de calibracin. j= Indicativo del n de medidas para la realizacin de la curva de calibracin. W11 = Residual (calculado segn la frmula 5 de 5.5.1).

[A j (a + b c j )]
n

s=

j =1

n2

(21)

donde: Aj = jsima medida de la absorbancia del isimo patrn de calibracin a = Ordenada en el origen (calculada segn la frmula 6 de 5.5.1)
NOTA Hay que tener en cuenta que la expresin anterior coincide con la expuesta en la frmula 16 del apartado 5.5.2

Otra forma de abordar el clculo de u (c o ) consiste en considerar que los resultados se obtienen por interpolacin sobre la recta de calibracin y = bx + a, cuyos parmetros se han calculado segn las expresiones de 5.5.1. De la ecuacin de la recta se despeja la variable x, quedando:

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x=

y b a

(22)

u (c o ) puede determinarse a partir de la siguiente expresin general:

u co =

()

x 2 2 x 2 x 2 uy + ua + u y a b b

(23)

quedando la expresin de clculo de u (c o ) :


u2 y
2 y a ub u2 + a+ b2 b2 b4

u co =

(24) donde:

uy = w

sy n sb n sa n

(25)

ub = w ua = w

(26)

(27)

Sa puede calcularse como:


sa = W yy b W 11 N 2
2

( x ) N
x2 i
i

(28)

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obtenindose los factores multiplicativos w (que figuran en las expresiones anteriores) a partir de la Tabla siguiente:
N de mediciones 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (o ms) w 7.0 2.3 1.7 1.4 1.3 1.3 1.2 1.2 1

Tabla I. Valores de w (factor multiplicador) en funcin del nmero de lecturas realizadas


NOTA Hasta aqu se han excluido las contribuciones derivadas de la dilucin de patrones madre para obtener las disoluciones con las que se efecta la calibracin, derivas de respuesta del equipo (tngase en cuenta que se ha indicado el requisito de una calibracin por sesin analtica) y otras contribuciones menores.

Para el clculo de la incertidumbre combinada en relacin a un ensayo que culmina con la determinacin de un elemento en un extracto de una muestra mediante Espectrofotometra de Absorcin Atmica, debern tenerse en cuenta distintos componentes como: Incertidumbres asociadas al muestreo y pretratamiento de muestras (incluyendo el acondicionamiento, la homogeneizacin y el submuestreo correspondiente,). Incertidumbre asociada al tratamiento de muestras (incluyendo extraccin, digestin, diluciones,).

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NOTA Debe tenerse en cuenta que la metodologa para determinar dichas incertidumbres, cuyo clculo se aparta del objeto del presente procedimiento, deber detallarse en otros procedimientos ad-hoc.

A partir de las incertidumbres individuales cuya contribucin sea significativa en cada caso se calcular la incertidumbre estndar del resultado. As, si r es el resultado final de un elemento dado (sobre la muestra), determinado a partir del anlisis mediante Espectrofotometra de Absorcin Atmica de un extracto proveniente de la muestra (cuya concentracin co se ha obtenido a partir de la interpolacin en la correspondiente calibracin), dicha incertidumbre u(r) puede calcularse combinando, segn los procedimientos habituales, la incertidumbre u (c o ) con las de los factores asociables a las operaciones realizadas sobre la muestra (y sus fracciones, o fraciones, o subfracciones) que contribuyan significativamente a la incertidumbre del resultado final. Para abordar la combinacin de u (c o ) (calculada segn 20, 21 o 24) con otras contribuciones (de tipo B) que eventualmente pudieran ser significativas se proceder a calcular u(r):
2 u r = u co + u l2 l =1 q

(29)

donde el trmino

u l2
l =1

representa la contribucin de las incertidumbres

de tipo B (tales como las de los patrones, operaciones del tratamiento de muestras). La incertidumbre expandida U(r) del resultado correspondiente se calcular multiplicando la incertidumbre calculada u(r) (segn la expresin 29, expuesta anteriormente) por un factor k de cobertura (por ejemplo k=2, para un nivel de confianza del 95 %). El resultado final se presentar como:

r U(r) (unidades)
para un factor de cobertura k=2 (o con un nivel de confianza del 95 %).

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7. REFERENCIAS
[1] Vocabulario Internacional de Metrologa. Conceptos fundamentales y generales, y trminos asociados (VIM). 3 edicin en espaol 2008. Gua para la Expresin de la Incertidumbre de Medida. CEM. Segunda edicin en espaol, 2000. Gua EA-4/02. Expression of the Uncertainty of Measurement in Calibration. Diciembre 1999. EA. M. Neully et CETAMA. Modlisation et estimation des erreurs de mesure (2e Ed.). Lavoisier, 1998. Pritchard E. Quality in Analytical Chemistry Laboratory. ACOL-J.Wiley, 1995. Quantifying Uncertainty in Eurachem/CITAC Guide (2000). Analytical Measurement (2nd. Ed.).

[2] [3]

[4]

[5] [6]

[7]

B. Weltz y M. Sperling. Atomic Absortion Spectrometry. Ed. Wiley-VCH. Wenheim, 1999. J.C. Miller y J.N. Miller. Estadstica para Qumica Analtica. Ed. 2. AddisonWesley Iberoamericana, 1993. J. Mandel. The Statistical Analysis of Experimental Data. Dover Publishers, 1984.

[8]

[9]

[10] G. Kateman y L. Buydens. Quality Control in Analytical Chemistry. WileyInterscience Eds., 1993. Otros documentos complementarios [11] Manual/es de instrucciones (o de uso) del equipo de Espectrofotometra de Absorcin Atmica, de sus partes y/o accesorios. [12] Procedimientos de ensayo a los que aplica la calibracin de equipos de Espectrofotometra de Absorcin Atmica. [13] Otros procedimientos de calibracin.

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8.

ANEXOS

Se describe en un anexo el ajuste por regresin polinmica.

ANEXO: Ajuste por regresin polinmica Introduccin Este anexo trata sobre la estrategia de tratamiento de los datos experimentales de calibracin y abarca el caso del ajuste mediante la recta de regresin, discutido anteriormente. Tngase en cuenta que, a menudo, las funciones de calibracin en Espectrofotometra de Absorcin Atmica presentan un tramo correspondiente al intervalo de concentraciones desde el lmite de cuantificacin hasta el lmite de respuesta lineal que puede ajustarse por una recta, mientras que, a partir de dicho lmite, la funcin de calibracin se ajusta por una curva. Otra estrategia alternativa, utilizada muy frecuentemente, se deriva de la posibilidad de realizar un ajuste global mediante una nica curva polinmica (de grado 2, 3, 4...), tal como se describe a continuacin. Por ltimo, y ya fuera del objetivo del presente documento, tambin cabe indicar la posibilidad de subdividir la curva de calibracin en tramos ajustables por distintas funciones polinmicas (usualmente, a efectos prcticos, con grados comprendidos entre 1 y 3) En relacin al ajuste de una curva de calibracin mediante una ecuacin polinmica, en primer lugar se plantea la ecuacin correspondiente:

y = a + bx +cx2 + dx3 +
Donde b, c, d son los coeficientes de regresin de la curva calculada.

(30)

Debe considerarse que la ordenada en el origen a de la curva se obtiene a partir de los datos c, d,, de tal modo que:
a= 10 1 2 2 y i b ni x i c ni x i ... = zi bk ni t i c k ni t i ... (31) N i N i

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Cabe tener en cuenta que, como se aprecia en las anteriores expresiones, se ha efectuado un cambio de variables tal que zi =10 yi y ti =10 xi Los correspondientes coeficientes de regresin de los ajustes polinmicos se calculan a partir de aproximaciones sucesivas. As, se calcula en primer lugar la pendiente b1 y la suma de los cuadrados de los residuos (Q1) concernientes a una relacin tericamente lineal de primer grado (recta), despus se considera el ajuste mediante un polinomio de segundo grado, determinndose los coeficientes b2 y c2 (trminos de primer y segundo grado de la ecuacin de dicho tipo ajuste) y adems la suma de los cuadrados de los residuales Q2, verificndose un test de Snedecor-Fisher para comprobar la significacin del ajuste correspondiente a la ecuacin de segundo grado. En caso que el del test realizado para la ecuacin de segundo grado sea positivo se repite la operacin para ajustes polinmicos sucesivos de grado 3 y 4.
NOTA Al final de la exposicin del tratamiento que sigue a continuacin sobre el ajuste de la funcin de calibracin mediante una ecuacin de segundo grado se presenta el criterio de seleccin de la ecuacin que proporciona un ajuste ptimo de dicha funcin.

A continuacin se expone, a ttulo de ejemplo, la metodologa para la determinacin de los coeficientes de regresin para el caso de un ajuste con una curva de regresin de segundo grado:

y = a + bx + cx2

(32)

Se proceder, como se ha indicado anteriormente, por aproximaciones sucesivas. Si b1 es la pendiente de la terica recta de regresin (obtenida como primera aproximacin) cuya ecuacin puede escribirse como:

z = a1 + b1 t

(33)

Habindose efectuado un cambio de variables como el comentado anteriormente (zi =10 yi y ti =10 xi) se calculan, respectivamente, los residuales y parmetros siguientes mediante la aplicacin de las expresiones:

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W 11 = n i x i x
i

1 ) = n i x 2 N ( n i x i ) i
2

(34)

w 11 =

n i (t i t )

= 10 2 W 11

(35)

w jy = t ij z i
i

1 n i t ij z i N i i

(36)

w jj = n i t 2 j i

1 n i t ij N

(37)

Una vez calculados w11, w12, w22, w1y, w2y y wyy, a partir de la aplicacin de las frmulas anteriores, se determina la pendiente b1 y Q1, siendo: 1 j + j (38) w jj = n i t i n i t ij n i t ij N

)(

2 Q1 = w yy b1 w 11

(39)

b1 =

w 1y w 11

(40)

Si se considera ahora el caso del ajuste de la funcin de calibracin mediante la ecuacin de 2 grado del tipo:
z = a2 + b2 t + c 2 t 2

(41)

Se calcula, a partir de la siguiente frmula, el coeficiente de regresin para b2 ,el trmino de primer grado de dicha ecuacin:
b 2 = b1 c 2 w 12 w 11

(42)

A continuacin se calcula el determinante D2 mediante:

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2 D 2 = w 11w 22 w 12

(43)

Tambin se calculan c2 (trmino de grado 2 en la expresin de la curva de regresin), Q2, Q2 y 2: w 11w 2 y w 12 w 1y (44) c2 = D2
Q 2 = c 2 D2 2 w 11

(45) (46) (47)

Q 2 = Q1 Q2

2 = N-3
Determinndose la varianza s22 como sigue:
s2 = 2 Q2

(48)

En este punto puede plantearse la realizacin de un test de verificacin de la correccin del ajuste efectuado mediante el polinomio de 2 grado. Para ello se calcula la funcin discriminante de dicho test, F2:
F2 = Q 2 s2 2

(49)

Para poder decidir si se acepta el ajuste de la curva de calibracin con el polinomio de grado 2, se compara el valor de F2 calculado por aplicacin de la frmula anterior con el valor de F0,99(1;2) de la Tabla de SnedecorFisher. Si el valor de F2 supera al del lmite de confianza del test, entonces se infiere significacin del mismo y se acepta el correspondiente ajuste polinmico de grado 2 realizado. A continuacin, revertiendo el cambio de variables introducido anteriormente, se determinan los coeficientes de la curva de regresin

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inicial. As, a se calcula mediante la frmula anterior 8.2, mientras los coeficientes b y c se obtienen a partir de las siguientes expresiones:
b = 10 b 2 c = 10 2 c 2

(50) (51)

Por otra parte, tambin puede caracterizarse la incertidumbre en un punto de la curva de calibracin. As, la incertidumbre de las medidas de la calibracin proyectan sobre b2 y c2 varianzas estimables segn:

2 b2

s = w 22 2 D2
w 11 s 2 D2
2

(52)

sc 2 =
2

(53)

La covarianza de dichos errores se determina por:


Cov (b2 , c 2 ) = w 12 s 2 D2
2

(54)

La misma estrategia puede seguirse para el caso de ajustes de regresiones polinmicas de grado superior aunque normalmente, para evitar clculos muy complicados, no suelen aplicarse ms que hasta el caso de polinomios de grado 4.
NOTA Para estipular el tipo de ajuste ms representativo de una funcin de calibracin se escoger aquel que tenga mayor grado entre los que proporcionen resultados con significacin estadstica en base al test de Snedecor-Fisher.

Tambin puede determinarse la incertidumbre en un punto de una curva de calibracin estipulada a partir de una regresin polinmica de grado 2,

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expresada a travs de una estimacin de la varianza. Dicho clculo podr realizarse a partir de:

s'

2 z0

sk + 2 s 2 + 2 j j ' s jj ' j j N j =1 j j'


s' y 0 = 10
2

(55)

s' z 0

(56)

Con N-k-1 grados de libertad Para el caso del polinomio de grado 2 se determinan los siguientes parmetros estadsticos:

1 = 10 (x 0 x )

(57)

2 ni x 2 i = 102 x 0 2 N
y la varianza:
2 1 w 22 1 + w 11 2 2 w 12 1 2 2 s' 2 0 = 10 2 s 2 + 2 y N D2

(58)

(59)

Intervalos de confianza de la curva de regresin (en el caso en que la varianza sea constante) A continuacin, a ttulo de ejemplo, se expondr el procedimiento para la determinacin del intervalo de confianza (supuesto ste constante) de una curva de calibracin ajustada a una ecuacin de grado 3. Sea la curva ajustada por la expresin:
y = f (t ) = a + bt + c t 2 + d t 3

(60)

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(Habindose ya realizado el cambio de variable correspondiente entre t y x [donde t =102 x])

Tngase en cuenta que previamente se habrn determinado, respectivamente, s2, , , y (n de grados de libertad) y suponiendo que se han realizado n0 mediciones que han proporcionado una lectura promedio de yo. Se calcula t0 (para yo) a partir interpolacin sobre la curva de calibracin y a continuacin se determina tambin syo2 mediante la aplicacin de la expresin (56). A continuacin se calcula la desviacin tpica stot mediante:

s tot =

s2 + s 2 y0 f (t 0 ) n 0

(61)

Para un nivel de probabilidad del 95 %, el intervalo de confianza (supuesto constante) de la concentracin (en trminos de t) se estimar a partir de:
t 0 t 0,975 s tot

(62)

Restituyendo el cambio de variable de t a x, teniendo en cuenta la relacin entre t y x (que es funcin de ), se obtendr el valor real de la concentracin medida, as como el intervalo de confianza correspondiente.
NOTA Para el clculo de la incertidumbre asociada a la determinacin analtica correspondiente podrn aplicarse criterios homlogos a los expuestos en el apartado 6 anterior.

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